CN114732783A - 一种盐酸多西环素溶液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种盐酸多西环素溶液，每100L溶液采用如下组分：以多西环素计10‑40kg的盐酸多西环素，抗氧化剂0.2‑0.8kg，增效剂0.5‑2.0kg，稳定剂4‑16L，溶剂余量；抗氧化剂为特丁基对苯二酚；增效剂为L‑苹果酸和无水柠檬酸；稳定剂为聚乙二醇400；溶剂为1,2‑丙二醇。制备方法包括在氮气环境中按特定的顺序加热溶解物料后制成盐酸多西环素溶液。此配方组成科学合理，工艺独特，可稳定储存、抑菌效果好，可注射也可口服，方便治疗猪、鸡由革兰氏阳性菌、阴性菌引起的大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病以及支原体引起的呼吸道疾病；治疗水产动物由弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等引起的细菌性疾病。

Description

一种盐酸多西环素溶液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽药制剂技术领域，特别是涉及一种盐酸多西环素溶液的配方、制备方法和应用。

背景技术

盐酸多西环素(Doxycycline Hyclate)也被称之为盐酸脱氧土霉素或盐酸强力霉素，是一种四环素类广谱抗生素，具有广谱抑菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和支原体等都有较好的杀菌效果，常用来治疗病原菌引起的呼吸道疾病和胃肠道疾病。目前，兽医临床使用的盐酸多西环素制剂主要有注射液、片剂、可溶性粉、胶囊剂、子宫注入剂等。微囊技术、缓控释技术、脂质体技术等新型制剂工艺的发展为盐酸多西环素制剂的发展提供了很大空间。其中片剂、粉剂给药时容易造成给药不均的现象，易受到胃肠内容物、饲料、水质等影响，以固体形式投入水体中，溶解较慢，容易沉积在底部，并且其所含有的葡萄糖等可能会使水体发生营养化的问题，导致饮水管线中的细菌滋生；而胶囊剂、子宫注入剂、注射液在面对群体使用时需要面对给药频繁、步骤多、使用不方便、动物应激等问题，微囊技术、缓控释技术、脂质体技术对设备原材料要求均较高，因此开发一种方便、稳定、效果好的口服溶液剂型具有十分重要的意义。

盐酸多西环素以固体形式存在的时候较为稳定，在溶液中则会因为发生氧化、水解、异构化等多种降解反应而出现不稳定的情况，从而限制了盐酸多西环素在制备液体剂型方面的应用。

目前，通常采用盐酸多西环素与金属离子络合的手段使其形成络合物来提高盐酸多西环素的稳定性，如CN102144967B、CN102772360B，但是金属离子与多西环素形成络合物的同时也会加速药物的氧化变色，因此，采用此种方法制备的盐酸多西环素注射液长时间放置后颜色变得很深，有色杂质增多，氧化产物增加较快，且本领域技术人员研究发现若使用该已公开的发明注射液口服会影响盐酸多西环素的吸收。

CN110664744B体系中仍有不少的水，虽加入尿素、抗氧剂、依地酸二钠提高稳定性，但是该发明的加热时间为0.5-2h，加热时间过长会导致盐酸多西环素溶液的有关物质增多等问题。

CN105012320A使用二甲基甲酰胺等有机溶剂，目前国内生产的均为工业级，尚未达到药用辅料的生产标准要求，若使用试剂级的，生产成本则会大大增加，且其使用的安全性不可确定，二甲基甲酰胺易燃，遇明火、高热、氧化剂接触有引起燃烧爆炸的危险，闪点仅为58℃，与皮肤接触有刺激症状，会出现水泡、瘙痒、灼痛；若以二甲基乙酰胺溶解盐酸多西环素，初始可以溶解，但随着搅拌进行又有盐酸多西环素析出，并不能完全溶解；该发明有水存在，其他稳定剂不足以使盐酸多西环素溶液保持稳定。

CN114028410A使用没食子酸丙酯可以起到一定的抗氧化效果，但是其易与铜、铁等离子发生呈色反应，虽加入柠檬酸避免发生呈色反应，但是其作用仍然有限；该发明使用柠檬酸本身含有结晶水，对于盐酸多西环素溶液整个体系是不稳定的；该发明使用的制备容器为烧杯，在实验室中可能很好达到，但是对于企业来说更多的是使用不锈钢/搪玻璃/塑料等材质的反应釜，极少使用玻璃材质的；且该发明每100mL溶液剂使用的溶剂有5～30mL乙醇，如果放大至生产企业生产，对于乙醇不管是使用、运输还是储存均存在一定危险性。

发明内容

基于此，本发明提供了一种盐酸多西环素溶液及其制备方法，配方组成科学合理，工艺独特，可以稳定储存、抑菌效果好、可注射也可口服使用，方便治疗猪、鸡由革兰氏阳性菌、阴性菌引起的大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病以及支原体引起的呼吸道疾病；治疗水产动物由弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等引起的细菌性疾病。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种盐酸多西环素溶液，每100L溶液中采用如下组分：以多西环素计10-40kg的盐酸多西环素，抗氧化剂0.2-0.8kg，增效剂0.5-2.0kg，稳定剂4-16L，溶剂余量；

其中，所述的抗氧化剂为食品添加剂特丁基对苯二酚；

所述的增效剂为L-苹果酸和无水柠檬酸，质量比为1:1；

所述的稳定剂为聚乙二醇400；

所述的溶剂为1,2-丙二醇。

优选地，所述的盐酸多西环素溶液每100L中，盐酸多西环素(以多西环素计):抗氧化剂:增效剂:稳定剂＝50kg:1kg:2.5kg:20L。

优选地，所述的特丁基对苯二酚含量(以C₁₀H₁₄O₂计)≥99.0wt％。

优选地，所述的L-苹果酸水分≤2.0wt％，按无水物计算C₄H₆O₅含量不得少于99.0wt％，无水柠檬酸水分≤0.5wt％，柠檬酸含量为99.5～100.5wt％。

优选地，所述的聚乙二醇400水分不得过1.0wt％。

优选地，所述的1,2-丙二醇水分≤0.2wt％，相对密度1.035～1.037。

优选地，所述一种盐酸多西环素溶液的制备方法，采用如下组分：以多西环素计10-40kg的盐酸多西环素；特丁基对苯二酚0.2-0.8kg；L-苹果酸和无水柠檬酸合计0.5-2.0kg，质量比为1:1；聚乙二醇400 4-16L；1,2-丙二醇作为余量补充至100L溶液；制备步骤如下：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、无水柠檬酸、L-苹果酸，边搅拌溶解边加热至70-75℃，加入处方量盐酸多西环素，体系温度降至60-65℃，保持温度，搅拌至充分溶解，冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装，即得所述盐酸多西环素溶液；也可以按注射液要求进行注射剂的常规工艺处理，即得所述盐酸多西环素注射液。

优选地，所述反应设备为可加热、密封的设备，且制备全程在氮气环境中进行。

优选地，所述一种盐酸多西环素溶液的应用，以多西环素计：

(1)混饮：每1L水，猪25～50mg，鸡300mg，连用3～5日；

(2)肌内注射：一次量，每1kg体重，猪5～10mg，一日一次，连用2～3日；

(3)用于治疗水产动物时，拌饵投喂：每吨饲料添加30～50mL，连用3～5日。

采用上述方案后，本发明的有益效果是：

(1)反应设备可加热、密封且可使制备过程充满氮气，可以使原料在特定的温度下加快溶解，不会破坏盐酸多西环素的含量，有关物质控制在较低范围内，还可以因制备过程在氮气环境中进行，而隔绝氧气，避免盐酸多西环素的氧化。

