CN114699522A - 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 - Google Patents
基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114699522A CN114699522A CN202210293684.3A CN202210293684A CN114699522A CN 114699522 A CN114699522 A CN 114699522A CN 202210293684 A CN202210293684 A CN 202210293684A CN 114699522 A CN114699522 A CN 114699522A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- oral spray
- virus
- gene recombination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 229940041678 oral spray Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000668 oral spray Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 19
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002019 anti-mutation Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims abstract description 35
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 6
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 4
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710151190 Flagellin A Proteins 0.000 description 1
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
- A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及抗病毒口腔喷剂生产技术领域，且公开了基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，包括以下步骤：基因重组制备病毒菌抗原；选择免疫动物；进行动物免疫，并收集最后一次免疫一周后收集鸡蛋；从鸡蛋黄中提取卵黄抗体IgY及相应抗体；并对提取的抗体进行检测；检测该抗体对相应类型病毒的作用，利用提取的卵黄抗体IgY制备口腔喷剂。该基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，通过用新型冠状病毒的S蛋白免疫蛋鸡，制备出新型冠状病毒抗体IgY复合抗体，制备的复合抗体不仅含有S1抗体，而且还含有S2抗体等，复合抗体对多种类型病毒均有作用，如果病毒发生突变，该喷剂仍有很好的防治作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗病毒口腔喷剂生产技术领域，具体为基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺。
背景技术
由新型冠状病毒感染引起的急性严重性呼吸道综合征流行性高度传染病自爆发以来，已经波及全世界，中和抗体能够中和病毒，使病毒失去感染性达到防治作用。在COVID-19中，病毒表面的S蛋白介导受体识别和膜融合。在病毒感染过程中，三聚体S蛋白被切割成S1和S2亚基，S1蛋白的受体结合域(RBD)直接与靶细胞表面受体ACE2的肽酶域(peptidase domain，PD) 结合，而S2负责膜融合。能够特异性的识别并结合到人细胞表面受体，侵入人体细胞，造成人的感染。如能够研制出新型冠状病毒的中和抗体，就能够中和新型冠状病毒，使病毒不能结合到细胞表面受体，阻断病毒的感染，从而达到预防和治疗新型冠状病毒感染引起的疾病作用。
目前新型冠状病毒感染者恢复期的康复者血浆也含有新型冠状病毒的中和抗体，能够治疗新型冠状病毒感染者，但由于血浆中可能含有其它的病原体，会引起其它的传染病。又由于康复者血浆来源少，难以满足庞大病人治疗的需求。许多科学家转而研制新冠病毒人源化中和抗体IgG，但人源化中和抗体IgG与病毒结合后有时会产生“抗体依赖的增强作用(ADE)”，协助病毒进入靶细胞，提高感染率，导致病毒致死率增加几十倍甚至几百倍，新冠病毒不断变异，形成不同毒株，目前单一的抗体只能解决单一毒株的新冠病毒，无法具有普适性，为此，提出一种基于基因重组抗突变新冠病毒的口腔喷剂生产工艺。
另外，针对病毒或细菌真菌引起的鼻炎，业内主要采用抗生素和抗真菌化学药治疗，但抗生素一般为光谱杀菌，会带来菌群失调，抗真菌药也无法完全根治；针对幽门螺旋杆菌、哮喘、龋齿等影响人类生活的疾病，目前治疗方法也有以上弊端。为此，提出一种基于基因重组制备抗幽门螺旋杆菌、哮喘、龋齿、哮喘的一种或多种复合功能的口腔喷剂生产工艺。可以在防护龋齿、幽门螺旋杆菌等方面起到多效防护的作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，以抗突变新冠病毒为例，本发明从蛋黄中提取的复合抗体不仅含有S1抗体，而且还含有S2抗体，能够抗新冠病毒突变的优点，解决了上述背景技术中提出的问题。
本发明提供如下技术方案：基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，以抗突变新冠病毒为例，包括以下步骤：
步骤一：基因重组制备新冠病毒复合抗原；
步骤二：选择免疫动物，免疫动物选择高产母鸡；
步骤三：对步骤二中选择的免疫动物注射抗原，免疫周期为三个月，每个月免疫三次，最后一次免疫一周后收集鸡蛋；
步骤四：抗体的制备，从步骤三中收集的鸡蛋黄中分离出IgY等复合抗原，并计算鸡蛋中的抗体得率、抗体含量和抗体纯度，并对提取的抗体进行检测，检测该抗体对多种类型病毒的作用；
步骤五：检测步骤三中母鸡体内的抗体产生与否及滴度，并检测抗体的含量、纯度和活性；
步骤六：根据步骤四和步骤五中的检测结果，加入添加剂，调整IgY等复合抗体含量，用0.2um滤膜过滤除菌、病毒，灭活后进行灌装。
