ES2300768T3 - Procedimiento para preparar particulas magneticas recubiertas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de partículas poliméricas recubiertas que contienen cristales superparamagnéticos, comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar partículas poliméricas que contienen cristales superparamagnéticos, funcionalizadas en la superficie, porosas con un diámetro de 0,5 a 1,8 µm con al menos un poliisocianato y al menos un diol.
Description
Procedimiento para preparar partículas
magnéticas recubiertas.
Esta invención se refiere a un procedimiento
para la preparación de partículas poliméricas magnéticas
recubiertas.
Las partículas poliméricas magnéticas son de
utilidad general en diversos campos médicos y bioquímicos, por
ejemplo como vehículos de transporte para la administración de
productos farmacéuticos, para fines de diagnóstico, para la
separación y para fines sintéticos. Tales partículas se basan en sus
propiedades magnéticas con el fin de realizar estas funciones. En
aplicaciones de ensayo diagnóstico, por ejemplo, la aplicación de un
campo magnético a una muestra que contiene un analito unido a
partículas poliméricas magnéticas permite el aislamiento del
analito sin usar centrifugación o filtración y en aplicaciones
terapéuticas, por ejemplo, la aplicación de un campo magnético al
paciente puede servir para dirigir partículas poliméricas magnéticas
que llevan fármaco a un sitio deseado del cuerpo.
Por magnético se hace referencia en el presente
documento a que las partículas poliméricas contienen cristales
superparamagnéticos. Por tanto, las partículas poliméricas
magnéticas pueden desplazarse magnéticamente pero no son
magnetizables de manera permanente. Se conocen muchos procedimientos
para preparar partículas poliméricas magnéticas, un gran número de
los cuales implica preparar partículas poliméricas que contienen
maghemita o magnetita a partir de óxidos de hierro magnéticos
preformados, por ejemplo, magnetita. Algunos de los procedimientos
implicados se describen en el documento
US-A-4.654.267 (Ugelstad).
Por tanto, el documento
US-A-4.654.267 expone varias
limitaciones con respecto a los procedimientos que lo preceden;
éstas incluyen la dificultad de obtener partículas magnéticas de
tamaño similar y/o de propiedades magnéticas homogéneas o
uniformes, así como un problema más general referente a la
dificultad de incorporar material magnético dentro de las cavidades
de partículas poliméricas porosas.
Teniendo lugar la deposición principalmente
sobre la superficie, o en grandes cavidades abiertas, la lixiviación
de partículas magnéticas, que acorta la vida útil de las partículas
poliméricas magnéticas en las aplicaciones para las que se
utilizan, era en consecuencia problemática.
Con el fin de superar estas desventajas, el
documento US-A-4.654.267 propuso un
método preparativo mediante el cual, en su forma más sencilla, se
impregnan partículas poliméricas porosas con disoluciones de
compuestos de hierro tras lo cual se precipita el hierro, por
ejemplo aumentando el valor de pH. Entonces pueden convertirse los
compuestos de hierro precipitado en cristales de óxido de hierro
superparamagnético mediante calentamiento.
Para producir partículas poliméricas magnéticas
porosas que tienen material magnético dispuesto dentro de los poros
de polímero, el documento
US-A-4.654.267 recomendó el uso de
partículas poliméricas porosas que tienen grupos funcionales en
superficie que sirven para atraer los iones de hierro al interior de
las partículas poliméricas. Estos grupos funcionales podían
resultar o bien del uso de comonómeros funcionalizados en la
producción del polímero o bien de tratamiento tras la polimerización
del polímero para introducir los grupos funcionales, por ejemplo
mediante acoplamiento a, o transformación de, grupos existentes en
la superficie del polímero.
Aunque la invención descrita en el documento
US-A-4.654.267 resuelve en parte el
problema de producir partículas poliméricas magnéticas que tienen
propiedades magnéticas más homogéneas, permanece el problema de la
lixiviación de los cristales superparamagnéticos de las partículas
poliméricas.
El documento WO89/04373 describe partículas
poliméricas magnéticamente sensibles recubiertas con una capa
protectora de polímero, preferiblemente poliestireno, para evitar
que se desprenda el óxido metálico.
Ahora se ha descubierto sorprendentemente que
para partículas de un cierto tamaño, puede resolverse este problema
y pueden producirse partículas magnéticas con características de
superficie particularmente adecuadas haciendo reaccionar partículas
poliméricas magnéticas funcionalizadas en la superficie con una
combinación de poliisocianato/diol para producir una partícula
polimérica magnética "recubierta".
La presente invención proporciona un
procedimiento para la preparación de partículas poliméricas
recubiertas que contienen cristales superparamagnéticos,
comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar partículas
poliméricas que contienen cristales superparamagnéticos,
funcionalizadas en la superficie, porosas, con un diámetro de 0,5 a
1,8 \mum, por ejemplo de 0,75 a 1,2 \mum, especialmente de
aproximadamente 1 \mum, con al menos un poliisocianato, por
ejemplo diisocianato, y al menos un, preferiblemente al menos dos,
dioles.
Dioles preferidos son polietilenglicoles o son
de fórmula HO((CH_{2})_{m}O)_{n}H (en la que n
es un número entero de 1 a 15, por ejemplo de 2 a 10,
preferiblemente de 2 a 4 y m es un número entero de 2 a 6,
preferiblemente de 2 a 3, lo más preferiblemente 2). Cuando sólo se
emplea un diol, éste es preferiblemente un polietilenglicol, por
ejemplo polietilenglicol 300, 400, 500 ó 600.
Las partículas poliméricas porosas usadas en el
procedimiento de la invención pueden ser cualquier polímero poroso
que tiene una superficie funcionalizada, por ejemplo tal como se
describe en el documento
US-A-4.654.267.
La funcionalidad en la superficie del polímero
es preferiblemente un grupo que puede, opcionalmente con activación,
reaccionar con un poliisocianato para unir covalentemente el
poliisocianato a la superficie. Lo más preferiblemente, la
superficie está funcionalizada con amina.
El polímero se prepara preferiblemente a partir
de combinaciones de polímeros vinílicos, por ejemplo estirenos,
acrilatos y/o metacrilatos. Puede reticularse opcionalmente el
material polimérico, por ejemplo mediante incorporación de agentes
de reticulación, por ejemplo como comonómeros, por ejemplo
divinilbenceno (DVB) o dimetacrilato de etilenglicol. Se prefieren
partículas que comprenden DVB.
El experto en la técnica conocerá bien las
cantidades apropiadas de los agentes de reticulación (por ejemplo
comonómeros) requeridos. Preferiblemente, el polímero es un polímero
estirénico reticulado (por ejemplo un polímero de
estireno-divinilbenceno, que puede funcionalizarse
en la superficie mediante el uso de un comonómero que contiene
grupo nitro, por ejemplo nitro-estireno, y posterior
reducción) o un polímero (met)acrílico reticulado
funcionalizado en la superficie mediante el uso de un comonómero que
contiene grupo epoxilo (por ejemplo metacrilato de glicidilo) y
posterior aminación (por ejemplo mediante reacción con
etilendiamina).
Los cristales superparamagnéticos en las
partículas poliméricas usadas en el procedimiento de la invención
pueden ser de cualquier material capaz de depositarse en forma
cristalina superparamagnética en las partículas poliméricas
porosas. Se prefieren óxidos de hierro magnéticos, por ejemplo
magnetita o maghemita; sin embargo los cristales pueden ser de
óxidos metálicos mixtos u otro material magnético si se desea. La
cantidad total de material magnético cristalino presente es
generalmente superior al 1%, preferiblemente superior al 3%,
deseablemente superior o igual al 5% (en peso, por ejemplo hasta el
40% en peso). El porcentaje se calcula basándose en el peso de Fe
(o metal equivalente en el caso de materiales magnéticos distintos
de óxidos de hierro) basándose en el peso seco total de las
partículas recubiertas.
