CN114686587A - 一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物及其应用。所述的分子标志物为miR‑4455或miR‑574‑5p或miR‑4701‑3p。所述的分子标志物在制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。本发明的优点：(1)鉴别效果好。(2)敏感性高。(3)特异性高。(4)适用于诊断，准确性高。

Description

一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物及其应用。

背景技术

正常人胸腔内约有5～15ml液体将两层胸膜分开，在呼吸运动时起润滑作用。胸腔液体量并非固定不变，正常人每24小时亦有500～1000ml的液体渗出与再吸收，两者处于平衡状态。任何原因造成其渗出增多和/或再吸收减少，出现胸膜腔内液体增多时则产生胸腔积液。胸腔积液根据病因和生化性质分为漏出液和渗出液两大类，临床上可以通过李凡他实验鉴定。但在渗出性胸腔积液这一类别中，诸多可以引起胸腔积液的疾病中，以结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病多见。结核性胸膜炎是临床上常见的肺外结核病，发病率较高，但由于诊断技术限制，确诊比例非常低。据统计，结核性胸膜炎占整个胸膜疾病的44.1％，我国第三次结核病流行病学调查表明结核性胸膜炎占结核病总数的2.5％。恶性胸膜疾病占胸腔积液的29.6％，而大约50％转移性肿瘤患者在疾病过程中会出现胸腔积液。尽管都出现症状相似的胸腔积液，但结核性胸膜炎与恶性胸膜疾病的治疗和预后完全不同，若得不到及时的诊断治疗，将直接影响预后，但目前鉴别这两种疾病仍然是临床的一大难题。

结核性胸膜炎的确诊依据之一是在胸腔积液中找到结核分枝杆菌病原学证据，但目前应用常规涂片方法找到抗酸杆菌的灵敏度极低(0～1％)；胸腔积液培养结核分枝杆菌灵敏度在11～50％，而且需要2～4周的培养时间；分子生物学诊断是近年来的热点，但即使是敏感性较高的Xpert MTB/RIF检测，对于结核性胸腔积液的诊断敏感性仅为50％左右。另一种方法是胸膜组织活检发现结核性肉芽肿、干酪性坏死或有抗酸杆菌存在，但此项检查创伤较大，手术风险较高。胸腔积液细胞学检查对恶性胸腔积液的诊断具有重要的意义，胸腔积液中查到癌细胞或取得组织学诊断乃是恶性胸腔积液的金标准，但常规的细胞学检查阳性率较低(30～60％)，尤其是较早期异形性不太明显的癌细胞与间皮细胞几乎无法区别，以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。胸腔镜检查对恶性胸腔积液的诊断具有较高的价值，但因费用昂贵，操作难度大且有一定的手术风险，患者较难接受。传统的生化免疫学检查如纤维连接蛋白、腺苷脱氨酶、铁蛋白、溶菌酶以及胸腔积液血清白蛋白比值检测，有助于胸腔积液的诊断，但敏感性和特异性均无法满足诊断要求。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)存在于真核生物中，是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，由内源性基因编码，是转录后抑制靶mRNA表达的关键调控因子。通常认为miRNA与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)以完全互补或非完全互补配对的方式，阻止核糖体的组装从而抑制相应蛋白质的翻译，但随着研究的不断深入，发现miRNA除了抑制蛋白质的翻译外，还存在翻译活化、增强转录和类激素的功能，虽然其具体的作用机制还需要进一步研究阐明或完善，但毋庸置疑的是，miRNA在细胞行使功能和疾病发生发展的过程中有着十分重要的调控作用。

miRNA可以在外周血、胸腔积液和脑脊液等多种体液中检测到，且稳定性较好，显现其作为生物标志物的潜在可能性；与此同时，越来越多的实验表明，miRNAs在分枝杆菌感染过程中，通过调节炎症反应、细胞因子信号激活、单核细胞和中性粒细胞增殖、淋巴细胞发育分化等生命活动在免疫应答中起到重要的调控作用，其异常表达与疾病的发生发展转归相关；且在其他疾病如肺癌、乳腺癌和宫颈癌等，已经有用miRNA作为生物标志物用于疾病诊断的相关研究。此外，近十年来，对于胸腔积液miRNA作为生物标志物也有过相关研究，主要集中于恶性胸膜疾病的胸腔积液特异miRNA，发现miR-198、miR-134、miR-185、miR-22、miR-195-5p、miR-182-5p和miR-34a-5p等在恶性胸膜疾病的胸腔积液中特异表达，具有作为恶性胸膜疾病诊断用生物标识物的潜力。但是，既往研究主要集中于癌症，部分研究并没有将结核性胸膜炎单独分组，而是将其与其他炎性疾病合并为良性胸膜疾病组，与恶性胸膜疾病进行比较分析。但毋庸置疑的是，miRNA具有作为诊断胸腔积液病因来源的生物标志物的潜力。