(2)本发明设定的溶解加热温度为70-75℃，因为加入处方量盐酸多西环素后会使体系温度下降至60-65℃，保持这个温度，可以保证在这个温度下用尽量少的时间使盐酸多西环素溶解，避免温度低于60℃溶解得慢，生产效率较低，搅拌时间长，有关物质增多；高于65℃虽溶解时间缩短但是有关物质会增多，溶液颜色会变黑，因此本发明优选了初始加热为70-75℃，加入盐酸多西环素后控制在60-65℃的加热温度。

(3)加入的抗氧化剂从二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、甲醛合次硫酸氢钠、亚硫酸钠等抗氧化剂中优选特丁基对苯二酚(TBHQ)，TBHQ相对BHT、BHA和PG的抗氧化性能更好，耐高温，且不会与铜、铁发生呈色反应，有文献报道TBHQ与一些有机酸如柠檬酸搭配可提高TBHQ活性，但是经试验TBHQ单纯与柠檬酸或抗坏血酸(维生素C)等其他有机酸的搭配都不如与特定比例的L-苹果酸、无水柠檬酸的搭配抗氧化、稳定的作用更好。

(4)加入的与TBHQ、盐酸多西环素成特定比例的增效剂L-苹果酸和无水柠檬酸，不仅L-苹果酸本身具有抗氧化性，与无水柠檬酸搭配可以使TBHQ更好地增效，更好地协同抗氧化，维持盐酸多西环素溶液的稳定性，本发明加入的无水柠檬酸是与L-苹果酸协同为TBHQ增效，又不会使其因为要避免没食子酸丙酯和铜铁离子反应就先内耗，而是能够在临床使用中如遇水质有少量钙镁金属离子时，无水柠檬酸也可以优先反应络合，保护溶水后的盐酸多西环素，避免盐酸多西环素被氧化失效；并且无水柠檬酸和L-苹果酸一起搭配有天然果实的风味，掩盖盐酸多西环素本身的苦味，使动物更爱饮水，促进药物吸收发挥作用。相对于其他常见有机酸，如牛磺酸、甘氨酸不管是常温还是加热后均不能在丙二醇溶剂中完全溶解，富马酸、山梨酸、尿素、水杨酸、酒石酸、维生素C均需加热后才可完全溶解，在后续其他稳定性试验中也证明这些可溶解酸的增效稳定作用不如无水柠檬酸与L-苹果酸的搭配。

(5)加入的溶剂从水、聚乙二醇200、聚乙二醇400、丙三醇、二甲基乙酰胺等常见溶剂中优选了1,2-丙二醇，1,2-丙二醇既可以溶解TBHQ、L-苹果酸、无水柠檬酸、盐酸多西环素，且其水分≤0.2％，不在溶液体系中引入水分，又可以降低产品的冰点(理论上可耐至-40℃)，使低温下产品也能正常使用。而聚乙二醇200、聚乙二醇400不能完全溶解处方量的盐酸多西环素；聚乙二醇600过于黏稠不好分散物料；丙三醇虽可以溶解其他组分，但是因其本身水分和吸水性较强，在后续储存中稳定性较差；有机溶剂二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺从安全性和成本考虑，也不是最佳选择；吐温80、聚氧乙烯蓖麻油常温或加热后均不能使无水柠檬酸和盐酸多西环素完全溶解。

(6)若以聚乙二醇400为溶剂替代1,2-丙二醇，不能完全溶解本发明处方量的盐酸多西环素，但是经过试验，我们发现与其他组份成特定比例的聚乙二醇400与1,2-丙二醇搭配按照特定步骤配制，可以使单独溶剂为1,2-丙二醇的盐酸多西环素溶液吸湿性降低，减少水分的影响，更有利于与抗氧化剂TBHQ和L-苹果酸一起起到稳定溶液体系的作用。相对于CN114028410A(对比例5)先加入无水乙醇再加热，会使得反应釜内气压增大，对设备要求高，对后续投料也存在安全隐患，不适合工业化大批量生产。

(7)制得的盐酸多西环素溶液既可注射又可口服，配方组成科学合理，工艺独特，不会给动物带来刺激性，可以稳定储存、抑菌效果好、可以与水任意比例互溶，可在冬天北方等低温环境中使用，溶解于水中24h也能保持含量稳定，方便养殖现场依据需要治疗猪、鸡、水产动物由革兰氏阳性菌、阴性菌引起的大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病以及支原体引起的呼吸道疾病；治疗水产动物由弧菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等引起的细菌性疾病。

附图说明

图1是本发明所涉及盐酸多西环素溶液在加速六个月后性状对比图(正视图)，从左至右由深至浅依次为：对比例5(试验配方②)、对比例5(试验配方①)、实施例6、实施例5；

图2是本发明所涉及盐酸多西环素溶液在加速六个月后性状对比图(俯视图)，从左至右由深至浅依次为：对比例5(试验配方②)、对比例5(试验配方①)、实施例6、实施例5；

图3是市售盐酸多西环素可溶性粉在6g/10mL(以多西环素计)浓度下的溶水情况；

图4是实施例5盐酸多西环素溶液在6g/10mL(以多西环素计)浓度下的溶水情况；

图5是对比例5(试验配方①)最小抑菌浓度(MIC)试验结果，试验菌：大肠杆菌，从左至右标号a1-a10依次为(以多西环素计)浓度256、128、64、32、16、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL、阳性对照和阴性对照；

图6是实施例1最小抑菌浓度(MIC)试验结果，试验菌：大肠杆菌，从左至右标号b1-b10依次为(以多西环素计)浓度256、128、64、32、16、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL、阳性对照和阴性对照；

图7是市售盐酸多西环素可溶性粉最小抑菌浓度(MIC)试验结果，试验菌：大肠杆菌，从左至右标号e1-e10依次为(以多西环素计)浓度256、128、64、32、16、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5μg/mL、阳性对照和阴性对照。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

注：以下所列举对比例和实施例除特别标明，其余单位均为kg。

对比例1(CN110664744B)：

制备工艺：(1)将抗氧剂和依地酸二钠用1-5g水溶解，然后加入1,2-丙二醇混合，搅拌均匀，制成混合溶液；

(2)在所述混合溶液中加入盐酸多西环素和尿素，混合搅拌并控温加热，然后冷却至室温，用水补足为100mL，过滤后分装，封装时充氮气灌封，即得盐酸多西环素溶液。

优选地，所述控温加热的温度为20-60℃，所述控温加热的时间为0.5-2h。

优选地，所述控温加热的温度为30-50℃，所述控温加热的时间为1-1.5h。

对比例2(CN102144967B)：

制备工艺：(1)将计量好的络合剂和抗氧化剂加入部分注射用溶剂中搅拌混合均匀；

(2)在溶液(1)中加入多西环素或盐酸多西环素，边搅拌边升温反应至溶液澄清透明，控制反应温度为40～80℃，保温反应时间为10-100分钟，在络合反应的同时调节PH值至7.0～7.5，促进反应进行；得到多西环素溶液；

