CN114689529A - 胆固醇酶法体外诊断试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开并提供了一种既能保持胆固醇测试的准确性、重复性和稳定性，又不会对总胆汁酸的测试结果造成干扰的胆固醇酶法体外诊断试剂。所述试剂为单试剂，所述试剂包括：磷酸盐缓冲液，浓度为20～100mM、PH值为6～9；曲拉通X‑100，浓度为0.1％～1％；脂蛋白酯酶，浓度为0.2～1KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为0.2～1KU/L；过氧化物酶，浓度为0.5～2KU/L；3,5‑二氯‑2‑羟基苯磺酸钠，浓度为1～5mM；4‑氨基安替比林,浓度为1～5mM。本发明可广泛应用于体外诊断试剂领域。

Description

胆固醇酶法体外诊断试剂
技术领域
本发明涉及一种体外诊断试剂，用于体外定量测定人血清或血浆中总胆固醇含量。
背景技术
体外诊断试剂在临床检验中已得到广泛应用，市场规模巨大，增速飞快。与之配套的全自动检测设备测试速度也不断提升。体外诊断试剂除了自身的准确性，重复性外和稳定性外，还需要自身成份不会对其它项目有干扰，不能对另外的检测项目造成影响，如果对其它项目有干扰会影响其它项目的准确性，重复性和稳定性，配套的检测仪器为了排除干扰在进行此项目测试后需要增加清洗的次数达到目的，增加清洗次数会严重拖慢检测仪器的测试速度，因此避免交叉污染在体外诊断试剂中非常重要。
目前，国内的胆固醇体外诊断试剂中都含有成份胆酸钠，胆酸钠对总胆汁酸的测定会造成非常大的正干扰，而且具有延续干扰性，测试仪器需多次清洗才能消除，因此消除此干扰就显得非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种既能保持胆固醇测试的准确性、重复性和稳定性，又不会对总胆汁酸的测试结果造成干扰的胆固醇酶法体外诊断试剂。
本发明所采用的技术方案是：本发明提供的胆固醇酶法体外诊断试剂，所述试剂包括：磷酸盐缓冲液，20～100mM、PH 6～9；曲拉通X-100，浓度为0.1％～1％；脂蛋白酯酶，浓度为0.2～1KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为0.2～1KU/L；过氧化物酶，浓度为0.5～2KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，1～5mM；4-氨基安替比林,1～5mM。
本发明上述的磷酸盐缓冲液（PB）在试剂中的浓度范围为20-100mM，PH 6.5-8，优选50mM，PH7.0。
本发明上述的曲拉通X-100在试剂中的浓度为0.1％～1％(质量百分比)，优选曲拉通X-100的的浓度是0.5％。
本发明上述的脂蛋白酯酶（LPL）在试剂中的浓度为0.2～1KU/L，优选胆固醇酯酶的浓度为0.5KU/L。
本发明上述的胆固醇氧化酶(CHOD)在试剂中的浓度为0.2～1KU/L，优选胆固醇氧化酶的浓度为0.5KU/L。
本发明上述的过氧化物酶(POD)在试剂中的浓度为0.5～2KU/L，优选过氧化物酶在试剂中的浓度为1KU/L。
本发明上述的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)在试剂中的浓度为1～5mM，优选3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的浓度为2.4mM.