临床上，结核性胸膜炎最直接的确诊依据为胸腔积液中存在结核分枝杆菌，但因受限于诊断技术，大部分疑似患者并不能获得确诊结果，临床医生通常会根据是否合并肺结核(痰中查到结核分枝杆菌)、其他生化指标以及临床症状等进行判断，因此在临床上根据诊断证据级别的不同，通常分为3类结核性胸膜炎：1、在胸腔积液中查到结核分枝杆菌，直接诊断结核性胸膜炎；2、胸腔积液中未能查到结核杆菌，但患者痰液中查到结核杆菌，间接诊断结核性胸膜炎；3、胸腔积液和痰液中均未查到结核杆菌，仅能依靠其他生化指标和症状经临床诊断为结核性胸膜炎。具备鉴别诊断效能的特异miRNA，应该在这三类结核性胸膜炎患者的胸腔积液中稳定表达，且与恶性胸膜疾病的胸腔积液中的表达量存在显著差异。

因此，开发一种新的快速的早期诊断方法或技术，对于诊断和鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病，减少医疗资源消耗，将有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高敏感性、高特异性、用于鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的病灶部位的miRNA及其在结核性胸膜炎诊断中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。

第一方面，本发明提供一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物，所述的分子标志物为miR-4455或miR-574-5p或miR-4701-3p。

在一个具体实施例中，所述分子标志物为miR-4455和miR-574-5p的组合。

在另一个具体实施例中，所述分子标志物为miR-4455和miR-4701-3p的组合。

在另一个具体实施例中，所述分子标志物为miR-574-5p和miR-4701-3p的组合。

第二方面，本发明提供所述分子标志物的用途。

所述的分子标志物在制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

第三方面，本发明提供一种结核性胸膜炎辅助诊断试剂盒。

一种结核性胸膜炎辅助诊断试剂盒，包括检测权利要求1～3任一项所述标志物表达量的试剂。

进一步的，所述试剂盒还包括RNA提取、反转录及qPCR检测的试剂。

进一步的，所述检测表达量的试剂为检测引物；

其中miRNA上游引物分别为：

hsa-miR-574-5p，其序列为5’-TCGGCAGGTGAGTGTGTGT-3’；

hsa-miR-4455，其序列为5’-GCCGAGAGGGTGTGTGTGTT-3’；

hsa-miR-4701-3p，其序列为5’-TCGGCAGGATGGGTGATG-3’；

下游引物为通用引物，其序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

第四方面，本发明还提供结核性胸膜炎诊断试剂盒的用途。

所述的诊断试剂盒制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

为了鉴定用于区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的胸腔积液差异miRNA，并揭示结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病形成的不同病理生理过程，本发明提供了一项全基因组miRNA芯片筛查，完成了包括临床常见的3类结核性胸膜炎患者(组1共6例，组2共7例，组3共7例，合计20例)和恶性胸膜疾病患者(6例)的胸腔积液miRNA特异表达谱的筛选和对比分析，其中3类不同的结核性胸膜炎患者分别与恶性胸膜疾病患者的胸腔积液miRNA表达谱进行对比分析，发现10个miRNA在三类结核性胸膜炎组与恶性胸膜疾病组相比中都具有统计学差异。

进一步在另一组独立人群中对这10个差异miRNA进行了qPCR验证，包括结核性胸膜炎患者188例、恶性胸膜疾病患者122例。验证结果说明胸腔积液中miR-574-5p、miR-4701-3p和miR-4455的表达在结核性胸膜炎组仍然显著高于恶性胸膜疾病组，差异具有统计学意义(P<0.0001)。

受试者操作特征曲线(ROC)分析显示，这3种miRNA用于结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病鉴别诊断的ROC曲线下面积(AUC)均大于0.9。