(3)取二甲基乙酰胺30ml，加入甲氧苄啶，搅拌至完全溶解，得甲氧苄啶溶液；

(4)将甲氧苄啶溶液加入多西环素溶液中，搅拌均匀并调pH值至4.0～6.5，补注射用水至配比量；

(5)用钛棒或滤膜过滤，分装在安瓿瓶或西林瓶中，灭菌后即得成品。

对比例3(CN105012320A的实施例2)：

制备工艺：(1)将多西环素与络合剂10kg缓慢加入到有机溶剂(二甲基甲酰胺)中；

(2)将步骤(1)得到的溶液加热至40～80℃，并连续均匀搅拌20～100分钟

(3)在步骤(2)得到的溶液中缓慢加入氟苯尼考，搅拌至溶解，加入有机溶剂1,2-丙二醇，作为有机相；

(4)将抗氧剂、络合剂0.1kg水溶性高分子、增溶剂加入到水中，搅拌至溶解，作为无机相；

(5)将上述无机相缓慢加入到有机相中，搅拌20～60分钟。

对比例4(CN102772360B)：

制备工艺：(1)将0.25～1.0克抗氧剂和1.0～5.0克水溶性高分子化合物稳定剂溶于注射用水中，或者将0.25～1.0克抗氧剂溶于注射用水中，得到一种水溶液，移取以体积计60～75％所述水溶液，加到45～80克有机溶剂中，混合均匀得到一种混合液；

(2)往步骤(1)得到的混合液中依次加入镁离子化合物络合剂和15～25克以多西环素计的盐酸多西环素，其络合剂与多西环素的摩尔比为1.0～1.8：1；然后在温度50～65℃下用pH调节剂将其混合液的pH值调节至3.0-6.0，接着搅拌直至得到一种黄色透明液体；

(3)然后，在温度50～65℃下保温5～20分钟；再往其中加入0.01～0.05克EDTA-2Na金属离子螯合剂与以体积计25～40％步骤(1)的水溶液，溶解混匀后再使用pH调节剂将其pH值调节至3.0～5.0；接着用注射用水加至总量100mL，进行有机滤膜过滤，收集滤液，充氮气分装，将其残氧量控制在以所述注射液体积计3％以下，然后用流通流通蒸汽灭菌，得到所述的兽用盐酸多西环素注射液。

对比例5(CN114028410A)：

制备工艺：(1)在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇，加入无水乙醇，再依次加入抗氧化剂和络合剂，逐渐加热至50～65℃待试剂充分溶解；

(2)保持温度，加入盐酸多西环素，搅拌溶解后冷却；

(3)冷却后，用定容溶剂定容至100mL，过滤灌封，灌封前后向容器内充入氮气以防溶液剂氧化。

此对比例5中制备工艺需要先加乙醇再加热，乙醇易挥发，对设备要求比较高，要一定的抗压能力。

采用试验配方②配制需要较长时间。

对比例6-20、75-80：对比不同增效剂与其他成分组合的情况

对比例21-30：对比不同抗氧化剂与其他成分组合的情况

对比例31-38：对比不同稳定剂与其他成分组合的情况

对比例39-51：对比不同溶剂与其他成分组合的情况

对比例52-56：调整L-苹果酸与其他组分的比例

对比例57-61：调整无水柠檬酸与其他组分的比例

对比例62-66：调整TBHQ与其他组分的比例

对比例67-70：调整聚乙二醇400与其他组分比例

实施例1-6：

对比例6-70、75-80、实施例1-6制备工艺：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量稳定剂，往可加热、密封的反应设备中边搅拌边依次加入处方量抗氧化剂、增效剂，边搅拌溶解边加热至70-75℃，加入处方量盐酸多西环素，体系温度降至60-65℃，保持温度，搅拌至充分溶解，冷却后用溶剂定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装即得所述盐酸多西环素溶液。

对比例71-74：组分配方和实施例5一致，制备工艺有所区别，其中对比例71制备工艺：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、L-苹果酸、无水柠檬酸，边搅拌溶解边加热至60-65℃，加入处方量盐酸多西环素，记录体系温度，搅拌至充分溶解，记录溶解时间。冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装即得所述盐酸多西环素溶液。

对比例72制备工艺：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、L-苹果酸、无水柠檬酸，边搅拌溶解边加热至76-80℃，加入处方量盐酸多西环素，记录体系温度，搅拌至充分溶解，记录溶解时间。冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装即得所述盐酸多西环素溶液。

对比例73制备工艺：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、L-苹果酸、无水柠檬酸、盐酸多西环素，边搅拌溶解边加热至60-65℃，搅拌至充分溶解，记录溶解时间。冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装即得所述盐酸多西环素溶液。

对比例74制备工艺：

取适量1,2-丙二醇(约为总体积60％)和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、L-苹果酸、无水柠檬酸，边搅拌溶解边加热至70-75℃，加入处方量盐酸多西环素，记录体系温度，搅拌至充分溶解。冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，包装即得所述盐酸多西环素溶液。

以上对比例6-80、实施例1-6若注射使用，按注射液要求进行灭菌等注射剂的常规工艺处理。

试验一：本发明所涉及多西环素溶液制备100L溶液时工艺的对比及分析

表1

分析：本发明的实施例5相对对比例2和对比例4无需调节pH；相对对比例1、3、5所选的加热温度范围不同，因此加热时间也不同，按其优选反应时间看，时间由长到短顺序为：对比例5(试验配方②)＞对比例5(试验配方①)≈对比例71＞对比例2、3＞对比例1＞对比例4、5＞对比例72；

对比例3未使用氮气，对比例1在灌封时才使用氮气，实施例5和对比例5生产制备包装过程均在氮气环境中。

对比例5采用先加入乙醇再加热，会导致乙醇受热易挥发，对设备要求较高，需有较好的抗压能力，在后续投料过程中，由于其存在蒸气压会往上冲，对于投料等过程是不安全的。对比例5(试验配方②)比对比例5(试验配方①)多西环素含量提高后，溶解时间就需要延长至3.5h，与相同含量的实施例6相比制备时间多很多；

实施例5比对比例71只是反应温度稍高，对比例71搅拌溶解时间相对就长很多；

实施例5比对比例72反应温度低，对比例72的搅拌溶解时间并没有显著降低，为了生产成本、效率和安全性考虑，没有必要将初始加热温度设置为76-80℃，且经检测温度设置为76-80℃会使得溶液有关物质含量会较高；

实施例5相对对比例73只是先加盐酸多西环素再加热还是先加热至反应温度后再加入盐酸多西环素的区别，可是对比例73的反应时间就明显长很多；

实施例5相对对比例74，实施例5生产制备包装过程均在氮气环境中，而对比例74生产制备包装过程都未使用氮气，经后续稳定性测试证明在氮气环境中制备、包装有利于盐酸多西环素溶液的稳定。

从生产成本和生产效率上来看，优选加热温度至70-75℃，再加入盐酸多西环素的顺序。

考虑养殖现场不同的养殖需求，若口服使用，本发明以包装为PE、PP材质的100mL、500mL、1L塑料瓶进行如下试验，若作为注射液使用，使用安瓿瓶包装进行测试，但是，本发明并不限于材质或规格等实施方式，如出现不同材质、不同规格试验结果有显著差别在试验中会特别说明。

试验二：本发明所涉及多西环素溶液的腐蚀性试验

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、对比例30、实施例5、实施例6方法配制。

金属材料：选用常见生产设备常用材料碳钢、304不锈钢、铁片进行测试。

试验设备：恒温干燥箱、分析天平、滤纸。

试验方法：将各金属圆片充分洗净，放入50℃恒温干燥箱中烘至恒重,精确称取其重量。于本发明所涉及的盐酸多西环素溶液中浸泡360小时。取出金属片：

a.观察金属片的外观光滑程度、是否有斑点、是否有腐蚀区块，进行对比；

b.清除表面腐蚀物，冲洗干净，放入50℃恒温干燥箱中烘至恒重，精确称取金属片重量。

c.按下式计算腐蚀速率(R)

