CN114689770A - 直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及检测试剂盒，采用超高效液相色谱‑串联质谱检测经过预处理后的尿液中的羟氯喹及其三种代谢产物，利用超高效液相色谱将羟氯喹及其三种代谢产物与尿液中的其它成分进行分离，利用串联质谱检测羟氯喹及其三种代谢产物的含量，以羟氯喹的同位素化合物羟氯喹‑d4为内标，采用校正曲线法计算尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的含量。本发明只需简单的提取和离心，色谱分离和质谱检测过程在4min内即可完成，回收率和基质效应满足中国药典要求，具有灵敏度高、特异性强、检测准确的优点，为快速、直接检测尿液中的羟氯喹及其三种代谢产物提供了一种准确可靠的方法，具有一定的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于尿液定量检测技术领域，具体涉及一种快速直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法及用于尿液中羟氯喹及其三种代谢产物检测的试剂盒。
背景技术
羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)自上世纪50年代开始替代氯喹(Chloroquine，CQ)在临床上广泛应用于疟疾的治疗[胡晶莹，沈利，潘卫庆.恶性疟原虫氯喹抗性机制研究进展[J].中国热带医学，2009，09(12)：2315-231.]。近年来多项研究发现HCQ具有调节免疫系统、抗炎、调节细胞因子释放等作用，因此目前多用于类风湿、系统性红斑狼疮、慢性关节炎等免疫系统疾病的治疗。此外，HCQ还可通过抑制肿瘤内的自噬作用从而发挥抗肿瘤作用，同时可增强多种抗肿瘤药物的疗效[Liu LQ,Wang SB,Shao YF,Shi JN,etal.Hydroxychloroquine potentiates the anti-cancer effect of bevacizumab onglioblastoma via the inhibition of autophagy[J].Biomed Pharmacother.2019,118:109339./Zhang Y,Luo P,Leng P.Effect of Autophagy Inhibitor Hydroxychloroquineon Chemosensitivity of Castration-resistant Prostate Cancer[J].Sichuan Da XueXue Bao Yi Xue Ban.2019 May；50(3):323-327.]。HCQ是目前临床上一种成熟有效的治疗疟疾及风湿免疫类疾病的药物，临床应用时间长。
HCQ是CQ的羟基取代产物，具亲脂性和弱碱性，分子式为C18H26ClN3O，分子量335.87(式1)。HCQ大约有50％经过肝脏代谢，42％经肾脏代谢，约25-50％的HCQ以原型从肾脏排出体外[王才惠,段西凌.羟氯喹在治疗皮肤病中的应用[J].临床皮肤科杂志,2013,42(4):259-261.]。因此，通过对尿液中HCQ及其代谢产物的检测有助于我们深入了解羟氯喹的排泄规律，监测体内排泄量。
HCQ在肝脏通过CYP2D6、CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5代谢为三个主要的代谢产物：脱乙基氯喹(DCQ)、双脱乙基氯喹(BDCQ)、单脱乙基羟氯喹(DHCQ)；DHCQ治疗类风湿关节炎的作用可能优于HCQ本身，而BDCQ和HCQ本身同胃肠道不良反应具有一定的相关性[Munster T,Gibbs JP,Shen D,Baethge BA,Botstein GR,Caldwell J,Dietz F,Ettlinger R,GoldenHE,Lindsley H.Hydroxychloroquine concentration–response relationshipsinpatients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis&Rheumatology.2002；46:1460–1469.]。
Li等报道了在中国健康男性人群中(n＝20)，单次口服HCQ 200mg，血浆t1/2约为298±105h(mean±SD，下同)，ACU0-∞为1950±435ng.h/ml，Cmax为44.1±27.6ng/mL，tmax为3.85±1.04h[Hong-wei Fan,Zhi-xiang Ma,Jing Chen,Xing-ye Yang，etal.Pharmacokinetics and Bioequivalence Study of Hydroxychloroquine SulfateTablets in Chinese Healthy Volunteers by LC–MS/MS[J].Rheumatol Ther.2015 Dec；2(2):183–195.]。