优选的，步骤一中抗原的制备方法为：技术人员从主细胞库中提取作用人细胞表达出新型冠状病毒的S蛋白、核衣壳蛋白、包膜蛋白、膜蛋白等多种蛋白，并把得到的冠状病毒的S蛋白、核衣壳蛋白等多种蛋白注入昆虫细胞里，昆虫细胞把新型冠状病毒的结构蛋白带入自己的细胞里，用生物反应器进行昆虫细胞Baculovirus-Insect Cell表达，His-tag纯化重组蛋白，并保证重组蛋白的纯度为93％，形成复合抗原。
优选的，步骤二中，高产母鸡的最佳鸡龄为刚产蛋的鸡龄，步骤三中，抗原量在l0～1000trg，免疫动物的注射剂量为1～0.5mg。
优选的，所述步骤四中抗原的制备方法为：分离步骤三中收集的鸡蛋的蛋清和蛋黄，留蛋黄备用，搅拌蛋黄，并在搅拌的过程中少量多次的添加去离子水，得到蛋黄的稀释液，把得到的稀释液用离心机进行离心，取离心出的上清液，测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，对剩余的液体进行再次离心，剩余的液体在离心力的作用下再次分层，取上清液，再次测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，并根据两次离心计算的结果计算抗体得率。
优选的，在测定上清液前，需要对上清液进行过滤，并对过滤后的上清液进行检测。
优选的，步骤五中用ELISA方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，ELISA 测OD值，按公式：样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性，以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度。
与现有技术对比，本发明具备以下有益效果：
1、该基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，通过用新型冠状病毒的S蛋白免疫蛋鸡，制备出新型冠状病毒抗体IgY复合抗体，制备的复合抗体不仅含有S1抗体，而且还含有S2抗体等，复合抗体对多种类型病毒均有作用，如果病毒发生突变，该喷剂仍有很好的防治作用。对于以上提到的其他抗原及抗体，同样采用提取的卵黄抗体IgY制备单一或复合型口腔喷剂，可对龋齿、幽门螺旋杆菌，鼻炎，哮喘等均具有很好的效果。
2、该基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，由于卵黄抗体IgY是从鸡蛋黄中提取，在功能上等价于哺乳动物血液中抗体IgG，但由于没有IgG的Fc片段，与病毒结合后不会产生抗体依赖的增强作用，且没有血浆中可能残留的病原体，同时容易大规模生产满足全民抗疫需求。
附图说明
图1为本发明结构流程示意图；
图2为德尔塔变异毒株的检测报告示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1至2，基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，包括以下步骤：
步骤一：基因重组制备抗原；
对于新冠病毒复合抗原，技术人员从主细胞库中提取作用人细胞表达出新型冠状病毒的S蛋白，RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNR KRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADY NYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFN CYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFA序列为S蛋白RBD序列，并把得到的冠状病毒的S蛋白注入昆虫细胞里，昆虫细胞把冠状病毒的S蛋白带入自己的细胞里，用生物反应器进行昆虫细胞Baculovirus-Insect Cell表达，His-tag纯化重组蛋白，并保证重组蛋白的纯度为93％，把制备的蛋白放在HEK293 cells内，观察表达的S蛋白能够与人体细胞表面受体ACE2相识别，并特性性结合，RBD-mFc和ACE2结合活性 -SPR验证Human ACE2蛋白与SARS-COV-2RBD-mFc蛋白的亲和常数为1.143nM；RBD-mFc和ACE2结合活性-ELISA验证Human ACE2蛋白与 SARS-COV-2RBD-mFc蛋白结合的EC50达到0.17nM，表明制备的蛋白具有正确的天然蛋白构象，展现出非常好的生物学活性，添加SDS-PAGE 12％凝胶上样量1mg/ml 5μl，分离出病毒表达蛋白，向制备好的蛋白中添加缓冲剂PBS，溶液的pH为7；
对于防龋齿抗原，基因重组制备变形链球菌C型和d/g型复合抗原；
对于幽门螺旋杆菌抗原(Hp)，基因重组制备Hp血型抗原结合黏附素 (bloodgroup antigen binding adhesin 2,BabA2)，尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)和鞭毛蛋白A亚单位(flagellin A subunit，FLaA),将以上抗原进行单一或两种以上的复合抗原组合；
对于哮喘及鼻炎抗原，制备复合病毒、复合真菌、复合细菌的抗原混合物，其中病毒包括：鼻病毒5型、14型、29型，冠状病毒229E型和0C43型。细菌包括：A簇B型溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，卡他球菌，草绿色链球菌，白色葡萄球菌等。真菌包括：烟曲霉菌，黄曲霉菌，米曲霉菌，构巢曲霉菌，白色念珠菌等。
步骤二：选择免疫动物，免疫动物选择高产母鸡，高产母鸡的最佳鸡龄为刚产蛋的鸡龄；
步骤三：对步骤二中选择的免疫动物注射抗原，抗原量在l0～1000trg，免疫动物的注射剂量为1～0.5mg，免疫周期为三个月，每个月免疫三次，最后一次免疫一周后收集鸡蛋；
步骤四：抗体的制备，把步骤三中收集的鸡蛋的蛋清与蛋黄分开，并保留蛋黄，搅拌蛋黄，并在搅拌的过程中向蛋黄溶液中添加去离子水，去离子水的添加要求为少量多次，把蛋黄与去离子水混合均匀，得到蛋黄的稀释液，把得到的稀释液用离心机进行离心，取离心出的上清液，测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，对剩余的液体进行再次离心，剩余的液体在离心力的作用下再次分层，取上清液，再次测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，并根据两次离心计算的结果计算抗体得率，且上清液在检测前要进行过滤，并对提取的抗体进行检测，检测该抗体对多种类型病毒的作用。
步骤五：用ELISA方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，ELISA测OD值，按公式：样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性，以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度，并检测抗体的含量、纯度和活性；