本发明上述的4-氨基安替比林(4-APP)在试剂中的浓度为1～5mM，优选浓度为2.2mM。
另外，本发明所述试剂还包括稳定剂叠氮钠，所述叠氮钠的浓度为0.1％～0.5％(质量百分比)，优选采用0.1%。
本发明所述的试剂中，各个主要成分的作用如下：首先，在脂蛋白酯酶和曲拉通X-100的作用下催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸，胆固醇经过胆固醇氧化酶的作用生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、4-氨基安替比林作用形成红色醌亚胺化合物，在波长 505nm 处测定生成物吸光度，生成物颜色深浅与样本中的胆固醇浓度成正比，通过检查吸光度的变化，计算不同的脂蛋白的含量。
胆固醇酶法检测试剂中，应当包含适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液(PB)，该缓冲液具有良好的生物相容性，且缓冲能力合适，通常使用的PH值范围为6.0～9.0间，为了发挥酶活的最大作用，选择PH7.0是较为合适的，其选用的缓冲液浓度一般在20～100mM之间，优选采用的是50mM。
对于曲拉通X-100而言，需要使用足够的量使脂蛋白能够完全溶解，使位于脂蛋白核心的胆固醇酯充分释放，进而跟胆固醇氧化酶作用，故使用量一般要在0.1％～1％之间，用量不足，无法使脂蛋白完全溶解，用量过多，可能导致试剂的粘度增高等问题出现，优选采用的量是0.5％。
对于胆固醇氧化酶酶和过氧化物酶而言，应当有足够的量，促使反应能够快速完全地进行下去，过量的酶对于快速反应至关重要，因此，胆固醇氧化酶酶的合理的范围为0.2～1KU/L，优选采用的浓度为0.5KU/L；过氧化物酶的合理的范围为0.5～2KU/L，优选采用的浓度为1KU/L。
对于色原物质而言，其主要目的是提供显色所必须的物质，主要包括3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、4-氨基安替比林进行组合，这些都是比较稳定的色原物质，通常情况下，这些物质的使用量为1～5mM，作为优选方案，3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠采用的浓度为2.4mM，4-氨基安替比林的浓度为2.2mM。
此外，为了使试剂盒有足够长的有效期，经常需要添加一些防腐剂，如叠氮钠用以抑制微生物的污染等问题，通常情况下，需要抑制微生物生长的防腐剂浓度范围为0.1％～0.5％，本发明中，优选采用的浓度为0.1％。
本发明的优点和有益效果：本发明的试剂配方，通过添加特定比例和配比的脂蛋白酯酶和曲拉通X-100，能够使得脂蛋白被溶解掉，释放出内部含有的胆固醇，胆固醇经过胆固醇氧化酶的作用生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、4-氨基安替比林作用生成有色物质，通过检查吸光度的变化，计算不同的脂蛋白的含量，采用曲拉通X-100代替以往使用的胆酸钠，并对整个配方进行配比，不仅能保持胆固醇测试的准确性、重复性和稳定性，又不会对总胆汁酸的测试结果造成干扰。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。未在下列实施例中说明的条件或实验方法，均按照常规方法或按照厂家提供的说明书进行。
本发明提供的胆固醇酶法体外诊断试剂，所述试剂包括：磷酸盐缓冲液，20～100mM、PH 6～9；曲拉通X-100，浓度为0.1％～1％；脂蛋白酯酶，浓度为0.2～1KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为0.2～1KU/L；过氧化物酶，浓度为0.5～2KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，1～5mM；4-氨基安替比林,1～5mM。
本发明试剂的配制方法，即采用水为溶剂，各个组分按照本发明上述配方比例范围进行配制即可。
按照以下表格中的配方配制试剂，共有三组作为实验组,验证本试剂与同类试剂（对照组）的性能，是否达到相关技术要求。
表一：不同试剂的配方
实验组1 实验组2 实验组3
PB(PH7) 20mM 50mM 100mM
曲拉通X-100 0.1% 0.5% 1%
LPL 0.2KU/L 0.5KU/L 1KU/L
CHOD 0.2KU/L 0.5KU/L 1KU/L
POD 0.5KU/L 1KU/L 2KU/L
DHBS 1mM 2.4mM 5mM
4-APP 1mM 2.2mM 5mM
稳定剂 0.1％ 0.3％ 0.5％
对照组试剂成份：磷酸盐缓冲液，50mM、PH7；胆酸钠，浓度为0.5；脂蛋白酯酶，浓度为0.5KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为1KU/L；过氧化物酶，浓度为1.5KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，2mM；4-氨基安替比林,2.5mM；稳定剂适量。
测试机仪器：森龙SL300C，机身号：*****，仪器状态正常，在校准期内；
测试参数：方法：两点终点法，R1:300ul,S:3ul,读数区间：7—30；