BROWN等报道了白人单次口服200mg HCQ后为非线性药物代谢，生物利用度为70-80％，血浆终末半衰期t1/2为50±16天(mean±range)，全血t1/2为44±12天(mean±range)，血浆Cmax为46ng/mL(range：34-79ng/mL)，全血Cmax为244ng/mL(range：188-427ng/mL)，tmax为3.2h(range：2-4.5h)。HCQ在体内有广泛而快速的组织分布和极慢速末端消除特征，特别容易蓄积在脾、肝、肾、心、眼等脏器，血液清除率仅为96mL/min，其多剂量给药需3-6个月才能达到稳态[Furst DE.Pharmacokinetics of hydroxychloroquine and chloroquineduring treatment of rheumatic diseases[J].Lupus.1996；5((Suppl 1)):S11–5.]。
代谢产物的尿液排泄量通常能反映该产物的体内暴露量。目前，已有研究报道了通过LC-MS/MS定量小鼠全血和组织样本中的HCQ及其代谢产物[Chhonker YS,SleightholmRL,Li J,
D,Murry DJ.Simultaneous quantitation of hydroxychloroquineand its metabolites in mouse blood and tissues using LC-ESI-MS/MS:Anapplication for pharmacokinetic studies.J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci.2018 Jan 1；1072:320-327.]。但现阶段尚未发现HCQ及其代谢产物在体内暴露量的相关研究。一个简单，无需衍生化的提取方法可能对HCQ及其代谢产物的体内暴露量监测有重要作用，但目前尚未发现此种方法的报道。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，目的在于提供一种能够快速、直接对尿液中的羟氯喹及其三种代谢产物进行检测的检测方法以及检测试剂盒。
本发明的第一方面，提供了一种直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
对羟氯喹及其代谢产物脱乙基氯喹(DCQ)、双脱乙基氯喹(BDCQ)、单脱乙基羟氯喹(DHCQ)进行检测，其特征在于，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
A)对待检尿液样本进行预处理：取一定量尿液样本于1.5mL离心管中，加入20倍体积的初始比例流动相，涡旋后按照体积比20:1将尿液样本和提取液混合，并进行正压过滤；
B)采用超高效液相色谱将预处理后待检尿液样本中的羟氯喹及其代谢产物同尿液中的其它成分进行分离；
C)采用串联质谱检测羟氯喹及其代谢产物的含量，羟氯喹的同位素为内标，以标准曲线法计算尿液中羟氯喹及其代谢产物的含量，
其中，步骤B)中的色谱条件为：
流动相A：0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液；
流动相B：MEOH，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，见表1；
色谱柱型号：ZORBAX SB-C8(3.5μm，2.1×150mm)；
流速为0.25mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL；
表1流动相洗脱参数
步骤C)中的质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为4500V；干燥气温度为320℃；干燥气流速为10L/min；鞘气温度为400℃；鞘气流速为12L/min；喷雾器压力45psi；碰撞气压力为0.2MPa，
监测目标化合物羟氯喹离子对为m/z 336.1→247，出口电压110FV，碰撞能量18，单脱乙基羟氯喹离子对为m/z 308.2→130.1，出口电压70FV，碰撞能量17；脱乙基氯喹的离子对为m/z 292.1→179，出口电压85FV，碰撞能量23；双脱乙基氯喹的离子对为m/z 264.1→179，出口电压120FV，碰撞能量24。
优选的，步骤A)中，提取液为含100ng/mL内标羟氯喹-d4的甲醇溶液。
步骤A)中，经过预处理的尿液可经过下述方法制得：取25μL尿液样本于1.5mL离心管中，加入475μL流动相的初始比例(含0.2％FA-10mmoL醋酸铵水溶液和MEOH溶液)，涡旋3min后取190μL加入10μL 100ng/mL内标溶液，充分涡旋后取所有工作液注入Ostro 96孔板中，采用正压装置过滤，取续滤液100μL转移至进样小瓶中进行分析，进样量5μL。
优选的，步骤C)中，内标化合物HCQ-d4离子对为m/z 340.1→247.1，出口电压90FV，碰撞能量20。
优选的，步骤C)中，校正曲线包含有S1～S12十二个浓度点，校正曲线的建立方法如下：
精密吸取HCQ、DHCQ、DCQ、BDCQ工作溶液适量，分别置于1.5mL离心管中混合，使用稀释液2配制HCQ浓度分别为100μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、40ng/mL；DHCQ、DCQ、BDCQ浓度分别为50μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准曲线工作溶液；
取上述各浓度点混合标准曲线工作溶液25μL，加入475μL流动相初始比例，涡旋混匀后分别取190μL加入10μL 100ng/mL内标溶液，涡旋3min混匀即得S1-S12。取S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12，按照样本预处理方法对上述12个标添样本进行处理后进样测定，以待测化合物同内标的峰面积比值作为Y轴，对照品浓度作为X轴，建立校正曲线。
优选的，步骤C)中，将尿液样本中测得的羟氯喹及其代谢产物的峰面积同内标的峰面积比值带入随行校正曲线中，计算得出该尿液样本中羟氯喹及其代谢产物含量。
本发明的第二方面，提供了一种直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的试剂盒，包括洗脱液、对照品母液、提取液、质控液以及稀释液。检测时直接采用这些溶液进行检测操作即可。
上述各种溶液的配置方法如下：
洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，分别作为超高效液相色谱的流动相A和流动相B，洗脱液A是500mL的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液，精密吸取FA 1mL，称取醋酸铵0.385g，溶于500mL双蒸水中即得；洗脱液B是500mL质谱级甲醇；
对照品母液的配制方法如下：分别称取羟氯喹及其代谢产物2mg，定量溶于2mL50％MEOH中，即得1.00mg/mL的各对照品母液；
含内标提取液的配制方法如下：取适量内标物对照品，精密称定后用50％甲醇溶解，定容后浓度为1.0mg/mL、精密移取溶液10μL，加甲醇溶液定容至1mL中间溶液，再取中间液10μL，甲醇溶液定容至1mL，得含100ng/mL内标的提取剂；
稀释液包括稀释液1、稀释液2及稀释液3，稀释液1为甲醇10mL，稀释液2为10％甲醇10mL，稀释液3为流动相初始比例混合溶液，其中包含95％的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液和5％MEOH溶液；
质控液为含有羟氯喹及其代谢产物的流动相初始比例，分为三个浓度：羟氯喹高浓度为4000ng/mL，中间浓度为200ng/mL，低浓度为5ng/mL，三个代谢产物的高浓度为2000ng/mL，中间浓度为100ng/mL，低浓度为2.5ng/mL。
本发明的有益保障及效果如下：
本发明提供的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法只需要尿液预处理、高效液相色谱分离羟氯喹及其三种代谢产物、采用校正曲线法和质谱测量三个步骤，就能实现尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的含量检测，并且预处理过程只需简单的提取和离心，色谱分离和质谱检测过程在4min内即可完成，回收率和基质效应满足中国药典要求，因此，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、检测准确，为快速、直接检测尿液中的羟氯喹及其三种代谢产物提供了一种准确可靠的方法，具有一定的临床应用价值。
附图说明
图1为羟氯喹及其三种代谢产物及内标羟氯喹-d4的专属性验证色谱图，其中，A为空白尿液样品，B为内标添加尿液样品，C为实测尿液样品；
图2为羟氯喹及其代谢产物14天尿液排泄量变化；
图3为羟氯喹及其代谢产物49天尿液排泄量变化。
具体实施方式