步骤六：根据步骤四和步骤五中的检测结果，向得到的卵黄抗体IgY等复合抗体加入添加剂，调整IgY等复合抗体含量，用0.2um滤膜过滤除菌、病毒，灭活后进行灌装，完成抗病毒口腔喷剂的生产。
本项目经过变异病毒试验，经体外ELISA/FACS实验，卵黄抗体能够竞争S蛋白与ACE2 受体的结合；空斑法(活病毒)和假病毒模拟中和实验，证明制备的新型冠状病毒抗体IgY能够中和病毒，制备的新型冠状病毒中和抗体IgY效价比新冠肺炎康复者血清中的中和抗体效价还要高，抗病毒效果比新冠肺炎康复者血清还要好。由于该复合抗体不仅含有S1抗体，而且还含有S2抗体，如果其中之一新冠病毒表位发生突变，另一个新冠病毒表位的抗体也能发生抗新冠病毒的作用，因而能够抗新冠病毒突变，卵黄抗体IgY是从鸡蛋黄中提取，在功能上等价于哺乳动物血液中抗体IgG，但由于没有IgG的Fc片段，与病毒结合后不会产生抗体依赖的增强作用，因而安全，且没有血浆中可能残留的病原体，同时容易大规模生产满足全民抗疫需求。
本申请涉及到的电器元件均在市场上可以买到，均是现有技术，尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：基因重组制备病毒菌抗原，制备的病毒菌抗原包括新冠病毒复合抗原、防龋齿抗原、幽门螺旋杆菌抗原、鼻炎抗原和哮喘抗原等一种或多种抗原；
步骤二：选择免疫动物，免疫动物选择高产母鸡；
步骤三：对步骤二中选择的免疫动物注射抗原，免疫周期为三个月，每个月免疫三次，最后一次免疫一周后收集鸡蛋；
步骤四：抗体的制备，从步骤三中收集的鸡蛋黄中分离出IgY等复合抗体，并计算鸡蛋中的抗体得率、抗体含量和抗体纯度，并对提取的抗体进行检测，检测该抗体对多种类型病毒的作用；
步骤五：检测步骤三中母鸡体内的抗体产生与否及滴度，并检测抗体的含量、纯度和活性；
步骤六：根据步骤四和步骤五中的检测结果，加入添加剂，调整IgY含量，用0.2um滤膜过滤除菌、病毒，灭活后进行灌装。
2.根据权利要求1所述的基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：步骤一中抗原的制备方法为：技术人员从主细胞库中提取作用人细胞表达出新型冠状病毒的S蛋白等多种蛋白，并把得到的多种蛋白注入昆虫细胞里，昆虫细胞把新型冠状病毒的结构蛋白带入自己的细胞里，用生物反应器进行昆虫细胞Baculovirus-InsectCell表达，His-tag纯化重组蛋白，并保证重组蛋白的纯度为93％，形成复合抗原。
3.根据权利要求1所述的基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：步骤二中，高产母鸡的最佳鸡龄为刚产蛋的鸡龄，步骤三中，抗原量在l0～1000trg，免疫动物的注射剂量为1～0.5mg。
4.根据权利要求1所述的基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：所述步骤四中抗原的制备方法为：分离步骤三中收集的鸡蛋的蛋清和蛋黄，留蛋黄备用，搅拌蛋黄，并在搅拌的过程中少量多次的添加去离子水，得到蛋黄的稀释液，把得到的稀释液用离心机进行离心，取离心出的上清液，测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，对剩余的液体进行再次离心，剩余的液体在离心力的作用下再次分层，取上清液，再次测定上清液中的抗体滴度、抗体纯度和IgY等复合抗体含量，并根据两次离心计算的结果计算抗体得率。
5.根据权利要求4所述的基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：在测定上清液前，需要对上清液进行过滤，并对过滤后的上清液进行检测。
6.根据权利要求1所述的基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺，其特征在于：步骤五中用ELISA方法测每只鸡抗体的产生与否及滴度，ELISA测OD值，按公式：样品OD值/阴性对照OD值>2.1判断为阳性，以最小阳性值对应孔的稀释倍数的倒数为最高滴度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210293684.3A CN114699522A (zh) | 2022-03-23 | 2022-03-23 | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210293684.3A CN114699522A (zh) | 2022-03-23 | 2022-03-23 | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114699522A true CN114699522A (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=82171020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210293684.3A Pending CN114699522A (zh) | 2022-03-23 | 2022-03-23 | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114699522A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112175074A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-05 | 梁永明 | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 |
| CN113087791A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-07-09 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 广谱抗变异新冠病毒IgY和复合抗体及制备方法和组合制剂 |
| WO2021155639A1 (zh) * | 2020-02-03 | 2021-08-12 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 抗SARS-CoV-2和其它冠状病毒IgY及其小分子抗体以及应用 |
-
2022