Las partículas poliméricas según la presente
invención tendrán tamaños (es decir diámetros) que están
generalmente en el intervalo de 0,5 a 1,8 \mum, por ejemplo de
0,75 a 1,2 \mum, preferiblemente de 0,9 a 1,1 \mum.
Normalmente, las partículas porosas usadas
tendrán un área superficial de al menos 15 m^{2}/g (medido
mediante el método de absorción de nitrógeno BET), y más
preferiblemente de al menos 30 m^{2}/g, por ejemplo de hasta 700
m^{2}/g, cuando se corrige hasta un diámetro medio de partícula de
2,7 \mum (es decir, se multiplica el área superficial por 2,7/DM,
en el que DM es el diámetro medio en micrómetros). Con una escala
similar, el volumen del poro de partícula es preferiblemente de al
menos 0,1 ml/g.
Normalmente, las partículas poliméricas son
esféricas y sustancialmente monodispersas antes de recubrirse y de
manera especialmente preferible siguen siendo esféricas y
sustancialmente monodispersas después de haberse recubierto.
Por sustancialmente monodispersas se hace
referencia a que para una pluralidad de partículas (por ejemplo al
menos 100, más preferiblemente al menos 1000) las partículas tienen
un coeficiente de variación (CV) inferior al 20%, por ejemplo
inferior al 15%, preferiblemente inferior al 12%, más
preferiblemente inferior al 11%, todavía más preferiblemente
inferior al 10% y lo más preferiblemente no superior a
aproximadamente el 8%, por ejemplo del 2 al 5%. El CV se determina
en porcentaje como
CV = \frac{100
\ x \ desviación \
estándar}{media}
en la que la media es el diámetro
medio de partícula y la desviación estándar es la desviación
estándar en el tamaño de partícula. El CV se calcula preferiblemente
en el modo principal, es decir ajustando una curva de distribución
monomodal a la distribución de tamaño de partícula detectada. Por
tanto, algunas partículas por debajo o por encima del tamaño del
modo pueden no tenerse en cuenta en el cálculo que puede basarse por
ejemplo en aproximadamente el 90% del número total de partículas
(es decir, de partículas detectables). Una determinación de este
tipo del CV puede realizarse en un analizador de tamaño de partícula
Coulter LS
130.
Son de utilidad particular en la presente
invención las partículas poliméricas descritas en los documentos WO
99/19375 (Dyno Industrier ASA), WO 00/61648 (Dyno Specialty Polymers
AS) preparadas en parte a partir de aminoestireno tal como se
describe en el documento WO 01/70825.
Alternativamente, al contrario que la
descripción del documento WO01/70825, la funcionalización del
material polimérico puede tener lugar tras la polimerización
mediante, por ejemplo, nitración y posterior reducción de los
grupos nitro así formados para dar grupos amina colgantes; o
aminación directa, por ejemplo mediante tratamiento con aminoetanol.
Como alternativas adicionales, pueden usarse partículas poliméricas
preparadas mediante el procedimiento de hinchamiento en dos etapas
de Ugelstad bien conocido y las mejoras al mismo descritas en el
documento WO 00/61647 (Dyno). También son útiles en el presente
documento partículas poliméricas preparadas mediante los
procedimientos descritos en los documentos WO99/19375 y WO00/61648.
Las partículas poliméricas porosas producidas según los
procedimientos descritos en estas publicaciones pueden tener
partículas magnéticas depositadas en sus poros mediante técnicas
convencionales, por ejemplo tal como se describió anteriormente.
Como posibilidad adicional, pueden prepararse partículas poliméricas
porosas a partir de nitroestireno y DVB, e introducirse material
magnético tal como se enseña en el documento
US-A-4.654.267. De todos estos
procedimientos, se prefiere el uso de aminoestireno,
particularmente 4-aminoestireno, como monómero o
comonómero en la preparación de material polimérico que lleva amino.
El uso de este monómero o comonómero evita la necesidad de
reacciones de nitración y reducción tras la polimerización. Además,
la naturaleza más predecible (homogeneidad) del recubrimiento
proporcionado por este procedimiento permite aplicar un
recubrimiento más fiable.
La reacción de la partícula polimérica magnética
porosa con los poliisocianatos genera un polímero dentro de los
poros de las partículas poliméricas que sirve esencialmente para
bloquear estos poros encapsulando físicamente los cristales
superparamagnéticos dentro de las partículas poliméricas. Las
partículas "recubiertas" resultantes tienen entonces una
porosidad reducida con respecto al material de partida poroso.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los cristales
superparamagnéticos parecen catalizar la polimerización de manera
que el recubrimiento se forma preferencialmente en su
proximidad.
Igualmente, si se desea, pueden impregnarse
materiales adicionales dentro de las partículas porosas o bien
antes de la reacción de polimerización de recubrimiento o bien
después de la polimerización de recubrimiento pero antes de la
reticulación del polímero de recubrimiento. Normalmente, tales
materiales adicionales serán emisores o absorbedores de radiación,
por ejemplo cromóforos, fluoróforos o materiales marcados
radiactivamente.
En una realización preferida, el polímero de
recubrimiento se forma a partir de uno o más (por ejemplo 1, 2 ó 3)
poliisocianatos y uno o más (por ejemplo 2, 3 ó 4) dioles.
Preferiblemente, debe emplearse un poliisocianato, por ejemplo un
diisocianato. Alternativamente, puede emplearse una mezcla de
poliisocianatos estrechamente relacionados (por ejemplo
Desmodur).
Los poliisocianatos típicos que pueden usarse
incluyen diisocianato de metileno, diisocianato de hexametileno,
2,4-diisocianato de tolueno
(2,4-TDI) (e isómeros o mezclas del mismo),
diisocianato de isoforona (IPDI),
4,4'-oxibis(fenilisocianato),
4,4'-diisocianato de difenilmetano (MDI), mezclas de
MDI y oligómeros basados en MDI (por ejemplo Desmodur VL),
2,4-diisocianato de difenilo,
bisciclohexildiisocianato de metileno (H_{12}MDI), diisocianato
de fenileno (p-PDI),
1,4-diisocianato de
trans-ciclohexano (CHDI),
1,6-diisocianato de hexano (DICH),
1,5-diisocianato de naftaleno (NDI), diisocianato de
paratetrametilxileno (p-TMXDI) o diisocianato de
metatetrametilxileno (m-TMXDI).
Un isocianato especialmente preferido es MDI o
poliisocianatos basados en el mismo (por ejemplo Desmodur).
Desmodur comprende MDI y oligómeros del mismo que comprenden MDI con
residuos de isocianato de CH_{2}-fenilo. Por
tanto, Desmodur es una mezcla de diversos poliisocianatos que se
derivan de MDI. Una estructura de muestra puede ser
4,4-bis(fenilisocianato)
de metileno: 40-50%
4,4-bis(fenilisocianato)
de metileno + isocianato de bencilo: 20-25%
4,4-bis(fenilisocianato)
de metileno + 2 isocianato de bencilo: 10%
4,4-bis(fenilisocianato)
de metileno + 3 isocianato de bencilo: 2%.
(En una reacción como esta el producto también
contiene algo del isómero 2). El compuesto se vende por Shell con
el nombre comercial Caradate y con los nombres comerciales Hylene y
Rubinate por Huntsman.
Preferiblemente deben emplearse dos dioles. Los
dioles se usan preferiblemente en una razón molar de 0,5:1 a 1:0,5,
más preferiblemente de 0,8:1 a 1:0,8 cuando se usan dos dioles.
Preferiblemente, no se usa ningún diol en una cantidad que supere
el 90% molar de la mezcla de dioles.
Los dioles preferidos incluyen dietilenglicol,
tetraetilenglicol y polietilenglicoles, por ejemplo PEG 300, 400 ó
600. Una combinación de dioles preferida es dietilenglicol y
tetraetilenglicol.
Durante la reacción de recubrimiento que implica
al poliisocianato, se prefiere si, en una primera fase el
poliisocianato está en exceso (por ejemplo con respecto a cualquier
diol). Queda dentro del alcance de la invención usar sólo
poliisocianato en esta etapa del procedimiento de recubrimiento. Se
cree que esto minimiza la posibilidad de que se produzca
gelificación durante la reacción. Cuando se emplea un gran exceso de
poliisocianato en una reacción de recubrimiento inicial, entonces
puede ser necesario hacer reaccionar, en una segunda fase, las
partículas recubiertas con diol(es) adicional(es) (por
ejemplo un diol tal como se describió anteriormente) para que
reaccione(n) con cualquier grupo isocianato que no haya
reaccionado. Cuando la reacción de recubrimiento inicial usa
poliisocianato solo, es esencial que la partícula resultante se haga
reaccionar con al menos un diol después de eso.
En una realización de este tipo, un diol de este
tipo es preferiblemente un polietilenglicol. La larga cadena del
diol PEG permite la formación de un conector considerable entre la
superficie de recubrimiento de la partícula y por tanto facilita la
reacción con ligandos de afinidad tales como estreptavidina.
Por tanto, queda dentro del alcance de la
invención hacer reaccionar las partículas con poliisocianato seguido
por diol, es decir un procedimiento gradual, para realizar el
recubrimiento.
Normalmente, por tanto, puede realizarse la
reacción de recubrimiento mediante impregnación de la partícula
polimérica magnética porosa con el poliisocianato y diol(es),
por ejemplo usando una disolución de los mismos (por ejemplo en un
disolvente orgánico tal como metanol o diglime) o mezclando una
dispersión de las partículas porosas en un disolvente orgánico con
una mezcla líquida de diol/poliisocianato. Puede usarse la
sonicación para mejorar la impregnación y puede acelerarse la
reacción aumentando la temperatura, por ejemplo, hasta
50-100ºC. Puede extraerse cualquier disolvente usado
mediante aplicación de presión inferior a la ambiental.
Generalmente, los usos para los que se emplean
las partículas poliméricas magnéticas, por ejemplo su uso como
herramientas de diagnóstico, requieren un grado apropiado de
electrofilia con el fin de que puedan participar adecuadamente en
el acoplamiento y otras reacciones en sistemas acuosos frecuentes en
medios biológicos.
Mientras que la polaridad general de los
recubrimientos es deseablemente electrófila, pueden incorporarse
ciertos recubrimientos que contienen restos hidrófobos de manera que
se ajuste el grado de electrofilia hasta el que se desea. De esta
manera, la invención permite proporcionar herramientas de
diagnóstico y otras útiles que tienen un amplio intervalo de
polaridades.
Si se desea, en el procedimiento de la
invención, las superficies de las partículas poliméricas magnéticas
recubiertas pueden funcionalizarse adicionalmente, por ejemplo
mediante acoplamiento de una molécula de fármaco, un marcador
indicador (por ejemplo un cromóforo, fluoróforo, enzima o
radiomarcador) o un ligando (por ejemplo un anticuerpo o fragmento
de anticuerpo, un agente complejante de iones metálicos, un elemento
de un par de componentes de unión específica (por ejemplo biotina o
estreptavidina), un oligopéptido, un oligonucleótido o un
oligosacárido).
Tal acoplamiento puede ser directo o indirecto
(y por tanto puede implicar o no el uso de un agente de acoplamiento
para formar un enlace entre la partícula y la sustancia que está
acoplándose a la misma) y puede ser biodegradable o no
biodegradable. Pueden desearse acoplamientos biodegradables si las
partículas poliméricas magnéticas van a usarse para la liberación
dirigida de un principio activo. En consecuencia, tras haber
realizado el recubrimiento, pueden manipularse los grupos colgantes
del recubrimiento para proporcionar la funcionalidad apropiada (por
ejemplo funcionalidades epoxilo, hidroxilo, amino, etc.) para la
fijación de tales sustancias.
La partícula magnética recubierta funcionalizada
puede unirse a un ligando de afinidad cuya naturaleza se
seleccionará basándose en su afinidad por un analito particular cuya
presencia o ausencia en una muestra debe determinarse. Por tanto,
la molécula de afinidad puede comprender cualquier molécula que
puede unirse a una sonda magnética que también puede reconocer
específicamente un analito particular. Por tanto, los ligandos de
afinidad incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos
policlonales, fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos,
oligonucleótidos, proteínas, oligopéptidos, polisacáridos, azúcares,
péptidos, moléculas de ácido nucleico que codifican para péptidos,
antígenos, fármacos y otros ligandos. Ejemplos de ligandos de
afinidad adecuados están disponibles en la bibliografía publicada y
se conocen bien. El uso de componentes de unión adicionales,
ligandos de afinidad secundarios y grupos de enlace que es rutinario
en la técnica no se tratará adicionalmente en el presente documento
aunque se apreciará que el uso de tales especies con las partículas
de la invención es posible si se desea.
Considerada desde un aspecto adicional, la
invención proporciona el uso de partículas de la invención en
síntesis, extracciones o ensayos, en particular en detección de
ácidos nucleicos.
Tal como se mencionó anteriormente, la
naturaleza de la sustancia externa acoplada a las partículas puede
seleccionarse basándose en su capacidad para unirse a un material
diana particular. La detección de ácidos nucleicos implica
generalmente explorar con una sonda una muestra que se piensa que
contiene ácidos nucleicos diana usando una sonda de ácido nucleico
que contiene una secuencia de ácido nucleico que reconoce
específicamente, por ejemplo, se hibrida con, la secuencia de los
ácidos nucleicos diana, de manera que el ligando de afinidad por
ácido nucleico y los ácidos nucleicos diana en combinación crean una
capa de hibridación. Las partículas adecuadamente funcionalizadas
de la invención son idealmente adecuadas para la detección de ácidos
nucleicos.
Pueden usarse sondas oligonucleotídicas
monocatenarias biotiniladas unidas a perlas de estreptavidina para
aislar ADN de secuencia específica. Las sondas biotiniladas se unen
a las perlas mezclando la cantidad apropiada de perlas con un
exceso de sonda biotinilada. Entonces se incuban las perlas/sonda
con la muestra de ADN en un tampón de hibridación, por ejemplo SSPE
o SSC, en condiciones apropiadas para la secuencia y longitud de la
sonda y el ADN. El ADN en exceso y no deseado se elimina mediante
lavado usando las propiedades magnéticas de las perlas. El ADN
capturado puede detectarse/cuantificarse mediante PCR, etc.
Pueden usarse fragmentos de ADN bicatenario
biotinilado unidos a perlas de estreptavidina para aislar proteínas
de unión específica a secuencia de ADN. El ADN biotinilado se une a
las perlas mezclando la cantidad apropiada de perlas con un exceso
de fragmentos de ADN biotinilado. Entonces se incuban las perlas/ADN
con la muestra de proteína en un tampón de hibridación, en
condiciones apropiadas para la proteína en investigación. La
proteína en exceso y no deseada se elimina mediante lavado usando
las propiedades magnéticas de las perlas. La proteína capturada
puede eluirse de la sonda (mediante concentración alta en sal,
concentración baja en sal, pH bajo, etc) para su detección y
aplicaciones posteriores.
El material diana puede ser opcionalmente un
material de origen biológico o sintético, por ejemplo puede ser una
molécula o un grupo de moléculas, incluyendo por ejemplo
anticuerpos, aminoácidos, proteínas, péptidos, polipéptidos,
enzimas, sustratos de enzimas, hormonas, linfocinas, metabolitos,
antígenos, haptenos, lectinas, avidina, estreptavidina, toxinas,
venenos, contaminantes medioambientales, hidratos de carbono,
oligosacáridos, polisacáridos, glicoproteínas, glicolípidos,
nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos y ácidos nucleicos
derivatizados, ADN, ARN, fármacos naturales o sintéticos,
receptores, partículas de virus, componentes de virus de partículas
bacterianas, células, componentes celulares, vesículas lipídicas
naturales o sintéticas, membranas poliméricas, partículas y
productos poliméricos y superficies de vidrio y plástico.