为了更加清楚的说明本发明，下面结合实施例来对本发明进行进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。
1.实验材料
实验用尿液样本来源于上海大学实验动物中心健康SD大鼠羟氯喹给药后的尿液样本。
(1)仪器：Agilent 1290 Series超高效液相色谱仪，Agilent 6460A三重四级杆串联质谱仪(Agilent公司)；可调移液器(Eppendorf公司，0.5～10μL、10～100μL、100～1000μL)；电子天平(Sartorius公司，CPA255D型，十万分之一)；涡旋混合仪(Labnet公司，VX-200型)；离心机(Eppendorf公司，Minispin型)。
(2)试剂耗材：质谱级甲醇(MEOH，默克公司)；分析纯醋酸铵(天地公司)；分析纯甲酸(FA，麦克林生化有限公司)；双蒸馏水(屈臣氏公司)。
(3)待测化合物对照品及内标对照品：BDCQ、DCQ、DHCQ购自加拿大多伦多研究化学公司；HCQ-d4购于上海甄准生物科技有限公司，HCQ购于上海源叶科技生物有限公司。
2.检测方法及检测试剂盒
本实施例中的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：A)对待检尿液样本进行预处理；B)采用超高效液相色谱将预处理后待检尿液样本中的羟氯喹及其三种代谢产物与尿液中的其它成分进行分离；C)采用串联质谱检测羟氯喹及其三种代谢产物的含量，以羟氯喹的同位素化合物为内标，采用校正曲线法计算尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的含量。
(1)尿液样本预处理方法
取25μL尿液样本于1.5mL离心管中，加入475μL流动相的初始比例(含0.2％FA-10mmoL醋酸铵水溶液和MEOH溶液)，涡旋3min后取190μL加入10μL 100ng/mL内标溶液，充分涡旋后取所有工作液注入Ostro 96孔板中，采用正压装置过滤，取续滤液100μL转移至进样小瓶中进行分析，进样量5μL。
(2)超高效液相色谱条件
色谱柱：色谱柱型号：ZORBAX SB-C8(3.5μm,2.1×150mm，安捷伦公司，美国)；采用洗脱液为：流动相A：0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液；流动相B：甲醇溶液；流速为0.25mL/min，柱温为40℃，进样体积为5μL；采用梯度洗脱的方式进行色谱分离，梯度洗脱参数见表1，如下：0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％，1.1～4min，流动相A为5％，流动相B为95％。
(3)质谱条件
在电喷雾电离离子源下同时采用正离子模式电离，多重反应监测模式检测HCQ及其代谢产物，毛细管电压为4500V；干燥气温度为320℃；干燥气流速为10L/min；鞘气温度为400℃；鞘气流速为12L/min；喷雾器压力45psi；碰撞气压力为0.2MPa。监测目标化合物HCQ离子对为m/z 336.1→247，出口电压(F)110，碰撞能量18，DHCQ离子对为m/z 308.2→130.1，出口电压(F)70，碰撞能量17；DCQ离子对为m/z 292.1→179，出口电压(F)85，碰撞能量23；BDCQ离子对为m/z 264.1→179，出口电压(F)120，碰撞能量24；内标化合物HCQ-d4离子对为m/z 340.1→247.1，出口电压(F)90，碰撞能量20。
(4)校正曲线的建立
校正曲线包含有S1～S12十二个浓度点，校正曲线的建立方法如下：
精密吸取HCQ、DHCQ、DCQ、BDCQ工作溶液适量，分别置于1.5mL离心管中混合，使用稀释液2配制HCQ浓度分别为100μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、40ng/mL；DHCQ、DCQ、BDCQ浓度分别为50μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准曲线工作溶液；
取上述各浓度点混合标准曲线工作溶液25μL，加入475μL流动相初始比例，涡旋混匀后分别取190μL加入10μL 100ng/mL内标溶液，涡旋3min混匀即得S1-S12。取S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12，按照样本预处理方法对上述12个标添样本进行处理后进样测定，以待测化合物同内标的峰面积比值作为Y轴，对照品浓度作为X轴，建立校正曲线。
在进行实际尿液样本检测时，将串联质谱测得的待测尿液样本中羟氯喹及其三种代谢产物的峰面积与内标化合物的峰面积比值代入校正曲线中，通过计算即可得出该待测尿液样本中羟氯喹及其三种代谢产物含量。
(5)羟氯喹及其三种代谢产物试剂盒的组成
羟氯喹及其三种代谢产物试剂盒包括洗脱液、对照品母液、稀释液、提取液及质控液，具体见表2。
表2羟氯喹及其代谢产物试剂盒组成如下：
上述各种溶液的配置方法如下：
洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，分别作为超高效液相色谱的流动相A和流动相B，洗脱液A是500mL的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液，精密吸取FA 1mL，称取醋酸铵0.385g，溶于500mL双蒸水中即得；洗脱液B是500mL质谱级甲醇；
对照品母液的配制方法如下：分别称取羟氯喹及其代谢产物2mg，定量溶于2mL50％MEOH中，即得1.00mg/mL的各对照品母液；
含内标提取液的配制方法如下：取适量内标物对照品，精密称定后用50％甲醇溶解，定容后浓度为1.0mg/mL、精密移取溶液10μL，加甲醇溶液定容至1mL中间溶液，再取中间液10μL，甲醇溶液定容至1mL，得含100ng/mL内标的提取剂；
稀释液包括稀释液1、稀释液2及稀释液3，稀释液1为甲醇10mL，稀释液2为10％甲醇10mL，稀释液3为流动相初始比例混合溶液，其中包含95％的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液和5％MEOH溶液；
质控液为含有羟氯喹及其代谢产物的流动相初始比例，分为三个浓度：羟氯喹高浓度为4000ng/mL，中间浓度为200ng/mL，低浓度为5ng/mL，三个代谢产物的高浓度为2000ng/mL，中间浓度为100ng/mL，低浓度为2.5ng/mL。
(6)动物实验设计及采样方法
雄性SD大鼠40只，禁食不禁水8h后，随机分为4组，每组10只大鼠，灌胃给予第1-3组大鼠低剂量、中间剂量和高剂量的HCQ混悬液(低剂量：36mg/kg/天，中间剂量：第一天和第二天36mg/kg/12h，第三天起36mg/kg/天；高剂量：第一到第三天108mg/天，其余72mg/天)，共14天，第四组大鼠按照中间剂量给药，直到第49天。所有大鼠在第1、3、7、10、14天收集24h尿液，完成后处死第1-3组大鼠，第4组大鼠在第14天后按照每周一次的频率收集24h尿液，直到第49天。尿液样本测量体积后-80℃冻存。共收集60例样本。
3.方法的建立及优化
为建立一种稳定灵敏的方法，首先对HCQ及其代谢产物和内标的质谱条件进行优化，使用全扫模式确定离子源极性，后针对F值和碰撞能量CE值进行优化，选择最佳离子对(Q1/Q3)。然后针对响应，优化包括干燥气、鞘气、喷雾器压力等离子源条件。获得的最佳离子源条件如下：电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为4500V；干燥气温度为320℃；干燥气流速为10L/min；鞘气温度为400℃；鞘气流速为12L/min；喷雾器压力45psi；碰撞气压力为0.2MPa。监测目标化合物HCQ离子对为m/z336.1→247，出口电压(F)110，碰撞能量18，DHCQ离子对为m/z 308.2→130.1，出口电压(F)70，碰撞能量17；DCQ离子对为m/z 292.1→179，出口电压(F)85，碰撞能量23；BDCQ离子对为m/z 264.1→179，出口电压(F)120，碰撞能量24；内标化合物HCQ-d4离子对为m/z 340.1→247.1，90，出口电压(F)90，碰撞能量20。羟氯喹及其代谢产物和内标的多重反应检测图如图1所示。图中上侧为HCQ，下侧为内标。
(1)提取剂组分的优化
表3不同提取剂效果对比
(2)洗脱液组分的优化
表4不同洗脱液效果对比
(3)重要液相、质谱参数条件的优化
表5不同液相、质谱条件效果对比
4.方法学验证
(1)专属性
在待测化合物和内标化合物相应的保留时间上杂质的响应不超过化合物最低定量下限响应的20％和内标响应的5％即为合格。HCQ及其代谢产物和内标的专属性色谱图如图1所示，图中A为空白尿液样品，B为内标添加尿液样品，C为大鼠实测尿液样品；结果表明本方法的专属性符合药典规定。
(2)校正曲线
线性回归采用12个线性点的内标校正的峰面积同响应浓度的比值获得，权重系数使用1/x2，最低定量限浓度即为线性的最低点，对于每一个浓度点，回算偏移在±15％之内视为合格，最低定量限浓度在±20％之内视为合格。结果如下表6所示：
表6四种物质代谢校正曲线
权重系数1/x2。所有浓度点回算偏移在±15％之内，符合药典要求。
(3)基质效应和提取回收率
基质效应和提取回收率采用高浓度和低浓度(HCQ高4000ng/mL，低5ng/mL；三个代谢产物高2000ng/mL，低2.5ng/mL)的6个不同来源基质进行评价。基质效应为提取后添加样本的化合物响应同浓度一致的水标的化合物比值，提取回收率为浓度一致的前添加样本化合物响应同后添加样本化合物浓度响应的比值。结果如下表所示，表明本预处理方法在既定线性范围内提取回收率和基质效应稳定，符合药典要求，见表7：
表7羟氯喹及其代谢产物提取回收率与基质效应
(4)稳定性
稳定性包括长期稳定性(30天)、短期稳定性(室温6h)及冻融三次的稳定性。采用高、低两个浓度进行评价并且每次评价均建立校正曲线计算浓度。相对于理论浓度，偏移在±15％之内视为合格。结果如下表8所示，结果显示HCQ及其代谢产物在尿液中1个月，室温放置6h，三次冻融后可保持稳定。
表8稳定性考察
(5)日内日间精密度和准确度
日内、日间精密度准确性分别在四个浓度水平评价(最低定量下限浓度、低浓度、中浓度、高浓度)，每个浓度水平分别测定5次。随同线性评价三次，至少在两天完成，对于精密度，低浓度、中浓度、高浓度的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)不超过15％，最低定量下限浓度的相对标准偏差不超过20％视为合格。对于准确性，低浓度、中浓度、高浓度的相对误差(relative error，RE)在±15％之内，最低定量下限浓度的相对误差在±20％之内即视为合格。结果如下表所示，表明本方法的日内日间精密度和准确性符合药典要求。见表9。
表9羟氯喹及其三种代谢产物日内、日间精密度及准确度结果
5.HCQ及其代谢产物的排泄
实验中收集了大鼠尿液样本60例，按照样本前处理方法进行处理提取待测化合物，随后进样分析测定。并建立随行的标准曲线，将尿液样本检测所得化合物的峰面积同内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得出100例样本中HCQ及其代谢产物的含量，统计每组大鼠24h平均累积排泄量。实验结果如图2、3所示，表明本方法准确的测定了大鼠血浆中HCQ及其代谢产物的排泄量，具有实际可行性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (7)
1.一种直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，对羟氯喹及其代谢产物脱乙基氯喹(DCQ)、双脱乙基氯喹(BDCQ)、单脱乙基羟氯喹(DHCQ)进行检测，其特征在于，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
A)对待检尿液样本进行预处理：取一定量尿液样本于1.5mL离心管中，加入20倍体积的初始比例流动相，涡旋后按照体积比20:1将尿液样本和提取液混合，并进行正压过滤；
B)采用超高效液相色谱将预处理后待检尿液样本中的羟氯喹及其代谢产物同尿液中的其它成分进行分离；
C)采用串联质谱检测羟氯喹及其代谢产物的含量，羟氯喹的同位素为内标，以标准曲线法计算尿液中羟氯喹及其代谢产物的含量，
其中，步骤B)中的色谱条件为：色谱柱为ZORBAX SB-C8柱；流速为0.25mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL；流动相A为0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液，流动相B为质谱级甲醇，采用梯度洗脱方式进行分离；流动相洗脱参数如下：0～1min，流动相A为95％，流动相B为5％，1.1～4min，流动相A为5％，流动相B为95％；
步骤C)中的质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为4500V；干燥气温度为320℃；干燥气流速为10L/min；鞘气温度为400℃；鞘气流速为12L/min；喷雾器压力45psi；碰撞气压力为0.2MPa，
监测目标化合物羟氯喹离子对为m/z 336.1→247，出口电压110FV，碰撞能量18，单脱乙基羟氯喹离子对为m/z 308.2→130.1，出口电压70FV，碰撞能量17；脱乙基氯喹的离子对为m/z 292.1→179，出口电压85FV，碰撞能量23；双脱乙基氯喹的离子对为m/z264.1→179，出口电压120FV，碰撞能量24。
2.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：
其中，步骤A)中，所述提取液为含100ng/mL内标羟氯喹-d4的甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：
其中，步骤(C)中，内标化合物HCQ-d4离子对为m/z 340.1→247.1，出口电压90FV，碰撞能量20。