- 2022-03-23 CN CN202210293684.3A patent/CN114699522A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021155639A1 (zh) * | 2020-02-03 | 2021-08-12 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 抗SARS-CoV-2和其它冠状病毒IgY及其小分子抗体以及应用 |
| CN112175074A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-01-05 | 梁永明 | 基于基因重组抗Covid-19和其他冠状病毒IgY抗体及其他小分子抗体产业化应用 |
| CN113087791A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-07-09 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 广谱抗变异新冠病毒IgY和复合抗体及制备方法和组合制剂 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡国柱, 聂荣庆, 张进, 吴东风, 杨华英, 文珠, 段淑敏, 张智清: "特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)抗SARS-CoV作用的研究", 微生物学杂志, vol. 24, no. 05, pages 123 - 125 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hsieh et al. | Stabilized coronavirus spike stem elicits a broadly protective antibody | |
| Staats et al. | Mucosal immunity to HIV-1: systemic and vaginal antibody responses after intranasal immunization with the HIV-1 C4/V3 peptide T1SP10 MN (A). | |
| Ludwig et al. | Biology and neurobiology of Borna disease viruses (BDV), defined by antibodies, neutralizability and their pathogenic potential | |
| CN111228483A (zh) | 用于新型冠状病毒和非典病毒的广谱抗体喷剂 | |
| BRPI0606790B1 (pt) | anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, composição, vetor de expressão, microrganismo transgênico, célula hospedeira procariótica, kit, e, uso de um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ou de uma composição | |
| CN111454354B (zh) | 抗2019-nCoV的抗体、制剂及其制备方法和应用 | |
| CN1958608B (zh) | 抗禽流感特异性IgY的制备方法及其制剂 | |
| BRPI0616328A2 (pt) | vacinas e mÉtodos para tratar influenza canino | |
| CN107177001B (zh) | 一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法 | |
| Carlsson et al. | Secretory and serum immunoglobulin class-specific antibodies to poliovirus after vaccination | |
| CN101643721B (zh) | 广谱安全型动物用抗甲型流感病毒疫苗 | |
| CN111574623A (zh) | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 | |
| Lehmann et al. | Vaccination of cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus, using a recombinant feline leukemia virus vaccine | |
| CN113087791B (zh) | 广谱抗变异新冠病毒IgY和复合抗体及制备方法和组合制剂 | |
| Koprowski | Vaccines and sera through plant biotechnology | |
| Yamanishi et al. | Development of inactivated vaccine against virus causing haemorrhagic fever with renal syndrome | |
| JP2021536228A (ja) | ヘマグルチニン（ｈａ）タンパク質内の非ドミナントエピトープに対する免疫応答を誘起するためのベクター | |
| CN112094341A (zh) | 抗新型冠状病毒的IgY中和抗体及其制备方法、制剂和应用 | |
| CN107073098A (zh) | 获得浓缩IgY免疫球蛋白调配物的乳化疫苗、其方法及用途 | |
| CN103341164A (zh) | 一种鸡传染性法氏囊病抗原抗体复合物、制剂及制备方法 | |
| CN114699522A (zh) | 基于基因重组抗突变病毒菌及真菌的口腔喷剂生产工艺 | |
| Jennings et al. | The immune response of hamsters to purified haemagglutinins and whole influenza virus vaccines following live influenza virus infection | |
| CN113072640A (zh) | 抗突变SARS-CoV-2多结合位点IgY及其制备以及抗体组合疗法和应用 | |
| CN106822885A (zh) | 肺炎链球菌疫苗 | |
| Cohen et al. | Mosaic RBD nanoparticles protect against multiple sarbecovirus challenges in animal models |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |