CN117732437A - 可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子的制备及药靶鉴定应用 - Google Patents
可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子的制备及药靶鉴定应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料领域，具体涉及可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子的制备及药靶鉴定应用。本发明公开一种可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子，在引入含有羧基的（SH）n‑COOH中间分子的同时形成二硫键，所述羧基化位点用于连接氨乙基苯磺酰胺（AEBSA）的氨基基团，可用于选择性固定磺胺药物后进行靶蛋白亲和纯化。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料领域，具体涉及可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子的制备及药靶鉴定应用。
背景技术
从植物、动物和海洋产品中分离出来的天然产物具有广谱的生物活性，这些生物活性化合物在药物开发中发挥着重要作用。在过去的几个世纪里，这些生物活性化合物经常作为单分子实体使用，甚至作为混合物使用，而对其作用方式并没有详细的了解。为了充分阐明小分子生物活性的分子作用机制，鉴定其生物靶点是必不可少的一步。靶点主要是蛋白质，如酶、激酶、蛋白酶、调节剂、接头、离子通道等。此外，少数是核酸、脂质和碳水化合物。现如今大多数生物活性化合物在不知道其具体作用机制的情况下被利用，结果往往会引起一些不良反应和副作用。在生物活性化合物与特定蛋白质发生相互作用以发挥药理作用概念的基础上，探究其蛋白作用靶点就变得非常重要。为了探究生物活性化合物的蛋白作用靶点，迫切需要开发有用的工具和方法。
在所有的靶点识别方法中，亲和纯化是识别小分子直接结合靶点的经典和最常用的方法，它能够与质谱鉴定联用，直接、全面地分析某些与感兴趣的生物活性化合物特异性结合的特定蛋白质。亲和纯化是一种利用生物分子间的亲和力（如抗原抗体反应、DNA杂交和酶-底物相互作用等）分离和鉴定特定配体的靶分子的有效方法。在亲和纯化中，感兴趣的生物活性化合物被用作配体，作为功能探针来探索其靶分子。亲和纯化中探针的合成有两种：一种是基质固定形探针，另一种是标签类探针。
亲和纯化一般程序如下：将制备好的探针与选定的细胞（组织）裂解液孵育一段时间后，经过大量缓冲液洗涤除去非特异性无关蛋白质后，使用过量的游离配体或高盐缓冲液或蛋白质变性剂洗脱特异性结合的蛋白质，将洗脱上清进行SDS-PAGE分析，目标条带切下后通过消化酶处理进行质谱检测。相对于基质固定形探针，标签类功能探针合成周期长，成本耗费大，且常常采用竞争结合方法作为对照路线区分特异性结合蛋白条带。由于大多数生物活性化合物水溶性差，又为亲和纯化增加了难度。
发明内容
本发明公开一种可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子，在引入含有羧基的（SH）n-COOH中间分子的同时形成二硫键，所述羧基化位点用于连接4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺（AEBSA）的氨基基团，可用于选择性固定磺胺药物后进行靶蛋白亲和纯化。
本发明中的磁性二氧化硅纳米粒子具有良好的磁响应性，在反应洗涤的过程中可以迅速的经外加磁场分离，加快实验进程。固定AEBSA后的材料能够通过打断二硫键快速的释放靶蛋白，非特异性背景噪音极小，为后续亲和纯化未知化合物靶点奠定了基础，提高亲和纯化的效率。二硫键的引入也为后续靶点识别与鉴定实验消除了大部分的非特异性蛋白干扰，便于靶蛋白的分离和释放。该合成方法工艺简单、成本低、适用范围广；合成产物生物相容性好，可通过外加磁场操纵。
第一方面，本发明提供了一种可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子（Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA）的制备方法，所述制备方法是：
将100 mg的Fe3O4@SiO2-SS-MPA、50-70 mg的4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺（AEBSA）、300-500 mg的N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺（EDC）、300-500 μL的三乙胺在20 mL甲醇振荡。
优选地，所述制备方法是：
将100 mg的Fe3O4@SiO2-SS-MPA、60 mg的4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺（AEBSA）、400mg的EDC、400 μL的三乙胺在20 mL甲醇振荡。
具体地，所述AEBSA的结构是为：
。
其中，所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA可以是常规方法所制备得到的。
更优选地，所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA是通过以下步骤制备得到的：
步骤1）、将100 mg Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子分散于20 mL甲醇中，加入1-3 mL氨水和500-700 μL的3-巯基丙基三乙氧基硅烷（MPTES），反应24 h后得到Fe3O4@SiO2-SH；
步骤2）、取100 mg步骤3）制备得到的Fe3O4@SiO2-SH溶于5 mL甲醇中，外加150-250mg的二硫二吡啶（DTDP），室温避光反应12 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-Py；
步骤3）、取100 mg步骤4）制备得到的Fe3O4@SiO2-SS-Py溶于5 mL甲醇中，加入到1.5-2.1 mL的3-巯基丙酸（MPA），避光室温振荡24 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-MPA。
优选地，所述Fe3O4@SiO2的制备方法是：步骤1）、将0.8-1.2 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、1.08 g的六水合三氯化铁、2-4 g的无水乙酸钠加入至40 mL乙二醇中，搅拌溶解后转移至反应釜，200 ℃反应10 h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；步骤2）、将50 mg步骤1）制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入60 mL无水乙醇和4 mL去离子水，分散均匀；加入2-4mL氨水，再次分散均匀；将200-400μL的正硅酸乙酯加入至15 mL的无水乙醇中后，加入至上述反应体系中，继续超声处理，得到Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子。
优选地，所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA的制备方法是：
步骤1）、将1 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、1.08 g的六水合三氯化铁、3g的无水乙酸钠加入至40 mL乙二醇中，搅拌溶解后转移至反应釜，200 ℃反应10 h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2）、将50 mg步骤1）制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入60 mL无水乙醇和4 mL去离子水，分散均匀；加入3 mL氨水，再次分散均匀；将300 μL的正硅酸乙酯加入至15 mL的无水乙醇中后，加入至上述反应体系中，继续超声处理，得到Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子；
步骤3）、将100 mg 步骤2）制备得到的Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子分散于20 mL甲醇中，加入2 mL氨水和600 μL的3-巯基丙基三乙氧基硅烷，反应24 h后得到Fe3O4@SiO2-SH；
步骤4）、取100 mg步骤3）制备得到的Fe3O4@SiO2-SH溶于5 mL甲醇中，外加200 mg的二硫二吡啶，室温避光反应12 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-Py；
步骤5）、取100 mg步骤4）制备得到的Fe3O4@SiO2-SS-Py溶于5 mL甲醇中，加入到1.8 mL的MPA，避光室温振荡24 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-MPA。
另一方面，本发明提供了以上制备方法所制备得到的可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子（Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA）。
另一方面，本发明提供了以上可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子（Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA）在亲和纯化生物活性小分子中的应用。
具体地，所述硅纳米粒子也可以称为亲和探针。
优选地，所述生物活性小分子与磺胺药物具有特异性亲和活性，更具体地，与AEBSA具有特异性亲和活性。
优选地，所述生物活性小分子包括碳酸酐酶2（CA2）。
另一方面，本发明提供了通过以上纳米粒子亲和纯化生物活性小分子的方法，所述方法包括：
步骤1）、 纳米粒子与样本孵育后，清洗；
步骤2）、还原剂处理后回收蛋白进行鉴定。
优选地，所述生物活性小分子与磺胺药物具有特异性亲和活性，更具体地，与AEBSA具有特异性亲和活性。
优选地，所述生物活性小分子包括碳酸酐酶2（CA2）。
优选地，所述还原剂是二硫还原剂。
优选地，所述二硫还原剂包括三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）、二硫苏糖醇（DTT）。
优选地，所述回收可以是通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）并用银染显色，切下凝胶中指示条带。
优选地，所述鉴定可以是通过色谱或质谱方法分析鉴定所得肽来鉴定目标蛋白质或肽。
具体地，所述色谱方法例如离子交换色谱，疏水色谱，凝胶过滤色谱，亲和色谱，反相色谱，等电点色谱，毛细管电泳等；所述质谱方法例如双聚焦质谱仪，四级质谱仪，飞行时间质谱仪，傅里叶变换质谱仪，离子回旋加速质谱仪等。
更优选地，所述方法具体是：