本发明首次使用高通量微阵列芯片鉴定用于区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的胸腔积液差异miRNA，并在独立样本中进一步验证。

本发明提供了结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病患者的胸腔积液miRNA谱，有助于更好地了解这两种疾病的发病机制，更重要的是鉴定获得了可用于鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的病灶部位的miRNA，对于提高结核性胸膜炎的诊断十分重要。

与现有技术相比，本发明提供的一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物及其应用的优点：

(1)鉴别效果好。

(2)敏感性高。

(3)特异性高。

(4)适用于诊断，准确性高。

附图说明

图1是ROC曲线分析miR-4455用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图2是ROC曲线分析miR-574-5p用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图3是ROC曲线分析miR-4701-3p用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图4是ROC曲线分析miR-574-5p联合miR-4701用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图5是ROC曲线分析miR-574-5p联合miR-4455用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图6是ROC曲线分析miR-4701-3p联合miR-4455用于结核性胸膜炎及恶性胸膜疾病鉴别诊断的价值结果。

图4中A为贝叶斯模型；B为决策树模型；C为Logistic回归模型；D为支持向量机模型。

图5中A为贝叶斯模型；B为决策树模型；C为Logistic回归模型；D为支持向量机模型。

图6中A为贝叶斯模型；B为决策树模型；C为Logistic回归模型；D为支持向量机模型。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。

一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物，所述的分子标志物为miR-4455、miR-574-5p和/或miR-4701-3p。

进一步的，所述分子标志物为miR-4455和miR-574-5p的组合、miR-4455和miR-4701-3p的组合、miR-574-5p和miR-4701-3p。

进一步的，所述分子标志物为miR-4455、miR-574-5p和miR-4701-3p。

本发明还提供所述分子标志物的用途。

所述的分子标志物在制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

本发明还提供一种结核性胸膜炎辅助诊断试剂盒。

一种结核性胸膜炎辅助诊断试剂盒，包括检测权利要求1～3任一项所述标志物表达量的试剂。

进一步的，所述试剂盒还包括RNA提取、反转录及qPCR检测的试剂。

进一步的，所述检测表达量的试剂为检测引物；

其中miRNA上游引物分别为：

hsa-miR-574-5p，其序列为5’-TCGGCAGGTGAGTGTGTGT-3’；

hsa-miR-4455，其序列为5’-GCCGAGAGGGTGTGTGTGTT-3’；

hsa-miR-4701-3p，其序列为5’-TCGGCAGGATGGGTGATG-3’；

下游引物为通用引物，其序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

本发明还提供结核性胸膜炎诊断试剂盒的用途。

所述的诊断试剂盒制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

实施例1

miRNA芯片筛查试验

(1)研究对象

结核性胸膜炎患者：根据临床证据级别纳入三类结核性胸膜炎患者，

组1(TPE1)：胸腔积液结核杆菌病原学检测阳性的患者；

组2(TPE2)：胸腔积液结核杆菌病原学检测阴性但痰标本病原学检测阳性的患者；

组3(TPE3)：胸腔积液和痰结核杆菌病原学检测均阴性，但临床诊断为结核性胸膜炎。

结核性胸膜炎患者入组标准：

①临床有低热、盗汗、消瘦、胸痛、干咳等临床症状；

②胸腔积液符合渗出液改变；

③经抗结核治疗后胸腔积液吸收，临床症状缓解；

④胸腔积液结核杆菌病原学检测阳性；

⑤痰液结核杆菌病原学检测阳性；

⑥胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)大于40U/L。具备第①～③项，且④～⑥项中任意一项者。

病原学检测阳性包括：结核分枝杆菌培养阳性，或者结核分枝杆菌涂片抗酸染色阳性，或者结核分枝杆菌分子生物学检测阳性。

恶性胸膜疾病患者：纳入1组恶性胸膜疾病患者。

恶性胸膜疾病患者入组标准：胸腔积液脱落细胞学检查找到恶性肿瘤细胞或胸膜活检确诊胸膜组织中存在肿瘤细胞，并除外合并有细菌和结核感染等其它原因所致胸腔积液。

(2)芯片检测数据

组1(TPE1)：胸腔积液结核杆菌病原学检测阳性的患者，共6例；

组2(TPE2)：胸腔积液结核杆菌病原学检测阴性但痰标本病原学检测阳性的患者，共7例；

组3(TPE3)：胸腔积液和痰结核杆菌病原学检测均阴性，但临床诊断为结核性胸膜炎，共7例。

纳入1组肺癌患者，经病理和细胞学检测确认为肺癌，共6例。

芯片检测：按照商品化血液/血浆提取纯化试剂盒(QIAGEN，德国)说明书从患者胸腔积液样本(200μL)中提取总RNA。采用Agilent 8*60k人类miRNA微阵列芯片进行检测(包含miRbaseV21.0数据库中2549个人类miRNA的探针)，将总RNA(100ng)作为样本进行标记和杂交，使用扫描仪控制软件将微阵列图像信息转换为光点强度值用于计算，将原始样本检测数据标准化后得到MPE/TPE的差异倍数(Fold change，Fc)。

分析结果见表1。

表1 miRNA芯片结果分析

注：TPE为结核性胸膜炎组，其中TPE1胸腔积液结核杆菌病原学检测阳性组，TPE2为胸腔积液结核杆菌病原学检测阴性但痰液结核杆菌病原学检测阳性，TPE3为胸腔积液和痰液结核杆菌病原学检测均阴性，但临床诊断为结核性胸膜炎。MPE为恶性胸膜疾病组。P值为恶性胸膜疾病组与结核性胸膜炎组标准化信号值比较结果，p<0.05为有统计学意义。Fc,fold change(差异倍数)。

由表1可知，上述10个miRNA在三类结核性胸膜炎组与恶性胸膜疾病组相比中都具有统计学差异。

实施例2

qPCR验证试验

(1)试剂：

qPCR用内参基因：Cel-miR-39(QIAGEN，德国)；

RNA提取、反转录及qPCR检测的试剂为商业化试剂(QIAGEN，德国)。

(2)引物：

miRNA上游引物

Cel-miR-39：5‘-GCCGAGAGCTGATTTCGTCT-3’

hsa-miR-574-5p：5’-TCGGCAGGTGAGTGTGTGT-3’

hsa-miR-4455：5’-GCCGAGAGGGTGTGTGTGTT-3’

hsa-miR-4701-3p：5’-TCGGCAGGATGGGTGATG-3’

下游引物为通用引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’

(3)仪器：ABI Quantistudio7。

(4)试验方法：

将上述10个miRNA进行大样本量qPCR验证试验(结核性胸膜炎患者188例、恶性胸膜疾病患者122例)。具体实验过程如下：

1)RNA提取：取250μL胸腔积液，在4℃、16000×g、离心10min后，吸取上层胸腔积液200μL，加入1mL TRIzol裂解5min，加入200μL氯仿以及3.5μL Spike-ln control cel-miR-39-3p内参(1.6×10⁸拷贝量/μL)，充分震荡混匀15s，室温放置2～3min，4℃、12000×g、离心15min。转移上层透明水相至新的无酶离心管中，加入1.5倍体积的100％分析纯乙醇，充分混匀，加入收集柱中，室温10000×g离心15s，依次加入700μL RWT洗液和500μLRPE洗液，室温10000×g离心15s，加入500μL 80％乙醇，室温10000×g离心2min，然后将收集柱放入新的离心管中，室温14000×g离心5min至膜完全干燥。将收集柱放入新的离心管中，加入14μL RNase-free ddH₂0，室温放置2min，室温14000×g离心1min，收集离心管中液体，使用超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000)测定RNA浓度和纯度。

2)RNA反转录：根据RNA的浓度和反转录试剂盒(miScript II RT Kit，QIAGEN)说明书进行操作。取4μL miScript HiSpec buffer(5×)、2μL miScript Nucleics Mix(10×)、2μL miScript Reverse Transcriptase Mix、100ngRNA和适量RNase-free ddH₂O组成20μL反转录体系。37℃孵育60min，95℃灭活酶5min，完成反转录。