Cuando las perlas de la invención van a
emplearse en inmunoensayos, se ha encontrado sorprendentemente que
la tosilación de las partículas tras el recubrimiento da como
resultado partículas que muestran un rendimiento mejorado en
inmunoensayos. Por tanto, en una realización preferida, pueden
tosilarse partículas que llevan un recubrimiento, por ejemplo
mediante reacción de las partículas con cloruro de tosilo en
presencia de una base. Las partículas recubiertas tosiladas
resultantes son nuevas y forman un aspecto adicional de la
invención. Por tosilo se hace referencia al grupo
tolueno-4-sulfonilo.
Además, pueden hacerse reaccionar fácilmente
tales especies tosiladas con ligandos de afinidad, por ejemplo
estreptavidina para formar partículas nuevas todavía
adicionales.
Por tanto, considerada desde un aspecto
adicional, la invención proporciona partículas poliméricas
recubiertas, que llevan cristales superparamagnéticos, que tienen
un recubrimiento formado a partir de al menos un poliisocianato y
al menos un diol, que posteriormente se tosilan, por ejemplo
mediante reacción con cloruro de tosilo y entonces se hacen
reaccionar opcionalmente con un ligando de afinidad, por ejemplo
estreptavidina.
Además, se ha encontrado sorprendentemente que
las partículas de los diámetros reivindicados en el presente
documento tienen una capacidad enormemente aumentada para unirse en
comparación con perlas de mayor tamaño, por ejemplo perlas de 3
\mum. Se considera que la capacidad de unión de las perlas
reivindicadas es más del 200% superior a la de perlas mayores, lo
que permite el uso de cantidades considerablemente inferiores de
partículas en un procedimiento de ensayo.
Las perlas de la invención son por tanto de
utilidad en procedimientos de adsorción/desorción de manera análoga
a los mecanismos en la cromatografía en fase inversa o cromatografía
de interacción hidrófoba. La cromatografía en fase inversa es una
técnica de separación que utiliza una interacción de adsorción
hidrófoba entre una molécula de soluto (por ejemplo una proteína) y
un ligando hidrófobo inmovilizado (por ejemplo la superficie de las
perlas). Esta interacción es habitualmente tan fuerte que puede
producirse en disoluciones de baja fuerza iónica y se rompe
mediante el uso de disolventes orgánicos (por ejemplo acetonitrilo).
La cromatografía en fase inversa puede usarse para fraccionar
muestras de proteínas complejas y para desalar muestras de
proteínas. La RPC se realiza habitualmente usando una fase sólida
empaquetada en una columna. Las perlas de la invención permiten
realizar la técnica sin columna, sin dilución de la muestra y
automatizarse con un alto rendimiento.
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)
es una técnica de separación que utiliza una interacción de
adsorción hidrófoba entre una molécula de soluto (por ejemplo una
proteína) y un ligando hidrófobo inmovilizado (por ejemplo la
superficie de las perlas). Esta interacción es más débil que las
interacciones utilizadas durante la RPC y requiere su estimulación
mediante altas concentraciones de sal. En consecuencia, pueden
usarse concentraciones de sal decrecientes para romper estas
interacciones de adsorción. La HIC puede usarse para fraccionar
muestras de proteínas complejas y para desalar muestras de
proteínas. La HIC se realiza habitualmente usando una fase sólida
empaquetada en una columna. Las perlas de la invención permiten
realizar la técnica sin columna, sin dilución de la muestra y
automatizarse con un alto rendimiento.
Ahora se describirá la invención adicionalmente
mediante referencia a los siguientes ejemplos. No se pretende que
sean limitativos sino simplemente a modo de ejemplo de la
invención.
Se extrajeron 1600 g de estireno con 2 l de
hidróxido de sodio al 10% en peso, se lavaron con agua hasta pH 7 y
después se purgaron con argón durante 10 min. En un reactor de 10 l,
se calentaron 8000 g de agua y 3,07 g de bórax hasta 80ºC, y se
eliminaron mediante evaporación 100 g de agua para eliminar el
oxígeno. Después se cargaron 19,97 g de decilsulfato de sodio en
200 ml de agua en ebullición y se agitó durante 10 min. Después se
cargó el estireno lavado y sustancialmente libre de oxígeno y se
agitó durante 15 min. Después se cargaron 4,80 g de peroxodisulfato
de potasio en 200 g de agua en ebullición. Se mantuvo la mezcla a
80ºC en una atmósfera de argón durante 13 horas. Se formó una
suspensión monodispersa de partículas poliméricas que tenían un
diámetro de partícula de 0,3 \mum.
Se homogeneizaron 8860 g de agua, 866 g de DOP
(peróxido de dioctanoilo), 433 g de acetona y 51,96 g de SDS
durante 25 minutos en un homogeneizador Manton Gaulin de dos fases a
400 kg/cm^{2} en la primera fase y 100 kg/cm^{2} en la segunda
fase. Tras la homogeneización, se cargaron 5164 g de la emulsión con
una suspensión de simientes de partículas de poliestireno
monodispersas que tenían un diámetro de 0,3 \mum del ejemplo 1. Se
usaron 1891 g de suspensión de simientes que contenía 297,8 g de
partículas poliméricas y 1593 g de agua.
Tras agitar durante 24 horas a 25ºC, se cargaron
6414 g de la suspensión de partículas de simientes activadas con
una emulsión que contenía 103400 g de agua, 131 g de SDS
(dodecilsulfato de sodio), 1556 g de polivinilpirrolidona
K-30, 4157 g de divinilbenceno al 63,2%, 1060 g de
estireno y 11606 g de tolueno (como porógeno). Se homogeneizó la
emulsión durante 25 min. a 400 kg/cm^{2} en la primera fase y 100
kg/cm^{2} en la segunda fase.
Tras hinchar durante 2 horas a 25ºC, se cargaron
46676 g de agua al reactor y después se polimerizó la dispersión
durante 1 hora a 60ºC y 20 horas a 70ºC. Se formó una suspensión
monodispersa que tenía un diámetro de partícula de 1,0 \mum.
Se lavaron las partículas con metanol y acetato
de butilo y se secaron. Mediante BET, se determinó que el área
superficial específica era de 570 m^{2}/g de sustancia seca.
Se enfrió una mezcla de 9920 g de ácido
sulfúrico al 95% y 3020 g de ácido nítrico al 65% hasta 10ºC y
después se cargaron 400 g de partículas de poliestireno reticuladas
porosas secas de 1,0 \mum del ejemplo 2. Se aumentó la
temperatura hasta 30ºC durante 1 hora y 30 min. Se cargó la
suspensión con 60 l de hielo y agua. Se lavaron las partículas con
agua y metanol mediante filtración. Las partículas resultantes
contenían un 9,0% en peso de nitrógeno.
Se añadieron 2579 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 3,2 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O a
una suspensión de 4144 g de partículas porosas nitradas del ejemplo
3 que contenían 450 g de partículas y 3694 g de agua. Se agitó la
suspensión a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadieron 3285
g de NH_{3} al 25% en agua. Se aumentó la temperatura hasta 60ºC
durante 2 horas. Se enfrió la suspensión y se lavaron las partículas
con agua mediante centrifugación. Tras la purificación, se
transfirieron las partículas a metanol. El análisis de las
partículas mostró un contenido de 330 mg de Fe/g de SS (sustancia
seca) y 0,9 mg de Mn/g de SS.