式中，M与M_t分别为浸泡前、后金属片质量(g)；S为金属片表面积(cm²)；

t为浸泡时间(h)；D为金属材料密度(kg/m³)。

304不锈钢密度为：7.92-7.95×10³kg/m³，以7.93×10³kg/m³计算；

碳钢密度为：7.81-7.85×10³kg/m³，以7.83×10³kg/m³计算；

铁片密度为：7.85-7.90×10³kg/m³，以7.88×10³kg/m³计算；

结果的判断：以R≤0.010为基本无腐蚀；0.010≤R＜0.100为轻度腐蚀；0.100≤R＜1.000为中度腐蚀；R＞1.000为重度腐蚀。

试验结果如表2所示：

表2

由表2可知对比例5(试验配方①)、对比例30浸泡于304不锈钢、碳钢、铁片360h后有不同程度的腐蚀，其中以铁片更为明显，而实施例5、6基本无腐蚀。对比例30和实施例5对比可以知道以没食子酸丙酯为抗氧化剂不适用于所有的材质的生产设备，尤其是口服溶液剂型常用的碳钢和304不锈钢或其他含铁成分的反应釜，若长时间使用会腐蚀反应设备，这样就会使得生产企业购置反应设备的成本会增加许多，而实施例5对于纯铁片这种材质也基本无腐蚀，因此设备购置选型时常见的含铁反应釜可以使用。

试验三：本发明所涉及多西环素溶液的外观及含量、有关物质、杂质吸光度情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例1-80、实施例1-6方法配制。

试验方法：

【性状】观察外观是否完全溶解，是否澄清透明以及溶解后的颜色。注射液要求为黄色至棕黄色澄明液体。

【含量测定】色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH值适用范围应大于8)；以0.05mol/L草酸铵溶液-N，N-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液(65:30:5)用氨试液调节pH值为8.0±0.2为流动相；柱温35℃；检测波长：280nm。精密称取土霉素对照品、美他环素对照品、β-多西环素对照品及多西环素对照品各适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解制成每1mL中分别约含80μg的混合溶液，进样测试。理论板数按多西环素峰计算不低于1500，多西环素峰和β-多西环素峰的分离度应符合要求。

测定法取待测样品适量(约相当于多西环素80mg)，精密称定，置100mL量瓶中，加0.01mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置50mL量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取多西环素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中C₂₂H₂₄N₂O₈的含量，用检测结果占理论值的百分数来表示。

【检查】有关物质取待测样品，加0.01mol/L盐酸溶液稀释成每1mL中约含多西环素0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释成每1mL中约含4μg的溶液，作为对照溶液。照【含量】测定项下的色谱条件，精密量取对照溶液与供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，美他环素与β-多西环素峰面积均不得大于对照溶液主峰面积(2.0％)，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(1.0％)，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(4.0％)。

杂质吸光度取待测样品，精密称定，加盐酸溶液(9→100)的甲醇溶液(1→100)溶解并定量稀释制成每1mL中含10mg的溶液，照紫外-可见分光光度法，在490nm的波长处测定，吸光度不得过0.12。

测试结果如表3所示。

注：“/”表示未进行测试。

表3盐酸多西环素溶液检测结果

由表3可以知道，对比例15-23、25、28、29、35、37、38、41、47-51、76、77未能完全溶解，因此可以知道其所采用的依地酸二钠(对比例15)、六偏磷酸钠(对比例16)、三聚磷酸钠(对比例17)、六水氯化镁(对比例18)、氧化镁(对比例19)、无水硫酸镁(对比例20)、甘氨酸(对比例76)、牛磺酸(对比例77)作为增效剂均不能在盐酸溶液体系中溶解；亚硫酸钠(对比例21)、亚硫酸氢钠(对比例22)、焦亚硫酸钠(对比例23)、BHT(对比例25)、硫代硫酸钠(对比例28)、偏重亚硫酸钠(对比例29)作为抗氧化剂不能完全溶解于溶剂中；使用PVP K30(对比例35)、明胶(对比例37)、泊洛沙姆(对比例38)等固体作为稳定剂还需要有其他溶剂进行溶解，在本发明中使用1,2-丙二醇并不能使它们溶解；而使用聚乙二醇200(对比例47)、400(对比例48)、600(对比例49)、吐温80(对比例50)、聚氧乙烯蓖麻油(对比例51)单独作为溶剂均不能使盐酸多西环素完全溶解，因此也不适合作为溶剂，对比例39使用丙三醇、聚乙二醇400虽可以使固体完全溶解，但是溶解时间相对较长；对比例41使用二甲基乙酰胺为溶剂初始可以使盐酸多西环素溶解，但随着搅拌又有固体析出，不能形成溶液，因此也不适合选用二甲基乙酰胺。

另外的话，初始测试对比例3、8(使用一水柠檬酸)、9(使用维生素C)、13(使用一水柠檬酸与L-苹果酸搭配)、34(使用吐温80作为稳定剂)、36(使用聚氧乙烯蓖麻油作为稳定剂)、39(使用丙三醇作为溶剂)、42-45(分别使用α-吡咯烷酮、N-甲基-α-吡咯烷酮、乙酸乙酯作为溶剂)、71-73的有关物质都超过3％，相对其他对比例与实施例1-6的配方和工艺来说起始有关物质值更高，也可以说明对比例71更低反应温度使得反应时间加长、对比例72更高反应温度、对比例73先加盐酸多西环素再加热延长盐酸多西环素的反应时间均会使有关物质增加。因此本发明组分配方中不选用一水柠檬酸(单独)、维生素C(单独)、一水柠檬酸与L-苹果酸搭配作为增效剂；不选用吐温80、聚氧乙烯蓖麻油作为稳定剂；不选用α-吡咯烷酮、N-甲基-α-吡咯烷酮、乙酸乙酯作为溶剂，且对反应温度和相应时间进行优化，选用初始其他辅料和部分溶剂加热至70-75℃，再加入盐酸多西环素，使体系温度降至60-65℃，可以更高效地反应，且有关物质不会增加。

试验四：本发明所涉及多西环素溶液的性状在高温、高湿及加速试验条件下的稳定性情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例1、5(试验配方①、②)、6、7、9、10-12、14、24、26、27、30-33、40、45、46、52-70、74、75、78-80、实施例1-6方法配制。

试验条件：

(1)高温、高湿试验：样品在温度60℃、相对湿度95％±5％，遮光条件下密封放置10天，于第5天和第10天取样。

(2)加速试验：在温度40℃±2℃、湿度75％±5％，遮光条件下密封放置六个月，在第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样。

试验方法：观察外观性状变化等情况。

试验结果如表4-1至表4-2、图1至2所示：

表4-1高温高湿试验相对初始性状测试结果

表4-2加速试验相对初始性状测试结果

高温高湿条件下稳定性测试结果如表4-1所示，由表4-1可以看出对比例26、27、45、46、74在高温高湿试验条件下至第5天就有颜色变深的情况，对比例2-4、5(试验配方②)、6、9、24、30-33、40、57、58、62、63、67、68在高温高湿试验条件下加速至第10天也出现颜色变深的情况；高温高湿试验条件下出现颜色变深情况的对比例不再进行加速试验。