1）将样品（细胞裂解液）与所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA纳米粒子室温孵育2 h，加入溶于PB缓冲液的TCEP，处理3 h，超滤离心管将上清液浓缩，加入SDS上样缓冲液，混合均匀并在100 ℃下煮沸5分钟；剩余珠子加入50 µL 1:4去离子水稀释的SDS上样缓冲液并在100 ℃下煮沸5 min；
2）通过SDS-PAGE并用银染可视化，回收条带进行消化，并通过超高效液相系统EASY-nLC 1200与超高分辨三合一质谱仪Orbitrap Fusion Lumos联合进行分析。
优选地，可以以不加入TCEP的实验组作为对照。
优选地，所述样本中含有蛋白成分，例如来自于人体的样品例如细胞、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液等；所述细胞也可以，也可以是来自环境的样品。例如细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一个可转换巯基功能化磁性二氧化硅亲和探针的制备方法，通过引入含有羧基的（SH）n-COOH中间分子的同时形成二硫键，其羧基化位点用于连接AEBSA的氨基基团，选择性固定磺胺药物后进行靶蛋白亲和纯化。在此，将4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺（AEBSA）作为模型，通过亲和下拉AEBSA的靶蛋白碳酸酐酶2（CA2）来验证方法的可行性。结果如图9所示，证明此探针首先可以富集相应生物活性化合物靶蛋白，进而通过打断二硫键成功释放相应靶蛋白。
2、本发明中的磁性二氧化硅纳米粒子具有良好的磁响应性，在反应洗涤的过程中可以迅速的经外加磁场分离，加快实验进程。固定AEBSA后的材料能够通过打断二硫键快速的释放靶蛋白，非特异性背景噪音极小，为后续亲和纯化未知化合物靶点奠定了基础，提高亲和纯化的效率。
附图说明
图1为本发明所涉及的合成路线图。
图2为本发明所涉及的研究应用流程图。
图3为Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）的透射电镜图。
图4为Fe3O4、Fe3O4@SiO2的磁滞回曲线。
图5为Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）、Fe3O4@SiO2-SH（c）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA（d）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA（e）的傅里叶变换红外光谱图。
图6为AEBSA标准溶液（a）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA使用断键分子TCEP（b）或不使用TCEP（c）处理3 h后的上清液紫外吸收图谱。
图7为Fe3O4@SiO2-SS-MPA（a）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA（b）的X射线光电子能谱。
图8为DTT裂解Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA的二硫键后所得上清液的质谱色谱图。
图9为SDS-PAGE凝胶电泳对红细胞体系亲和纯化的鉴定结果：（1）Maker；（2）标准CA；（3）稀释8倍后的红细胞裂解液；（4）TCEP处理后的粒子上的残余蛋白；（5）TCEP处理后的上清；（6）PB缓冲液（PH=7.4）处理后的粒子上的残余蛋白；（7）PB缓冲液（PH=7.4）处理后的上清。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA纳米粒子的制备
1、制备步骤
步骤1、制备Fe3O4@SiO2-SH巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子
（1）制备四氧化三铁（Fe3O4）磁性纳米粒子：
取40 mL乙二醇于锥形瓶中，外加1 g（0.8-1.2 g皆可）聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐，温水浴中磁力搅拌至完全溶解。放凉至室温后，加入1.08 g的六水合三氯化铁（FeCl3∙6H2O）和3 g（2-4 g皆可）无水乙酸钠（NaAC）搅拌20 min。搅拌结束后将混合溶液放置到反应釜中，200 °C反应10 h。反应结束后，乙醇和水各洗三次后，加入20 mL去离子水定量，4 ℃保存。
（2）制备磁性二氧化硅（Fe3O4@SiO2）纳米粒子
取50 mg Fe3O4放入三颈瓶中，外加60 mL无水乙醇和4 mL去离子水，超声处理15min后，加入3 mL（2-4 mL皆可）氨水，再次超声分散均匀；将300 μL（200-400 μL皆可）的正硅酸乙酯加入至15 mL的无水乙醇中，加入至上述三颈瓶中，继续超声处理90 min。反应结束后，所得产物在外加磁场的作用下用乙醇和去离子水分别洗3次，即得Fe3O4@SiO2，烘箱干燥备用。
（3）制备Fe3O4@SiO2-SH
取100 mg的Fe3O4@SiO2，加入20 mL甲醇溶液超声使之分散均匀，转移至三颈瓶中继续超声5 min。超声结束后，加入2 mL（1-3 mL皆可）氨水和600 μL（500-700 μL皆可）的3-巯基丙基三乙氧基硅烷（MPTES）继续超声5 min。机械搅拌24 h后，用甲醇和水洗涤数次，烘箱干燥保存。
步骤2、生物活性化合物的选择性固定：
（1）制备Fe3O4@SiO2-SS-Py
称取100 mg的Fe3O4@SiO2-SH，加入5 mL的甲醇溶液超声使之均匀分散，继续加入200 mg（150-250 mg皆可）二硫二吡啶，该混合物在摇床上反应12 h。反应结束后，甲醇洗涤数次，即为Fe3O4@SiO2-SS-Py。