(Sólo como
referencia)
Se lavaron cinco veces con 93 g de diglime 133 g
de una suspensión de metanol que contenía 13,3 g de partículas
poliméricas de estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe). Se ajustó la sustancia seca de partículas en diglime hasta el
15% en peso y se añadieron glicidol (3,07 g),
1,4-butanodiol diglicidil éter (Araldite
DY-026, 8,06 g) y metacrilato de glicidilo (5,68 g)
a las partículas. Se calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó
durante 20 horas. Entonces se lavaron las partículas seis veces con
70 g de metanol y cuatro veces con 80 g de isopropanol.
A 1806 g de una suspensión de las partículas
preparadas en el ejemplo 5 (425 g) en isopropanol se les añadieron
metanol (774 g), ácido acrílico (514 g) y
2,2'-azoisobutironitrilo (23,4 g). Se calentó la
mezcla hasta 73-75ºC y se agitó durante 20 horas.
Entonces se lavaron las partículas seis veces con 2338 g de metanol
y una vez con 3018 g de NaOH 0,15 M. Se ajustó el contenido en
partículas (basándose en sustancia seca) hasta el 12% en peso y se
calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó durante 3,5 horas. Se
lavaron las partículas tres veces con 3188 g de agua y cinco veces
con 3188 g de NaOH 0,01 M.
A 47 g de una suspensión de las partículas
preparadas en la etapa (A) (13,3 g) en isopropanol se les añadieron
metanol (24 g), ácido acrílico (9,64 g) y
2,2'-azoisobutironitrilo (0,41 g). Se calentó la
mezcla hasta 73-75ºC y se agitó durante 20 horas.
Entonces se lavaron las partículas seis veces con 73 g de metanol y
una vez con 94 g de NaOH 0,15 M. Se ajustó la sustancia seca de la
mezcla de partículas y NaOH 0,15 M hasta el 12% en peso y se
calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó durante 3,5 horas. Se
lavaron las partículas tres veces con 99 g de agua y cinco veces
con 99 g de NaOH 0,01 M.
Se acidificaron 50 g de una suspensión de 5,0 g
de las partículas del ejemplo 6 lavando con ácido acético 0,1 M (3
x 50 ml). Entonces se lavaron las partículas acidificadas (que
tenían un contenido en ácido carboxílico de 0,5 mmoles/g de SS) con
acetona (4 x 50 ml) y se concentraron sobre un imán. Se añadió
acetona suplementaria hasta que se logró un total de 35,6 g de
suspensión. Entonces se añadieron
N-hidroxisuccinimida (2,90 g, 25 mmoles) y
diisopropilcarbodiimida (3,16 g, 25 mmoles). Se agitó la mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante 5 horas. Entonces se
lavaron las partículas con acetona (5 x 50 ml).
1. Se dispersaron 20 mg de perlas
funcionalizadas con ácido carboxílico del ejemplo 6 en 1 ml de NaOH
0,01 M.
2. Se separaron las perlas sobre un imán y se
descargó el sobrenadante.
3. Se lavaron las perlas tres veces con 1 ml de
ácido 2-morfolino-etansulfónico
(MES) 30 mM pH 6,1.
4. Se añadieron 1,8 mg de estreptavidina
disueltos en 900 \mul de MES 30 mM pH 6,1 a las perlas.
5. Se incubaron las perlas y estreptavidina en
un dispositivo de mezclado a temperatura ambiente durante 15
minutos.
6. Se añadieron 3 mg de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) disueltos en 75 \mul de agua destilada fría.
7. Se incubó la mezcla en un dispositivo de
mezclado a temperatura ambiente durante una hora.
8. Se lavaron las perlas tres veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 con Tween 20 al 0,01%
(p/v) con el fin de eliminar el exceso de estreptavidina y EDC.
9. Se resuspendieron las perlas en PBS pH 7,4
con Tween 20 al 0,1%.
Se midió la cantidad de estreptavidina usando
cantidades de trazador de estreptavidina marcada con I^{125}
durante el recubrimiento. La cantidad relativa de estreptavidina
marcada con I^{125} proporciona la cantidad de estreptavidina
recubierta sobre la superficie.
Se determinó la capacidad de unión a biotina
libre mediante adición de un exceso de biotina marcada con C^{14}
a las perlas recubiertas con estreptavidina. Se eliminó mediante
lavado el exceso de biotina y se midió la cantidad de
C^{14}-biotina usando un contador de centelleo
beta.
Se encontró que la cantidad de recubrimiento con
estreptavidina era de 68 \mug por mg de perlas, y la capacidad de
unión a biotina libre era de 3100 pmol de biotina libre por mg de
perlas.
Etapa
A
A 40,0 g de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum que contenían
óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de Fe)
(preparadas de manera análoga al ejemplo 4) en 200 g de diglime, se
les añadieron 100 g de 1,4-butanodiol diglicidil
éter y 100 g de glicidol. Se agitó la mezcla de reacción a 250 rpm
durante 20 horas a 90ºC. Entonces se lavaron las partículas cinco
veces con 400 ml de metanol y cuatro veces con 400 ml de agua
desionizada.
Etapa
B
A 72 g de una suspensión acuosa de las
partículas preparadas tal como en la etapa A (contenido en
partículas del 10% en peso), se les añadieron lentamente 119 g de
hidróxido de sodio. Entonces se añadieron 169,2 g de alil glicidol
éter. Tras agitar a 250 rpm durante 18 horas a 60ºC, se lavaron las
partículas cinco veces con 1400 ml de metanol.
A 10 g de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum que contenían
óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de Fe)
(preparadas de manera análoga al ejemplo 4) en 40 g de diglime, se
les añadieron 16,7 g de alil glicidil éter, 16,8 g de
1,4-butanodiol diglicidil éter y 16,8 g de glicidol.
Se agitó la mezcla de reacción a 300 rpm a 90ºC durante 20 horas.
Entonces se lavaron las partículas cinco veces con 100 ml de
metanol.
A 78 g de una suspensión de diglime de 13 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) se les añadieron Desmodur VL (35,83 g),
dietilenglicol (2,82 g), tetraetilenglicol (4,84 g). Se calentó la
mezcla a 80ºC y se agitó durante 21 horas.
Se añadió una mezcla de dietilenglicol (47,04
g), tetraetilenglicol (80,45 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (1,29
g) a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 2 horas. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
Se lavaron cinco veces con 14 g de diglime 22 g
de una suspensión en metanol de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4). Se ajustó la
sustancia seca de las partículas en diglime hasta el 16% en peso y
se añadieron Araldite DY-026 (diglicidil éter de
1,4-butanodiol) (26 g) y glicidol (26 g) a las
partículas. Se calentó la mezcla hasta 90ºC y se agitó durante 20
horas. Entonces se lavaron las partículas 5 veces con 80 g de
metanol y cuatro veces son 45 g de diglime.
A 18 g de la suspensión en diglime de las
partículas se les añadieron anhídrido metacrílico (15 g) y piridina
(0,4 g). Se calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó durante 20
horas. Entonces se lavaron las partículas cinco veces con 90 g de
metanol y tres veces con 60 g de isopropanol.
(Sólo para
referencia)
A 124,45 gramos de una suspensión en diglime de
20 g de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se les añadió
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564) (42
g). Se calentó la mezcla hasta 60ºC y se agitó durante 2 horas y
luego se enfrió hasta temperatura ambiente y se agitó durante la
noche. Se lavó la suspensión tres veces con diglime y se ajustó la
sustancia seca hasta el 12%.
Se añadieron glicidol (4,58 g), Araldite
DY-026 (diglicidil éter de
1,4-butanodiol) (12,1 g) y metacrilato de glicidilo
(8,57 g). Se calentó la mezcla a 75ºC y se agitó durante 21 horas.
Se enfrió la suspensión de partículas y se lavaron las partículas
seis veces con 100 g de metanol y cuatro veces con 100 g de
isopropanol.