加速试验稳定性结果如表4-2所示，由表4-2可以看出对比例1、5(试验配方①、②)、7、10-12、14、52-56、59-61、64-66、69、70、75、78-80加速至第6个月颜色均有不同程度变深的情况，其中对比例5(试验配方①)、对比例5(试验配方②)、实施例5、实施例6在加速至第6个月性状对比如图1和图2所示，以多西环素计为40％的配方来看对比例5(试验配方②)颜色深于实施例6；以多西环素计为30％的配方来看对比例5(试验配方①)深于实施例5。多西环素含量多少会影响盐酸多西环素溶液颜色，从实施例6颜色深于实施例5可以看出，实施例6虽为40％含量，但加速之后颜色仍比对比例5(试验配方①)(含量30％)加速后颜色浅，因此可以看出本发明所涉及实施例盐酸多西环素溶液外观稳定性效果比对比例更好。另外的话，本发明所涉及盐酸多西环素溶液同含量的初始溶液颜色相差不大，后续“颜色变深”程度如图对比例5(试验配方②)所示、“颜色轻微变深”如对比例5(试验配方①)图片所示。

试验五：本发明所涉及盐酸多西环素溶液在高温、高湿条件和加速试验条件下含量稳定性试验(盐酸多西环素含量、有关物质)

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①、②)、12、14、54-56、59-61、64-66、69-70、实施例1-6方法配制。

试验条件：同试验四的加速试验条件。

试验方法：同试验三的试验方法。

测试结果如表5-1至表5-2所示。

表5-1加速试验含量测试结果(单位：％)

表5-2加速试验有关物质测试结果(单位：％)

由表5-1至表5-2可以看出在加速试验条件下，对比例5(试验配方①、②)、12、14、54-56、59-61、64-66、69-70含量在第6个月相对初始值降解率达3.4％以上，实施例1-6在3.0％以下。对比例5(试验配方①、②)、12、14、54-56、59-61、64-66、69-70在第6个月有关物质相对初始值增加1.9％及以上，实施例1-6相对初始值增加在1％以下，可以看出实施例1-6比其他列举的对比例稳定性更好。

综上，可以看出对比例5(试验配方①、②)、12、14、54-56、59-61、64-66、69-70相对实施例1-6在加速试验条件下更不稳定，因此，柠檬酸作为增效剂(对比例5(试验配方①、②))、L-苹果酸+L-酒石酸组合作为增效剂(对比例12)、无水柠檬酸+维生素C组合作为增效剂(对比例14)、更多的增效剂(对比例54-56、对比例59-61)更多的抗氧化剂(对比例64-66)、更多的稳定剂聚乙二醇400(对比例69-70)不是最优的选择。本案实施例1-6的特定比例的L-苹果酸+无水柠檬酸、TBHQ、聚乙二醇400和1,2-丙二醇组合才是最优的选择。

对比例5提供了一种浓度最高为30％(以多西环素计)的盐酸多西环素溶液，按其最佳处方比例设计更高浓度为40％(以多西环素计)试验配方②，该试验配方②制备时间较长导致有关物质、杂质吸光度增多，在高温高湿试验条件下至第10天出现颜色变深，在加速试验条件下从第3个月颜色开始变深，含量至第6个月下降至91.2％降解率高达9.25％，因此在该比例下的40％(以多西环素计)高含量盐酸多西环素溶液无法稳定，因此长期试验未再进行比较相关数据。

试验六：本发明所涉及多西环素溶液的性状在长期试验条件下的外观稳定性情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、实施例1-6方法配制。

试验条件：

长期试验：在温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％，遮光条件下放置36个月，在第1、3、6、9、12、18、24、36个月末分别取样。

试验方法：观察外观性状变化等情况。

试验结果如表6所示：

表6长期试验相对初始性状测试结果

对比例5(试验配方①)在加速条件下第6个月开始颜色有轻微变深，在长期试验中，在第18个月时颜色就有稍加深，不能保持外观稳定至36个月；而实施例1-6不管是(以多西环素计)低含量(实施例1-4的10-25％)还是含量30％(对比例5试验配方①)还是高含量40％(实施例6)，在加速试验条件下还是在长期试验条件下均可以保持外观无明显变化，外观稳定性均比对比例5(试验配方①)好。

试验七：本发明所涉及盐酸多西环素溶液在长期试验条件下含量稳定性试验(盐酸多西环素含量、有关物质)

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、实施例1-6方法配制。

试验条件：同试验四的试验条件。

试验方法：同试验二。

测试结果如表7所示。

表7长期试验含量稳定性测试结果(单位：％)

由表7可以看出对比例5(试验配方①)在长期试验条件下储存36个月相对初始值降解率高达5.0％，实施例1-6在长期试验条件下储存36个月相对初始值降解率在2.0％以下，相对对比例5(试验配方①)具有更良好的含量稳定性。

试验八：本发明所涉及盐酸多西环素溶液在低温情况下的稳定性试验

试验用盐酸多西环素溶液：采用实施例1-6方法配制。

包装材质：PE。

试验条件：

在温度-18℃、0℃、4℃、遮光条件下放置24小时，测试外观稳定性情况，并测试-18℃放置24h后恢复至室温含量情况，含量结果以检测结果占理论值百分比表示。

试验结果如表8所示。

表8

由表8可以看出在温度-18℃、0℃、4℃情况下，实施例1-6均可以保持良好的流动性，抗冻性能好，在-18℃情况下含量也在理论值99％以上，可以保持较好的稳定性，方便冬天养殖现场可以随取随用，减少了化冻过程。

试验九：本发明所涉及盐酸多西环素溶液残氧量对外观稳定性的影响

氧气会使盐酸多西环素发生缓慢氧化，导致药品产生变色、氧化、变质失效，过多的氧气残留量会影响药品的保质期，因此必须降低包装瓶中氧气的含量以改善药品的保存质量，但目前国家未有标准明确对容器内部空气中氧气含量范围提出具体要求，因此本发明试验中对不同残氧量对盐酸多西环素溶液外观稳定性的影响进行探究，以期对盐酸多西环素溶液的残氧量控制确定范围，更好地改善盐酸多西环素溶液的保存质量。

试验用盐酸多西环素溶液：以实施例6配方以手动充氮控制装置得到不同残氧量数值的样品，由低浓度到高浓度分别标记为样品1-36。

试验条件：

(1)高温、高湿试验条件：样品在温度60℃、相对湿度95％±5％，遮光条件下密封放置10天，于第10天取样。

(2)加速试验：在温度40℃±2℃、湿度75％±5％，遮光条件下放置六个月，在第6个月末取样。

试验方法：使用氧气气体分析仪进行检测出各样品的残氧量。

测试结果如表9所示。

表9

由表9可以看到在相同配方情况下，残氧量为5.5％及以下在高温高湿条件储存10天、加速试验条件下储存6个月颜色无明显变化，残氧量为5.8％时就有轻微变深，影响外观稳定性，本领域技术人员知道残氧量控制得越低说明瓶内氧气越少，也更有利于盐酸多西环素溶液稳定，但是控制残氧量至5％是相对容易的，而若要从残氧量5％降低至3％需要更难达到、更高的生产条件和设备，因此本发明为了使产品避免氧气影响，又不需使残氧量达到3％极低的情况下保持稳定，因此残氧量控制在5.0％以下即可，甚至控制到5.5％也可以。

试验十：本发明所涉及盐酸多西环素溶液残氧量

采用对比例5(试验配方①)、对比例74、实施例1-6方法配制试验用盐酸多西环素溶液，用氧气气体分析仪进行检测出各样品的残氧量。试验结果如表10-1。

表10-1

	残氧量(％)
		对比例5(试验配方①)	3.2
对比例74	20.8
		实施例1	2.4
实施例2	3.6
		实施例3	4.7
实施例4	3.9
		实施例5	3.5
实施例6	4.2

由表9、10-1、结合试验三至七测试结果来看，本发明所涉及的盐酸多西环素实施例1-6残氧量低于5％可以保持盐酸多西环素溶液的稳定性。已公开发明CN114028410A即对比例5，其最佳配方即对比例5(试验配方①)和实施例1-6一样残氧量小于5％，但其稳定性不如实施例1-6，说明其配方和生产工艺需要更低的残氧量、对密封性要求更高的包装条件和储存条件；已授权发明CN102772360B(即对比例4)有提及残氧量需要控制到3％以下盐酸多西环素溶液才会保持稳定，但是在本发明的配方下控制到5％以下就可以很好稳定了，若要更低的残氧量势必要使用更长时间的充氮装置，生产设备需要更高要求，那就需要更高的成本，因此本发明优选了发明配方和制备工艺只需控制残氧量在5％以下即可。

试验十一：本发明所涉及多西环素溶液的水分稳定性试验

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、32、39、67、68、实施例1-6方法配制。

试验条件：

(1)加速试验：在温度40℃±2℃、湿度75％±5％，遮光条件下放置六个月，在第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样。

(2)长期试验：在温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％，遮光条件下放置36个月，在第1、3、6、9、12、18、24、36个月末分别取样。

试验方法：照水分测定法(《中华人民共和国兽药典》2020年版一部附录0832第一法A)测定。

测试结果如表11-1、表11-2所示。

表11-1加速试验条件下的水分稳定性情况

表11-2长期试验条件下的水分稳定性情况

由表11-1可以看出对比例39以丙三醇作为溶剂，相对其他以多西环素计为30％含量的配方，其初始水分最高，加速至第6个月或长期试验条件下储存至第36个月相对初始值增幅也最大；在加速试验中相对初始值升高幅度由高到低分别为：对比例39＞对比例32＞对比例67＞对比例68＞对比例5(试验配方①)＞实施例1-6；在长期试验条件下储存至第36个月相对初始值升高幅度由高到低分别为：对比例39＞对比例32＞对比例67＝对比例5(试验配方①)＞对比例68＞实施例1-6，由此可以看出同为30％多西环素的盐酸多西环素溶液，对比例5(试验配方①)、对比例32(丙二醇为溶剂)、对比例39(丙三醇+12L PEG400)、对比例67(丙二醇+8L PEG400)、对比例68(丙二醇+10L PEG400)对于稳定盐酸多西环素溶液的水分效果不如实施例5(丙二醇+12L PEG400)好，其余实施例也相应做不同添加比例的PEG400水分稳定性效果均不如本发明所设计的抗氧化剂:增效剂:稳定剂＝50kg:1kg:2.5kg:20L效果好。

试验十二：本发明所涉及盐酸多西环素溶液溶水情况(外观)

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)和实施例1-6方法配制，以及市售盐酸多西环素可溶性粉(含量以多西环素计30％)。

试验温度：25℃。

试验用水：100mL纯化水。

试验结果如表12所示：

其中市售30％盐酸多西环素可溶性粉和实施例5称取量6g/10mL测试结果如附图3、4所示。

表12

由表12可以看出盐酸多西环素可溶性粉、对比例5(试验配方①)、实施例1-6在(以多西环素计)25、50、300mg/L均可以快速溶解；在称取量(以多西环素计)20g/L、50g/L盐酸多西环素可溶性粉溶解较慢，至少需要搅拌2min以上，对比例5(试验配方①)、实施例1-6均可快速溶解。

在6g/10mL这个浓度下，盐酸多西环素可溶性粉不能完全溶解，出现部分白色固体沉淀(见附图3)，实施例5在此浓度下可以和水互溶(见附图4)，对比例5(试验配方①)、实施例1-6在此浓度下可以和水互溶，性状和附图4无明显区别，后续又测试了10g/10mL、20g/10mL、30g/10mL等更高浓度的试验，发现对比例5(试验配方①)、实施例1-6均可与水互溶，溶液澄清透明。

试验十三：本发明所涉及盐酸多西环素溶液溶水后pH情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用实施例1-6方法配制。

试验温度：25℃。

试验用水：100mL纯化水。

试验结果如表13所示：

表13

实施例1-6(以多西环素计)在猪的饮水使用浓度,25mg/L～50mg/L的pH为4.9～7.3，在鸡的饮水使用浓度下pH是4.3左右，表明在使用浓度下溶液显中性和酸性，猪鸡可以饮水使用不会刺激。

试验十四：本发明所涉及盐酸多西环素溶液溶水后含量及外观稳定性情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、实施例1-6方法配制。

试验方法：按照本发明所述用于鸡每升水中添加300mg(以多西环素计)、两倍使用量600mg/L(以多西环素计)的浓度配制，于室温正常光照下放置，于第0、2、4、8、12、24h取样，按本发明具体实施方式中试验三【含量测定】方法测定。

含量以理论值的百分比表示，及溶解后放置24h性状结果如表14-1、表14-2所示。

表14-1 300mg/L浓度下测试结果(单位：％)

表14-2 600mg/L浓度下测试结果(单位：％)

由表14-1和14-2可以看出溶水后24h市售可溶性粉出现浑浊，而对比例5(试验配方①)和实施例1-6均还是澄清的溶液；应用于鸡的使用浓度300mg/L(以多西环素计)下，市售可溶性粉溶水后在24h内含量降解迅速，对比例5(试验配方①)降解率比市售可溶性粉溶水后降解率低，但也达到2.2％，实施例1-6降解率在24h内降解率均＜2％，比对比例5(试验配方①)溶水后稳定性更好。在两倍使用浓度600mg/L下，其稳定性差异更明显，市售可溶性粉溶水后24h降解率达37.5％，对比例5(试验配方①)达4.8％，而实施例1-6仍可以保持2％及以下，因此可以看出实施例1-6比市售可溶性粉和对比例5(试验配方①)溶水后具有更好的稳定性。

试验十五：本发明所涉及盐酸多西环素溶液的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、实施例1、3、5方法配制及市售盐酸多西环素可溶性粉(含量以多西环素计30％)。

试验菌株：大肠杆菌(CMCC44103)、沙门氏菌(CMCC50094)均购自微生物菌种保藏中心

培养基：

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)：胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.6％，水1L，pH7.2±0.2，121℃高压灭菌20min。

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，水1L，pH6.0±0.2，121℃高压灭菌20min。

药液和菌液的配制：

分别配制大肠杆菌、沙门氏菌试验用菌悬液，使浓度为1×10⁸cfu/ml～5×10⁸cfu/ml；

分别精密量取对比例5(试验配方①)、实施例1、3、5的盐酸多西环素溶液适量，置于100mL容量瓶，用肉汤培养基定容，配制成浓度为512μg/mL(以多西环素计)的溶液；精密称取盐酸多西环素可溶性粉适量，置于100mL容量瓶，用肉汤培养基溶解后定容，配制成浓度为512ug/mL(以多西环素计)的溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，置于-20℃保存。每次临用前，取一小瓶解冻后，即可使用。