（2）制备Fe3O4@SiO2-SS-MPA
将1.8 mL（1.5-2.1 mL皆可）3-巯基丙酸（MPA）溶于5 mL甲醇溶液中，随即加入100mg Fe3O4@SiO2-SS-Py，室温下避光反应24 h。所得产物并用甲醇洗涤数次。
（3）制备Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA
取100 mg的Fe3O4@SiO2-SS-MPA溶于20 mL甲醇中，加入60 mg（50-70 mg皆可）的氨乙基苯磺酰胺（AEBSA）、400 mg（300-500 mg皆可）的EDC，400 μL（300-500 μL皆可）的三乙胺，避光室温振荡8 h后，甲醇和水洗涤数次，4 °C保存备用。
2、制备效果验证：
图3为Fe3O4（A）和Fe3O4@SiO2（B）的透射电子显微镜（TEM）电镜图。图A中Fe3O4纳米粒子的平均直径为250 nm，图B中Fe3O4@SiO2纳米粒子平均直径为320 nm，硅层厚度为35nm。表明本发明合成的磁硅纳米粒子有良好的形貌特征，大小均一且分散良好。
图4为Fe3O4、Fe3O4@SiO2的磁滞回曲线。结果显示两种纳米粒子都表现出典型的超顺磁性。其中Fe3O4和Fe3O4@SiO2的最大饱和磁化值分别为48 emu/g和39 emu/g。即使形成核壳结构后磁响应值有所下降，但磁硅纳米粒子的磁性仍然足够强，能够通过外部磁场快速分离。
图5是傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）的表征，分别为Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）、Fe3O4@SiO2-SH（c）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA（d）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA（e）的FTIR图谱。从图中可以看到巯基功能化的磁硅纳米粒子（Fe3O4@SiO2-SH）的红外图谱中出现2540 cm-1处的SH基团信号峰，在2923 cm-1处出现MPTES亚甲基C-H的伸缩振动，表明巯基已成功修饰在磁硅纳米粒子表面。经两次巯基-二硫交换反应后，Fe3O4@SiO2-SS-MPA中-SH信号消失，同时出现1715 cm-1处羧基的信号峰，结果证明了Fe3O4@SiO2-SS-MPA材料的合成成功。图5（e）中1715 cm-1处的羧基峰消失，这表示AEBSA以化学键的方式成功接枝在磁性二氧化硅纳米粒子表面。
图6为Fe3O4@SiO2-SS-MPA（a）、Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA（b）的X射线光电子能谱（XPS）。图6（b）相对于a曲线来说，XPS分析中出现N元素的信号，结果表明AEBSA的修饰成功。
图7为DTT打断Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA的二硫键后所得上清液的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）色谱图片。观察到一个与预期衍生物即去质子化MPA-AEBSA分子量相对应的色谱峰。结果表明通过酰胺缩合已成功固定小分子配体AEBSA，即Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA成功制备。
实施例二、磺胺药物的靶点亲和纯化实验
取实施例一所制备的Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA纳米粒子进行磺胺药物的靶点亲和纯化实验。
采集健康志愿者血液于涂有柠檬酸钠的蓝色采血管中，2500 rpm离心10 min后取下层红细胞。随后用PBS缓冲溶液洗涤三次，加入红细胞体积的7倍的RIPA裂解液，冰上裂解数次，直至裂解完全，收集定量。
使用时将红细胞裂解液用结合缓冲液稀释至8×，与30 mg Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA纳米粒子室温孵育2 h。经过广泛洗涤后，将材料分为二等份，其中第一份加入20 mMTCEP（溶于20 mM PH=7.4的PB缓冲液中）、第二份加入20 mM PB缓冲液（PH=7.4），同步处理3h，用10 kDa超滤离心管（Amicon-Ultra-15）将上清液浓缩至40 μL左右，加入10 μL SDS上样缓冲液，混合均匀并在100 ℃下煮沸5分钟。剩下的珠子加入50 µL 1:4去离子水稀释的SDS上样缓冲液并在100 ℃下煮沸5分钟。所有变性的蛋白样品通过SDS-PAGE分析并用银染可视化。
如图8所示，在TCEP处理的组别中出现一明显条带与标准CA位置相同（泳道5），但在对照组PB缓冲液（PH=7.4）（泳道7）中不存在，表明从内源性红细胞体系中，能特异性释放靶蛋白碳酸酐酶2（CA2）。在泳道4与泳道6中，发现在标准CA2位置处都有明显富集，表明Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA的确能够富集相应位置处靶点蛋白。在两组的处理上清中，非特异性蛋白背景极少，充分体现了引入二硫键后的优势。
为了验证切下条带中是否含有CA2，将条带按照说明书描述程序使用Thermo-Scientific Easype Mini MS样品制备试剂盒进行消化处理。LC-Nano spray ESI-MS分析通过超高效液相系统EASY-nLC 1200与超高分辨三合一质谱仪Orbitrap Fusion Lumos联合进行。使用Uniprot人蛋白质组UP000005640（74788个序列条目）搜库。