分别用校准品对两个项目进行校准，然后用已知浓度的质控液分别进行测试，测试结果见表二和表三：
表二：基本性能
Figure 232205DEST_PATH_IMAGE002
表三：加速稳定性能
Figure 24711DEST_PATH_IMAGE004
由表二和表三得出结论：实验组和对照组性能上无明显差异，均符合行业技术要求《YY/Y 1206-2013》。
实施方式二：
目的：验证同类试剂与总胆汁酸测试，证明两个项目的交叉污染。
对照组试剂成份：磷酸盐缓冲液，50mM、PH7；胆酸钠，浓度为0.5；脂蛋白酯酶，浓度为0.5KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为1KU/L；过氧化物酶，浓度为1.5KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，2mM；4-氨基安替比林,2.5mM；稳定剂适量。
胆汁酸试剂成份：胆汁酸试剂为双试剂，其中，R1 包括Good’S 缓冲液和硫代-NAD；R2包括Good’S 缓冲液 和3α-HSD 。
测试机仪器：森龙SL300C，机身号：*****，仪器状态正常，在校准期内；
测试参数：胆固醇，方法：两点终点法，R1:300ul,S:3ul，读数区间：7—30；
胆汁酸，方法：速率法，R1：210ul，R2：70ul,S:4ul，读数区间：22—28；
实验方法：先单独测试五次总胆汁酸的重复性，确定在无干扰情况下的结果。然后按五次胆固醇和五次总胆汁酸为一组的顺序进行五组测试，验证干扰程度，测试结果见表四：
表四：单位mmol/L
Figure 804448DEST_PATH_IMAGE006
由表四可看出，常规的胆固醇试剂对总胆汁酸有非常大的干扰，导致结果最高时最大时偏高二十三倍，而且一次清洗不能清除干扰。
实施方式三：
目的：验证更改后试剂与总胆汁酸测试，证明两个项目的交叉污染。
胆固醇试剂成份：磷酸盐缓冲液，5mM、PH 7；曲拉通X-100，浓度为0.5％；脂蛋白酯酶，浓度为0.5KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为0.5KU/L；过氧化物酶，浓度为1KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，2.4mM；4-氨基安替比林,2.2mM。
胆汁酸试剂成份：胆汁酸试剂为双试剂，其中，R1 包括Good’S 缓冲液和硫代-NAD；R2包括Good’S 缓冲液 和3α-HSD 。
测试机仪器：森龙SL300C，机身号：*****，仪器状态正常，在校准期内
测试参数：胆固醇，方法：两点终点法，R1:300ul,S:3ul，读数区间：7—30
胆汁酸，方法：速率法，R1：210ul，R2：70ul,S:4ul，读数区间：22—28。
实验方法：先单独测试五次总胆汁酸的重复性，确定在无干扰情况下的结果。然后按五次胆固醇五次总胆汁酸为一组的顺序进行五组测试，验证干扰程度。测试结果见表五：
表五：单位mmol/L
Figure 51586DEST_PATH_IMAGE008
从表五结果可以得出结论：更改过后的胆固醇试剂，在同时测试总胆汁酸时，对结果无显著性干扰作用，效果明显优于含胆酸钠的胆固醇试剂。

Claims (9)

1.一种胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述试剂为单试剂，所述试剂包括：磷酸盐缓冲液，浓度为20～100mM、PH值为 6～9；曲拉通X-100，浓度为0.1％～1％；脂蛋白酯酶，浓度为0.2～1KU/L；胆固醇氧化酶，浓度为0.2～1KU/L；过氧化物酶，浓度为0.5～2KU/L；3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，浓度为1～5mM；4-氨基安替比林,浓度为1～5mM。
2.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述曲拉通X-100的浓度为0.5％。
3.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mM、PH值为pH7.0。
4.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述脂蛋白酯酶的浓度为0.5KU/L。
5.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述胆固醇氧化酶的浓度为0.5KU/L。
6.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述过氧化物酶的浓度为1KU/L。
7.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的浓度为2.4mM。
8.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述4-氨基安替比林的浓度为2.2mM。
9.根据权利要求1所述的胆固醇酶法体外诊断试剂，其特征在于：所述试剂还包括稳定剂叠氮钠，所述叠氮钠的浓度为0.1％～0.5％。
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