将肉汤培养基分装于小试管中，每支1ml。采用二倍试管稀释法，加入1ml待测样品试液，使肉汤培养基分别含待测样品浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml(以多西环素计)(每个稀释度3支试管)；具体标号如表15-1所示。

取试验用菌悬液20μl，加入至上述含不同浓度样品的肉汤培养基中，混匀，于37℃恒温培养箱中培养48h；

取试验用菌悬液20μL，加入至不含药品的肉汤培养基中，进行平行试验，作为阳性对照；

取肉汤培养基，进行平行试验，作为阴性对照。

最小抑菌浓度(MIC)的确定：37℃培养48h后观察结果，抑制检测菌肉眼未见生长的药液最低浓度为本发明所涉及的盐酸多西环素制剂对检测菌的MIC。

最小杀菌浓度(MBC)的确定：吸取上述无菌生长的试验组各0.1mL，涂布于琼脂培养基上，于37℃下倒置培养24h，观察平板上的菌落生长情况，平板上菌落数小于5的药物最小浓度即为MBC。

试验结果：见表15-2、表15-3和图5至7所示。

表15-1各试验例不同浓度对应标号情况

表15-2盐酸多西环素溶液最小抑菌浓度结果(以多西环素计)(单位：μg/mL)

表15-3盐酸多西环素溶液最小杀菌浓度结果(以多西环素计)(单位：μg/mL)

	大肠杆菌	沙门氏菌
			对比例5(试验配方①)	8.0	8.0
实施例1	4.0	4.0
			实施例3	4.0	4.0
实施例5	4.0	4.0
			市售盐酸多西环素可溶性粉	8.0	8.0

对比例5(试验配方①)抑制沙门氏菌最小抑菌浓度试验结果和抑制大肠杆菌抑菌浓度试验结果(图5)相似；实施例1抑制沙门氏菌最小抑菌浓度试验结果和抑制大肠杆菌抑菌浓度试验结果(图6)相似、实施例3、5抑大肠杆菌、沙门氏菌最小抑菌浓度试验结果图和实施例1(图6)相似；市售盐酸多西环素可溶性粉抑制沙门氏菌最小抑菌浓度试验结果和抑制大肠杆菌抑菌浓度试验结果(图7)相似，因此不再重复拍图。

由表15-2和图5至7可以看出实施例1、3、5的对大肠杆菌、沙门氏菌最小抑菌浓度(以多西环素计)为2.0μg/mL，比对比例5(试验配方①)、市售盐酸多西环素可溶性粉最小抑菌浓度4.0μg/mL低，可以看出抑大肠杆菌、沙门氏菌效果实施例1、3、5比对比例5(试验配方①)、市售盐酸多西环素可溶性粉的抑菌效果更好。

由表15-3可以看出实施例1、3、5最小杀菌浓度(以多西环素计)为4.0μg/mL，比对比例5(试验配方①)、市售盐酸多西环素可溶性粉最小抑菌浓度8.0μg/mL低，即使用更少的用量实施例1、3、5可以达到和对比例5(试验配方①)、市售盐酸多西环素可溶性粉相同的杀菌效果。

由以上也可以看出各盐酸多西环素剂型在猪、鸡使用浓度：以多西环素计25～50mg/L、300mg/L对大肠杆菌、沙门氏菌有杀灭效果，可以良好控制大肠杆菌、沙门氏菌的生长。

试验十六：本发明所涉及盐酸多西环素溶液微生物限度

试验用盐酸多西环素溶液：采用实施例1-6方法配制。

若作为口服溶液剂使用，还应满足《中华人民共和国兽药典》2020年版中“内服溶液剂”的微生物限度要求，照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(兽药典附录1105)和控制菌检查法(兽药典附录1106)及非无菌兽药微生物限度标准(兽药典附录1107)检查。

试验结果如表16所示：

表16

	微生物限度结果
		实施例1	符合规定
实施例2	符合规定
		实施例3	符合规定
实施例4	符合规定
		实施例5	符合规定
实施例6	符合规定

由表16可以知道，本发明所涉及的盐酸多西环素溶液实施例1-6符合兽药典中“内服溶液剂”微生物限度要求。

试验十七：本发明所涉及盐酸多西环素溶液相关注射剂指标情况

试验用盐酸多西环素溶液：采用实施例1-6方法配制。

若作为注射剂使用，按照《中华人民共和国兽药典》2020年版中“注射剂”要求、《兽药质量标准》2017年版化学药品卷中“盐酸多西环素注射液”有关物质要求等进行测试。测试结果如表17所示。

表17

由表17可知，本发明所涉及的盐酸多西环素溶液实施例1-6符合《中华人民共和国兽药典》2020年版中“注射剂”的要求，可作为注射剂使用。

试验十八：本发明所涉及盐酸多西环素溶液感染大肠杆菌病的鸡群治疗效果试验

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例5(试验配方①)、实施例1、3、5方法配制以及市售30％盐酸多西环素可溶性粉。

试验动物：2周龄伊莎商品代公鸡420只，购自山西某种鸡场，进行鸡白痢沙门氏菌凝集试验确定为阴性鸡后，选用作试验鸡。

饲养管理：饲喂全价雏鸡饲料(不含任何其他药物)，自由饮水。

菌种：沙门氏菌C-79-10标准株，购自中国兽医药品监察所。

试验方法：

(1)将420只随机分为7组，每组60只，具体分组与处理情况见表17-1

(2)攻毒：每只鸡腹腔注射等量适当稀释的鸡白痢沙门氏杆菌(2500CFU/mL)，攻毒后观察各组试验鸡的精神、采食、饮水、粪便、呼吸等临床症状

(3)治疗：按试验所需，将不同剂量的药物分别溶于水中，让鸡饮水给药，连续使用5d，治疗处理如表18-1所示。

(4)药效评价标准：

临床症状：鸡只精神沉郁，食欲下降，低头缩颈，扎堆，翅下垂，羽毛松乱，闭眼嗜睡，有的尖声鸣叫，呼吸困难；下痢，排灰白色稀便，泄殖腔周围羽毛被粪便污染，甚至将肛门糊堵。

有效：经给药后，完全治愈和没有死亡但表现症状有改善者均为有效；

治愈：试验期间，经给药后精神状态和食欲恢复正常，不再出现白色稀粪等临床症状；

改善未治愈：经给药后，除完全治愈外没有死亡但表现症状改善。

死亡：出现鸡白痢典型症状并死亡，尸体剖检有典型的特征性病变，并从肝、肺中分离培养出鸡白痢沙门氏菌者判为感染死亡。

根据各指标数量分别计算有效率、治愈率和死亡率。试验结果如表18-2。

表18-1表18-2

由表18-2可以看出治愈率：实施例3优于实施例1等于实施例5优于对比例5(试验配方①)优于市售盐酸多西环素可溶性粉，有效率：实施例5优于实施例3优于实施例1优于对比例5(试验配方①)优于市售盐酸多西环素可溶性粉。

市售盐酸多西环素可溶性粉不管是治愈率还是有效率均低于对比例5和实施例1、3、5；对比例5(试验配方①)改善未治愈数比实施例1、3、5高，但是有效率比实施例1、3、5低，治愈率明显低很多，说明实施例1、3、5在以多西环素计300mg/L混饮，连用5日情况下比对比例5更快治愈感染了鸡白痢沙门氏菌的鸡。