表1、凝胶内胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析后鉴定的CA2肽
*代表非唯一肽
如表1所示，从图9指示条带中检测到CA2且序列覆盖率为57%，识别到12个肽段，包括10个唯一肽。基于MS结果，我们得出结论，AEBSA修饰的可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子可以亲和富集CA2，且在二硫还原剂TCEP的作用下释放CA2，大大减少了质谱鉴定样品的复杂性，提高鉴定结果的准确性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种可转换巯基功能化磁性二氧化硅纳米粒子的制备方法，所述制备方法是将100mg的Fe3O4@SiO2-SS-MPA、50-70 mg的4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺、300-500 mg的EDC和300-500 μL的三乙胺在20 mL甲醇中振荡得到的。
2.如权利要求1所述制备方法，所述制备方法是将100 mg的Fe3O4@SiO2-SS-MPA、60 mg的4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺、400 mg的EDC和400μL的三乙胺在20 mL甲醇中振荡得到的。
3.如权利要求1所述制备方法，所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA是通过以下步骤制备得到的：
步骤1）、将100 mg 的Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子分散于20 mL甲醇中，加入1-3 mL氨水和500-700 μL的3-巯基丙基三乙氧基硅烷，反应24 h后得到Fe3O4@SiO2-SH；
步骤2）、取100 mg步骤3）制备得到的Fe3O4@SiO2-SH溶于5 mL甲醇中，外加150-250 mg的二硫二吡啶，室温避光反应12 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-Py；
步骤3）、取100 mg步骤4）制备得到的Fe3O4@SiO2-SS-Py溶于5 mL甲醇中，加入到1.5-2.1 mL的3-巯基丙酸，避光室温振荡24 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-MPA。
4.如权利要求1所述制备方法，所述Fe3O4@SiO2-SS-MPA是通过以下步骤制备得到的：
步骤1）、将1 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、1.08 g的六水合三氯化铁、3g的无水乙酸钠加入至40 mL乙二醇中，搅拌溶解后转移至反应釜，200 ℃反应10 h，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
步骤2）、将50 mg步骤1）制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入60 mL无水乙醇和4 mL去离子水，分散均匀；加入3 mL氨水，再次分散均匀；将300 μL的正硅酸乙酯加入至15 mL的无水乙醇中后，加入至上述反应体系中，继续超声处理，得到Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子；
步骤3）、将100 mg步骤2）制备得到的Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子分散于20 mL甲醇中，加入2mL氨水和600 μL的3-巯基丙基三乙氧基硅烷，反应24 h后得到Fe3O4@SiO2-SH；
步骤4）、取100 mg步骤3）制备得到的Fe3O4@SiO2-SH溶于5 mL甲醇中，外加200 mg的二硫二吡啶，室温避光反应12 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-Py；
步骤5）、取100 mg步骤4）制备得到的Fe3O4@SiO2-SS-Py溶于5 mL甲醇中，加入到1.8 mL的MPA，避光室温振荡24 h，得到Fe3O4@SiO2-SS-MPA。
5.权利要求1-4任意一种制备方法所制备得到的纳米粒子Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA。
6.权利要求5所述纳米粒子Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA在亲和纯化生物活性小分子中的应用，所述生物活性小分子与磺胺药物具有特异性亲和活性。
7.如权利要求6所述应用，所述生物活性小分子是碳酸酐酶2。
8.一种通过权利要求5所述纳米粒子Fe3O4@SiO2-SS-MPA-AEBSA亲和纯化生物活性小分子的方法，所述方法包括：
步骤1）、纳米粒子与样本孵育后，清洗；
步骤2）、还原剂处理后回收蛋白并进行鉴定；
所述生物活性小分子与磺胺药物具有特异性亲和活性。
9.如权利要求8所述方法，所述生物活性小分子是碳酸酐酶2。
10.如权利要求8所述方法，所述还原剂是三（2-羧乙基）膦盐酸盐、二硫苏糖醇。
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-
2024
- 2024-02-21 CN CN202410190418.7A patent/CN117732437A/zh active Pending
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