4.根据权利要求1所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：
其中，步骤C)中，校正曲线包含有S1～S12十二个浓度点，所述校正曲线的建立方法如下：
所述标准曲线的建立方法为：精密吸取HCQ、DHCQ、DCQ、BDCQ工作溶液适量，分别置于1.5mL离心管中混合，使用稀释液2配制HCQ浓度分别为100μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、40ng/mL；DHCQ、DCQ、BDCQ浓度分别为50μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准曲线工作溶液；
取上述各浓度点混合标准曲线工作溶液25μL，加入475μL流动相初始比例，涡旋混匀后分别取190μL加入10μL 100ng/mL内标溶液，涡旋3min混匀即得S1-S12。取S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12，按照样本预处理方法对上述12个标添样本进行处理后进样测定，以待测化合物同内标的峰面积比值作为Y轴，对照品浓度作为X轴，建立校正曲线。
5.根据权利要求3所述的直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的方法，其特征在于：
其中，步骤C)中，将尿液样本中测得的羟氯喹及其代谢产物的峰面积同内标的峰面积比值带入随行校正曲线中，计算得出该尿液样本中羟氯喹及其代谢产物含量。
6.一种直接检测尿液中羟氯喹及其三种代谢产物的试剂盒，其特征在于，包括洗脱液、对照品母液、提取液、质控液以及稀释液。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，分别作为超高效液相色谱的流动相A和流动相B，洗脱液A是500mL的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液，精密吸取FA 1mL，称取醋酸铵0.385g，溶于500mL双蒸水中即得；洗脱液B是500mL质谱级甲醇；
所述对照品母液的配制方法如下：分别称取羟氯喹及其代谢产物2mg，定量溶于2mL50％MEOH中，即得1.00mg/mL的各对照品母液；
所述含内标提取液的配制方法如下：取适量内标物对照品，精密称定后用50％甲醇溶解，定容后浓度为1.0mg/mL、精密移取溶液10μL，加甲醇溶液定容至1mL中间溶液，再取中间液10μL，甲醇溶液定容至1mL，得含100ng/mL内标的提取剂；
所述稀释液包括稀释液1、稀释液2及稀释液3，所述稀释液1为甲醇10mL，稀释液2为10％甲醇10mL，稀释液3为流动相初始比例混合溶液，其中包含95％的0.2％FA-10mmol醋酸铵水溶液和5％MEOH溶液；
所述的质控液为含有羟氯喹及其代谢产物的流动相初始比例，分为三个浓度：羟氯喹高浓度为4000ng/mL，中间浓度为200ng/mL，低浓度为5ng/mL，三个代谢产物的高浓度为2000ng/mL，中间浓度为100ng/mL，低浓度为2.5ng/mL。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105228453A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-06 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 用于治疗与炎症相关的疾病的去乙基羟氯喹 |
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2022
- 2022-03-02 CN CN202210201595.1A patent/CN114689770A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105228453A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-06 | 小利兰·斯坦福大学托管委员会 | 用于治疗与炎症相关的疾病的去乙基羟氯喹 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 崔莉莉: "大剂量羟氯喹药代动力学及连续给药组织蓄积规律研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, no. 2021, 15 August 2021 (2021-08-15), pages 8 - 46 * |
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