A 516 gramos de una suspensión en agua de 51,6 g
de partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno
de 1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (375 g) se les añadió hidróxido de sodio sólido
(144,89 g), se agitó la mezcla y se mantuvo la temperatura por
debajo de 42ºC durante la adición. Se añadió alil glicidil éter
(206,4 g), y se calentó la mezcla hasta 60ºC, se agitó durante 18
horas. Se enfrió la suspensión de partículas y se lavaron las
partículas cuatro veces con 1500 g de metanol.
Se lavaron tres veces con 60 g de diglime 90 g
de una suspensión en metanol de 15 g de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) y se añadieron
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564)
(70,40 g) y diglicidil éter de 1,4-butanodiol
(Araldit DY-026) (4,61 g). Se calentó la mezcla a
95ºC durante 20 horas. Se enfriaron las partículas y se lavaron
tres veces con 100 g de diglime y tres veces con 100 g de
metanol.
A 23,48 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564)
(23,47 g) y diglicidil éter de polietilenglicol Mw \sim300 (3,07
g). Se calentó la mezcla a 95ºC durante 20 horas. Se enfriaron las
partículas y se lavaron cuatro veces con 40 g de metanol.
A 24,46 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564)
(23,54 g) y diglicidil éter de polietilenglicol Mw \sim500 (15,28
g). Se calentó la mezcla a 95ºC durante 20 horas. Se enfriaron las
partículas y se lavaron cinco veces con 40 g de metanol.
A 26,82 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564)
(46,93 g) y triglicidil éter de glicerolpropoxilato (69,98 g). Se
calentó la mezcla a 95ºC durante 20 horas. Se enfriaron las
partículas y se lavaron cinco veces con 40 g de metanol.
Se dispersaron 20 mg de perlas recubiertas del
ejemplo 17 en 1 ml de tampón fosfato de Na 0,1 M pH 7,4. Se
separaron las perlas sobre un imán y se desechó el sobrenadante. Se
repitió esto dos veces. Se añadió a las perlas 1 mg de
estreptavidina disuelta en 900 ul de tampón fosfato de Na 0,1 M pH
7,4. Se incubaron las perlas y la estreptavidina en un dispositivo
de mezclado durante 20 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las
perlas tres veces con PBS pH 7,4 con BSA al 0,1%.
Se midió la capacidad de unión a biotina libre
tal como se describe en el ejemplo 20 y se halló que era de 1900
pmol de biotina libre por mg de perlas.
1. Se biotinilaron y marcaron con europio
fragmentos de ADN de plásmido de 1090, 526, 217 pares de bases
mediante PCR.
2. Se eliminó la biotina y marcadores de europio
mediante técnicas de limpieza por PCR comerciales y se cuantificó el
ADN marcado mediante la densidad óptica a 260 nm y fluorescencia
resuelta en el tiempo.
3. Se lavaron perlas recubiertas con
estreptavidina (ejemplo 8) una vez en un tampón de unión concentrado
2 veces (NaCl 2 M, Tris HCl 20 mM, EDTA 0,2 M pH 7,5).
4. Se resuspendieron 5 \mug de las perlas
lavadas en 100 \mul de tampón de unión en cada pocillo de una
placa de 96 pocillos.
5. Se añadió un exceso de ADN (0,55 pmol de 1090
pb, 1,1 pmol de 526 pb y 2,2 pmol de 217 pb) diluido en 100 \mul
de agua a las perlas y se incubaron con agitación suave durante
15-30 minutos a temperatura ambiente.
6. Se coloca la placa sobre el imán y se elimina
el sobrenadante.
7. Se lava el complejo
perlas-ADN 3 veces con 200 \mul de tampón de
lavado (Tris-HCl 10 mM pH 7,8, Tween 20 al
0,01%).
8. Se resuspende el complejo
perlas-ADN en 200 \mul de disolución de
intensificación DELFIA y se incuba, protegido de la luz, con
agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos.
9. Se coloca la placa sobre el imán y se
transfiere la disolución de intensificación a una placa de 96
pocillos FluorNunc y se mide la señal de europio mediante
fluorescencia de resolución en el tiempo (lector de placas Wallac
Victor) y se proporciona como cuentas por segundo (cps).
10. Se calcula el ADN unido a las perlas a
partir del tanto por ciento de cps añadido en 0,55, 1,1 y 2,2 pmol
de ADN, que se ha unido a las perlas.
La capacidad de unión de las perlas es de
aproximadamente 200 pmol/mg para el fragmento de 217 pb,
80-100 pmol/mg para el fragmento de 526 pb y
35-45 pmol/mg para el fragmento de 1090 pb.
A 23,8 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g), dietilenglicol (1,45 g),
tetraetilenglicol (2,48 g) y diglime (36,2 g). Se calentó la mezcla
a 80ºC y se agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de polietilenglicol Mw
\sim300 (68,24 g), tetraetilenglicol (41,30 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,68
g) a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
Se dispersaron 20 mg de perlas recubiertas del
ejemplo 21 en 1 ml de tampón borato 0,1 M pH 9,0. Se separaron las
perlas sobre un imán y se desechó el sobrenadante. Se repitió esto
dos veces. Se añadió a las perlas 1 mg de IgG1 de ratón
anti-alfa-fetoproteína humana
disuelta en 900 ul de tampón borato 0,1 M pH 9,0. Se incubaron las
perlas y el anticuerpo en un dispositivo de mezclado durante 20
horas a temperatura ambiente. Se lavaron las perlas tres veces con
PBS pH 7,4 con BSA al 0,1%.
Se midió la cantidad de anticuerpo unido a las
perlas mediante el uso de cantidades de trazador de anticuerpo
marcado con I125 durante el recubrimiento. La cantidad relativa de
anticuerpo marcado unido a las perlas proporciona la cantidad total
de anticuerpo inmovilizado. La cantidad de proteína inmovilizada en
las perlas fue de 22 \mug de anticuerpo por mg de perlas.
Se midió la unión de la
alfa-fetoproteína al anticuerpo inmovilizado
mediante la adición de diluciones de sangre del cordón umbilical y
se detectó mediante el uso de una segunda IgG de ratón
anti-alfa-fetoproteína humana
marcada con Eu^{3+}. Se detectó el anticuerpo marcado con
espectroscopía de fluorescencia de resolución en el tiempo. Una
dilución de curva patrón de la sangre del cordón umbilical mostró un
aumento de la señal con la concentración creciente.
A 26,82 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g), polietilenglicol Mw \sim600
(15,84 g) y diglime (33,20 g). Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de polietilenglicol Mw
\sim600 (263,82 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,66 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 15,87 g de una suspensión de las partículas
preparadas en el ejemplo 5 (2,5 g) en isopropanol se les añadieron
ácido acrílico (1,84 g), acrilamida (1,79 g), metanol (5,95 g) y
2,2'-azoisobutironitrilo (0,28 g). Se calentó la
mezcla hasta 75ºC y se agitó durante 20 horas. Entonces se lavaron
las partículas cuatro veces con 20 g de isopropanol y 4 veces con 25
g de NaOH 0,15 M.
A 8,44 g de una suspensión de las partículas
preparadas en el ejemplo 5 (1 g) en agua se les añadieron ácido
acrílico (0,37 g), alil glicidil éter (1,34 g), dimetilsulfóxido
(0,91 g) y 2,2'-azoisobutironitrilo (0,06 g). Se
calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó durante 20 horas. Entonces
se lavaron las partículas cuatro veces con 10 g de isopropanol y 4
veces con 10 g de NaOH 0,15 M.
A 3,9 g de una suspensión en diglime de 2,7 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron diisocianato de hexametileno (2,5 g), dietilenglicol
(0,5 g) y tetraetilenglicol (1,0 g). Se calentó la mezcla a 80ºC y
se agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de dietilenglicol (2,65 g),
tetraetilenglicol (4,66 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,07
g) a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 95ºC y se
agitó durante 2-3 horas. Se enfriaron las
partículas y se lavaron cuatro veces con 20 g de acetona.