3)qPCR扩增：按照miScript PreAMP PCR Kit说明书进行预扩增，取待检测miRNA的引物(10×)各10μL，混合并稀释至0.4×，制成引物Mix备用。预扩增缓冲液5μL、HotStarTaq DNA聚合酶2μL、引物Mix 5μL、通用引物1μL、cDNA5μL、7μL nuclease-freeddH₂O，配置成25μL预扩增反应体系，在普通PCR仪(Mycycler，Bio-rad)按照如下程序完成预扩增：95℃15min，然后94℃30s和60℃3min循环12次。预扩增产物进行8x稀释，然后取2μL预扩增产物稀释液、10μL PCR Master Mix(2×)、2μL待检测miRNA引物(10×)、2μL通用引物(10×)、6μL RNase-free ddH₂O，组成20μL qPCR扩增体系，在qPCR检测仪(Quantistudio7，ABI)按照如下程序完成扩增：95℃15min，然后94℃15s，55℃ 30s，70℃30s循环40次。

4)根据qPCR检测数据，以cel-miR-39为内参，采用2^-ΔCT法计算各靶标miRNA的相对表达量。

(5)原始检测数据见表2。

表2 qPCR检测原始数据(相对表达量)

TPE：结核性胸膜炎；MPE：恶性胸膜疾病

(5)qPCR验证结果分析结果见表3。

表3.qPCR验证结果分析

miRNA	Fc(MPE/TPE)	P	μ(MPE)	μ(TPE)
					miR-574-5p	0.05	<0.000	10.039±13.82	201.72±262.21
miR-4455	0.06	<0.000	0.054±0.075	0.93±1.19
					miR-4701-3p	0.04	<0.000	0.22±0.47	5.75±9.07

注：TPE结核性胸膜炎组，MPE为恶性胸膜疾病组。P值为恶性胸膜疾病组与结核性胸膜炎组相对表达量比较结果(Mann-Whitney U test)，p<0.05为有统计学意义。Fc,foldchange(差异倍数)。μ组内均数±标准差。

实施例3

ROC分析单个miRNA的诊断敏感性和特异性分析

应用受试者工作特征曲线(ROC)在188例结核性胸膜炎患者和122例恶性胸膜疾病患者中对胸腔积液miR-574-5p、miR-4701-3p和miR-4455这三个差异miRNA进行了ROC曲线分析，结果见表4所示。

ROC曲线下面积如图1～3所示。

表4.胸腔积液中单一miRNA鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的诊断价值

结果说明miR-574-5p、miR-4701-3p和miR-4455用于结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病鉴别诊断的ROC曲线下面积(AUC)均大于0.9，其中胸腔积液miR-574-5p具有鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的能力。

实施例4

基于不同数学模型构建的诊断模型价值分析

3个miRNA不同组合下，基于不同数学模型构建的诊断模型价值结果如表5～7以及图4～6所示。

表5 miR-574-5p_miR-4701-3p不同组合下鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的价值

表6 miR-4701-3p_miR-4455不同组合下鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的价值

表7 miR-574-5p_miR-4455不同组合下鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病的价值

由表5～7和图4～6可知，本发明提供的用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物miR-4455、miR-574-5p和/或miR-4701-3p可用于鉴别诊断结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病，具备临床诊断的实际价值。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种用于诊断结核性胸膜炎的分子标志物，其特征在于：所述的分子标志物为miR-4455或miR-574-5p或miR-4701-3p。

2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于：所述分子标志物为miR-4455和miR-574-5p的组合、miR-4455和miR-4701-3p的组合、miR-574-5p和miR-4701-3p的组合。

3.根据权利要求1或2所述的分子标志物在制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

4.根据权利要求3所述用途，其特征在于：所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

5.一种结核性胸膜炎辅助诊断试剂盒，其特征在于：包括检测权利要求1～3任一项所述标志物表达量的试剂。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA提取、反转录及qPCR检测的试剂。

7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述检测表达量的试剂为检测引物；

其中miRNA上游引物分别为：

hsa-miR-574-5p，其序列为5’-TCGGCAGGTGAGTGTGTGT-3’；

hsa-miR-4455，其序列为5’-GCCGAGAGGGTGTGTGTGTT-3’；

hsa-miR-4701-3p，其序列为5’-TCGGCAGGATGGGTGATG-3’；

下游引物为通用引物，其序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。

8.权利要求5～7任一项所述的诊断试剂盒制备结核性胸膜炎诊断试剂或试剂盒中的用途。

9.根据权利要求8所述用途，其特征在于：所述诊断为区分结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病。

Images