试验十九：本发明所涉及盐酸多西环素溶液治疗猪喘气病的应用效果试验

试验用盐酸多西环素溶液：采用对比例2、4、5(试验配方①)、实施例1、3、5方法配制。

试验动物：某猪场患喘气病的猪50只，随机分成5组。

治疗方法：如表19-1所示。

试验期间每日观察各组试验猪的临床症状，在用药第0、3、5天和停药第5天对各试验猪临床症状按照表19-2所列标准进行评分(临床症状评分＝组内病猪精神、采食、呼吸症状、粪便性状及体温等五项症状评分之和/组内存活猪头数，未计算死亡猪只的症状评分)。计算各组试验病猪的症状评分均值，进行统计分析，结果见表19-3。

日增重与料肉比：分别在用药第0天和停药第5天称量各组病猪体重，记录试验期间各组病猪耗料情况，计算各组病猪平均初重、平均末重、平均日增重和料肉比，结果见表19-4。

表19-1

表19-2猪喘气病临床症状评分标准

表19-3

表19-4

由表19-3可看出用药前(用药第0天)所有试验猪均表现出猪喘气病的典型症状(临床症状评分＞8)，开始用药后，各组病猪症状均得到缓解，控制症状的速度顺序为实施例1、3、5肌注或混饮方式均优于对比例5(试验配方①)混饮优于对比例2肌注优于对比例4肌注，实施例1、3、5的肌注方式相对混饮方式有稍优，但差别不是特别明显。

由表19-4可以看出各组试验病猪平均初重差异不明显，停药第5天实施例1、3、5平均末重、日耗料均高于对比例2、4、5(试验配方①)，料肉比比较低，且实施例1、3、5采用混饮方式比肌肉注射方式的采食量更多，可能是由于本发明的盐酸多西环素溶液稀释饮用时具有酸酸的口感可以刺激病猪的食欲、肌肉注射方式会引起病猪一定的疼痛感，从而影响采食量。

综上说明实施例1、3、5比对比例2、4、5(试验配方①)可以更好控制临床各种症状，改善精神和食欲，提高病猪的日增重和降低料肉比，因此临床上建议如果初始病症影响猪只采食可以先使用肌肉注射方式，后改成混饮，减少猪只因注射疼痛应激。

试验二十：本发明所涉及盐酸多西环素溶液在治疗加州鲈感染嗜水气单胞菌的应用效果试验

1、试验用盐酸多西环素溶液：采用实施例1、3、5方法配制、市售30％盐酸多西环素粉(水产用)。

2、试验方法：选用加州鲈，每尾体重(200±50)g，随机分成6组，每组60尾。

(1)健康对照组：不感染嗜水气单胞菌、不给药、与其他组隔离饲养

(2)阳性感染对照组：人工感染嗜水气单胞菌，不给药

(3)试验组一：每吨饲料中加入50mL(以多西环素计)实施例1盐酸多西环素溶液搅拌均匀投喂；

(4)试验组二：每吨饲料中加入50mL(以多西环素计)实施例3盐酸多西环素溶液搅拌均匀投喂；

(5)试验组三：每吨饲料中加入50mL(以多西环素计)实施例5盐酸多西环素溶液搅拌均匀投喂；

(6)试验组四：每吨饲料中加入50mL(以多西环素计)市售30％盐酸多西环素粉(水产用)搅拌均匀投喂；

3、攻毒及给药

试验组、阳性感染对照组对加州鲈注射0.2mL/尾、密度为5.0×10⁹个/mL的感染用嗜水气单胞菌，攻毒后待加州鲈开始出现发病症状时，立即给予供试药物，连续用药5天。

临床观察：攻毒后连续观察10天，每天注意观察和记录各组加州鲈状态、临床变化和死亡情况，以死亡加州鲈进行剖检，观察病变。

4、结果

加州鲈攻毒后出现临床症状主要有：病鱼腹部肿胀，眼球充血发红，体腔内有黄色或红色液态，肝脏充血而呈紫色。

分别在试验第1、3、5、10天时，记录累积死亡率结果如表20所示。

表20

	1d	3d	5d	10d
					健康对照组	0.0	0.0	0.0	0.0
阳性感染对照组	36.7	43.3	53.3	61.7
					试验组一	10.0	13.3	18.3	18.3
试验组二	8.3	11.7	16.7	20.0
					试验组三	11.7	13.3	18.3	20.0
试验组四	10.0	18.3	25.0	30.0

由表20可以看出健康对照组试验期间无死亡，阳性感染对照组试验期结束死亡率高达61.7％，试验组一至四有用药对治疗加州鲈感染的嗜水气单胞菌有一定的治疗效果，其中试验组一至三无显著差别，均能在用药第3天将死亡率控制在11～13％，试验组四用药第3天仍有18.3％死亡率，说明实施例1、3、5可以快速控制病程的发展，市售盐酸多西环素粉(水产用)需要至第5天才会有一定的效果，可能是由于液体剂型的盐酸多西环素比粉剂剂型在体内更易吸收和利用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (9)

1.一种盐酸多西环素溶液，其特征在于每100L溶液中采用如下组分：以多西环素计10-40kg的盐酸多西环素，抗氧化剂0.2-0.8kg，增效剂0.5-2.0kg，稳定剂4-16L，溶剂余量；

其中，所述的抗氧化剂为食品添加剂特丁基对苯二酚；

所述的增效剂为L-苹果酸和无水柠檬酸，质量比为1:1；

所述的稳定剂为聚乙二醇400；

所述的溶剂为1,2-丙二醇。

2.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述的盐酸多西环素溶液每100L中，以多西环素计的盐酸多西环素:抗氧化剂:增效剂:稳定剂＝50kg:1kg:2.5kg:20L。

3.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述的特丁基对苯二酚含量，以C₁₀H₁₄O₂计，≥99.0wt％。

4.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述的L-苹果酸水分≤2.0wt％，按无水物计算C₄H₆O₅含量不得少于99.0wt％，无水柠檬酸水分≤0.5wt％，柠檬酸含量为99.5～100.5wt％。

5.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述的聚乙二醇400水分不得过1.0wt％。

6.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述的1,2-丙二醇水分≤0.2wt％，相对密度1.035～1.037。

7.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述一种盐酸多西环素溶液的制备方法，采用如下组分：以多西环素计10-40kg的盐酸多西环素；特丁基对苯二酚0.2-0.8kg；L-苹果酸和无水柠檬酸合计0.5-2.0kg，质量比为1:1；聚乙二醇400 4-16L；1,2-丙二醇作为余量补充至100L溶液；制备步骤如下：

在氮气环境下，取适量1,2-丙二醇和处方量聚乙二醇400，边搅拌边依次加入处方量特丁基对苯二酚、无水柠檬酸、L-苹果酸，边搅拌溶解边加热至70-75℃，加入处方量盐酸多西环素，体系温度降至60-65℃，保持温度，搅拌至充分溶解，冷却后用1,2-丙二醇定容至100L，过滤，检验合格后灌封，灌封前后向容器内充入氮气，包装，即得所述盐酸多西环素溶液；

或按注射液要求进行注射剂的常规工艺处理，即得所述盐酸多西环素注射液。

8.如权利要求7所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于所述反应设备为可加热、密封的设备，且制备全程在氮气环境中进行。

9.如权利要求1所述的一种盐酸多西环素溶液，其特征在于应用时，以多西环素计：

(1)混饮：每1L水，猪25～50mg，鸡300mg，连用3～5日；

(2)肌内注射：一次量，每1kg体重，猪5～10mg，一日一次，连用2～3日；

(3)用于治疗水产动物时，拌饵投喂：每吨饲料添加30～50mL，连用3～5日。

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