A 23,8 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g), dietilenglicol (1,45 g),
tetraetilenglicol (2,48 g) y diglime (36,2 g). Se calentó la mezcla
a 80ºC y se agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de polietilenglicol Mw
\sim400 (90,03 g), tetraetilenglicol (41,20 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,68
g) a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 23,8 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g), dietilenglicol (1,45 g),
tetraetilenglicol (2,48 g) y diglime (36,2 g). Se calentó la mezcla
a 80ºC y se agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de polietilenglicol Mw
\sim600 (135 g), tetraetilenglicol (41,30 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,66
g) a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 23,8 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g), dietilenglicol (1,45 g),
tetraetilenglicol (2,48 g) y diglime (36,2 g). Se calentó la mezcla
a 80ºC y se agitó durante 20 horas.
Se añadió una mezcla de etilenglicol (27,29 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,66 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 26,82 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g) y etilenglicol (1,64 g). Se
calentó la mezcla a 80ºC y se agitó durante 20 horas. Se añadió una
mezcla de etilenglicol (27,29 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,66 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 17,1 g de una suspensión en acetona de 4 g del
ejemplo 30 se les añadieron cloruro de tosilo (16 g) y piridina
(7,85 g). Se agitó la mezcla a 25ºC durante 17 horas. Entonces se
lavaron las partículas tres veces con 50 ml de acetona, una vez con
50 ml de una mezcla del 80% en peso de acetona en agua, una vez con
50 ml de una mezcla del 60% en peso de acetona en agua, una vez con
50 ml de una mezcla del 30% en peso de acetona en agua y tres veces
con 50 ml de agua.
\newpage
Se añadieron 50 ug de perlas recubiertas con
inmunoglobulina del ejemplo 22 a 100 ul de diluciones de sangre del
cordón umbilical y se dejó que el contenido de
alfa-fetoproteína se uniera durante la incubación
durante 15 minutos. Se eliminó mediante lavado la sangre del cordón
umbilical en exceso. A este complejo se le añadió una segunda IgG
de ratón de detección
anti-alfa-fetoproteína humana
marcada con Eu^{3+}. Tras la incubación y eliminación del
anticuerpo de detección en exceso, se detectó la cantidad de
anticuerpo marcado con espectroscopía de fluorescencia de
resolución en el tiempo. Una dilución de curva patrón de sangre del
cordón umbilical con una cantidad conocida de
alfa-fetoproteína mostró un aumento de la señal con
la concentración creciente. Mediante el uso de esta curva patrón,
pudo determinarse la cantidad de alfa-fetoproteína
en las muestras.
Se usaron perlas recubiertas de manera similar
al ejemplo 22, pero con IgG de ratón
anti-mioglobulina humana, para analizar el
contenido de mioglobulina en muestras de plasma humano con citrato
en un instrumento de inmunoensayo Liaison. Se incubaron las perlas
y las muestras (10 ul) durante 10 minutos y se eliminó mediante
lavado la muestra en exceso. Se añadió anticuerpo de detección
conjugado con éster naranja de acridinio. Tras la incubación
durante 10 minutos, se eliminó mediante lavado el anticuerpo de
detección en exceso, y se desarrolló la señal quimioluminiscente y
se detectó en el lector de luminiscencia del instrumento
Liaison.
Se usaron perlas recubiertas de manera similar
al ejemplo 22, pero con IgG de ratón anti-dímero D
humano, para analizar el contenido de mioglobulina en muestras de
plasma humano con citrato en un instrumento de inmunoensayo
Liaison. Se incubaron las perlas y las muestras (10 ul) durante 10
minutos y se eliminó mediante lavado la muestra en exceso. Se
añadió anticuerpo de detección conjugado con éster naranja de
acridinio. Tras la incubación durante 10 minutos, se eliminó
mediante lavado el anticuerpo de detección en exceso, y se
desarrolló la señal quimioluminiscente y se detectó en el lector de
quimiolumniscencia del instrumento Liaison.
Se usaron perlas recubiertas con estreptavidina
como en el ejemplo 19 para analizar el contenido de PTH intacta en
muestras de plasma humano con EDTA en un instrumento de inmunoensayo
Liaison. Se incubaron 150 ul de plasma con EDTA con un anticuerpo
de cabra policlonal biotinilado producido frente a PTH intacta, y un
anticuerpo de cabra policlonal conjugado con éster de acridinio
producido de manera similar para proporcionar un inmunocomplejo. Se
añadieron las perlas recubiertas con estreptavidina al
inmunocomplejo y se incubaron para permitir que la biotina se uniera
a la estreptavidina inmovilizada. Se lavaron las perlas y se
desarrolló y midió la señal quimioluminiscente en el lector de
quimioluminiscencia del instrumento Liaison.
Se lavaron cinco veces con 14 g diglime 22 g de
una suspensión en metanol de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4). Se ajustó la
sustancia seca de las partículas en diglime hasta el 16% en peso y
se añadió a las partículas metacrilato de glicidilo (50 g) y cloruro
de hierro (III) (0,62 g). Se calentó la mezcla hasta 75ºC y se agitó
durante 20 horas. Entonces se lavaron las partículas seis veces con
14 g de metanol y cuatro veces con 13 g de isopropanol.
A 26,82 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadieron Desmodur VL (18,34 g) y diglime (33,20 g). Se calentó
la mezcla a 80ºC y se agitó durante 20 horas. Se añadió una mezcla
de polietilenglicol Mw \sim600 (236,82 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,66 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 100 g de diglime y cuatro veces con 100 g de acetona.
A 10,74 g de una suspensión en diglime de 2 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadió glicidol (6,84 g). Se calentó la mezcla a 90ºC durante
20 horas. Se enfriaron las partículas y se lavaron ocho veces con 17
g de metanol y cuatro veces con 17 g de agua.
A 14,52 g de una suspensión en diglime de 2,50 g
de partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno
de 1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) (preparadas de manera análoga al ejemplo 4) se
les añadió
2,2-bis[4-(glicidiloxi)fenil]propano
(diglicidil éter de bisfenol A, Araldit LY-564)
(13,03 g). Se calentó la mezcla a 95ºC durante 20 horas. Se
enfriaron las partículas y se lavaron tres veces con 17 g de diglime
y cinco veces con 17 g de metanol.
1. Se lavaron 5 \mug de las perlas de
estreptavidina (ejemplo 19) una vez en tampón de ensayo DELFIA y se
mezclaron con un exceso de anticuerpo biotinilado marcado con
europio^{3+} en una placa de 96 pocillos.
2. Se llevó a cabo la incubación con mezclado a
temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que el
anticuerpo se uniera a las perlas.
3. Se colocó la placa sobre el imán y se eliminó
el sobrenadante.
4. Se lavó el complejo
perlas-anticuerpo 3 veces con 200 \mul de tampón
de lavado DELFIA.
5. Se resuspendió el complejo
perlas-anticuerpo en 200 \mul de disolución de
intensificación DELFIA y se incubó, protegido de la luz, con
agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos.
6. Se colocó la placa sobre el imán y se
transfirió la disolución de intensificación a una placa de 96
pocillos FluorNunc y se midió la señal de europio mediante
fluorescencia de resolución en el tiempo (lector de placas Wallac
Victor) y se proporcionaron como cuentas por segundo (cps).
7. Se calculó la cantidad de anticuerpo unido a
las perlas a partir del tanto por ciento de cps añadido que se
había unido a las perlas.
La capacidad de unión de las perlas fue
aproximadamente de 8,0 \mug de anticuerpo biotinilado por mg de
perlas.
A 30,1 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) se les añadieron Desmodur VL (13,8 g),
dietilenglicol (2,08 g). Se calentó la mezcla a 80ºC y se agitó
durante 20 horas. Se añadió una mezcla de dietilenglicol (35 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,5 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 80 ml de diglime y cinco veces con 80 ml de acetona.
A 30,8 g de una suspensión de diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
33% en peso de Fe) se les añadió Desmodur VL (13,8 g). Se calentó la
mezcla a 80ºC y se agitó durante 20 horas. Se añadió una mezcla de
dietilenglicol (35 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,5 g)
a la suspensión de partículas. Se calentó la mezcla a 80ºC y se
agitó durante 1 hora. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 80 ml de diglime y cinco veces con 80 ml de acetona.
7,0 g de partículas poliméricas de
estireno-divinilbenceno de 1,0 \mum
funcionalizadas en la superficie mediante nitración y reducción y
que contenían óxido de hierro superparamagnético (el 33% en peso de
Fe) se ajustaron hasta el 20 por ciento en peso de material seco en
dietilenglicol dimetil éter. Se añadieron 17,5 g de Araldit
Dy-026 y 17,5 g de glicidol a la suspensión, y se
calentó la mezcla a 90ºC durante 20 horas. Se lavaron las perlas
cinco veces con metanol (200 ml) y cinco veces con agua (200
ml).
A 80 g de una suspensión de 8,0 g de perlas del
ejemplo 43 se les añadieron 22,5 g de hidróxido de sodio y 32 g de
alil glicidil éter. Se agitaron las perlas y se calentaron a 60ºC
durante 18 horas, y se sometieron a tratamiento final lavando
cuatro veces con 240 de metanol.
Se usaron las perlas de los ejemplos 41, 42, 11,
15 y 30 para fraccionar una mezcla de proteínas que consistía en
conalbúmina, inhibidor de la tripsina de la semilla de soja, alcohol
deshidrogenasa, citocromo C y diamina oxidase, o lisados celulares
de células SW 480. Se lavó previamente 1 mg de perlas y se
resuspendió en 10 ul de un tampón de adsorción de RPC (obtenido de
Bruker Daltonics o alternativamente tampón fosfato de sodio 50 mM,
sulfato de amonio 1 M, ácido trifluoroacético al 0,1%) y se incubó
con 25 ug de la mezcla de proteínas o lisado celular durante 1
minuto. Tras la adsorción, se lavaron las perlas tres veces con
tampón de lavado (obtenido de Bruker Daltonics o tampón fosfato de
sodio 50 mM, sulfato de amonio 1 M, ácido trifluoroacético al 0,1%)
y posteriormente se desorbieron las proteínas en fracciones usando
tampones de desorción que contenían concentraciones crecientes de
acetonitrilo (0, 15, 30, 40 y 50%).
Se usaron las perlas del ejemplo 44 para
fraccionar una mezcla de proteínas que consistía en conalbúmina,
inhibidor de la tripsina de semilla de soja, alcohol deshidrogenasa,
citocromo C y diamina oxidase. Se lavó previamente 1 mg de perlas y
se resuspendió en tampón de adsorción (tampón fosfato de sodio 50 mM
pH 5,8, sulfato de amonio 1 M) y se incubó con 25 g de la mezcla de
proteínas durante 1 minuto. Tras la adsorción, se lavaron las
perlas tres veces con un tampón de lavado apropiado (tampón fosfato
de sodio 50 mM, sulfato de amonio 1 M) y posteriormente se
desorbieron las proteínas en fracciones usando tampones de desorción
que contenían concentraciones decrecientes de sulfato de amonio
(0,8, 0,6, 0,4, 0,2 y 0,0 M).
A 26,81 g de una suspensión en diglime de 5 g de
partículas poliméricas de estireno-divinilbenceno de
1,0 \mum funcionalizadas en la superficie mediante nitración y
reducción y que contenían óxido de hierro superparamagnético (el
46% en peso de Fe) (375 g) se les añadieron Desmodur VL (18,39 g) y
diglime (33,50 g). Se calentó la mezcla a 80ºC y se agitó durante
20 horas. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres veces con
100 g de dimetilformamida y se añadieron
2,2(etilendióxido)-dietilamina (74,4 g) y
1,4-diazabiciclo(2.2.2)octano (0,63
g). Se calentó la mezcla hasta 80ºC durante dos horas. Se enfriaron
las partículas y se lavaron cuatro veces con 100 g de
dimetilformamida. A 6,66 g de esta suspensión en dimetilformamida se
les añadió 1,4-butanodiol diglicidil éter (Araldit
LY-026) (3,03 g). Se calentó la mezcla hasta 70ºC
durante 20 horas. Se enfriaron las partículas y se lavaron tres
veces con 17 g de dimetilformamida.
Claims (26)
1. Procedimiento para la preparación de
partículas poliméricas recubiertas que contienen cristales
superparamagnéticos, comprendiendo dicho procedimiento hacer
reaccionar partículas poliméricas que contienen cristales
superparamagnéticos, funcionalizadas en la superficie, porosas con
un diámetro de 0,5 a 1,8 \mum con al menos un poliisocianato y al
menos un diol.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se emplean al menos dos dioles.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dichos dioles se seleccionan del grupo que consiste en
polietilenglicoles y dioles de fórmula
HO((CH_{2})_{m}O)_{n}H (en la que n es un número
entero de 1 a 15 y m es un número entero de 2 a 6).
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dichos dioles son dietilenglicol y tetraetilenglicol.
5. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que uno de dichos dioles es polietilenglicol.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 a 5,
en el que dicho poliisocianato es
4,4-bis(fenilisocianato) de metileno o un
poliisocianato que comprende
4,4-bis(fenilisocianato) de metileno con
restos de isocianato de CH_{2}-fenilo.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho poliisocianato es un
diisocianato.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que se hacen reaccionar dichas
partículas, en una primera fase, con una mezcla de poliisocianato y
al menos un diol en la que el poliisocianato está en un exceso molar
con respecto al/a los diol(es) y, en una segunda fase, se
hacen reaccionar posteriormente con al menos un diol.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que se usan dos dioles en la primera fase de la reacción y se
usan uno o dos dioles en la segunda fase.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que se usan dietilenglicol y tetraetilenglicol en ambas fases de
la reacción.
11. Procedimiento según la reivindicación 1 a 7,
en el que se hacen reaccionar las partículas, en una primera fase,
con poliisocianato en ausencia de diol, y, en una segunda fase, se
hacen reaccionar con al menos un diol.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que se emplea un diol y dicho diol es un polietilenglicol.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que también se hacen reaccionar
dichas partículas con un reactivo de reticulación de polímeros.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que dicho agente de reticulación es divinilbenceno.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las partículas están
funcionalizadas con amina.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas poliméricas
funcionalizadas en la superficie, porosas, son partículas
poliméricas de estireno-divinilbenceno nitradas y
reducidas.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el diámetro de las
partículas poliméricas es de entre 0,5 y 1,2 \mum.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el diámetro de las partículas poliméricas es de 1 \mum.
19. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que dicha partícula recubierta se
tosila posteriormente.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que posteriormente a la reacción
de recubrimiento, se acoplan dichas partículas a una molécula de
fármaco, un resto indicador o un ligando.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicho ligando es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo
policlonal, fragmento de anticuerpo, ácido nucleico,
oligonucleótido, proteína, oligopéptido, polisacárido, azúcar,
péptido, molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido,
antígeno o fármaco.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicho ligando es estreptavidina.
23. Partícula que puede obtenerse mediante un
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
22.
24. Uso de un producto de un procedimiento
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en un
ensayo.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que
dicho ensayo es para la detección de ácido nucleico o es un
inmunoensayo.
26. Uso de un producto de un procedimiento según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en cromatografía de
interacción hidrófoba o cromatografía en fase inversa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48802003P | 2003-07-17 | 2003-07-17 | |
| US488020P | 2003-07-17 |
Publications (1)
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