CN113817817A - 一种诊断过敏性气道炎症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诊断过敏性气道炎症的方法。具体来说,本发明人发现了一种可用于诊断过敏性气道炎症的非编码RNA,所述的非编码RNA为OVCH1‑AS1。该非编码RNA作为诊断标志物对过敏性气道炎症具有较好的灵敏性和特异性,可用于诊断过敏性气道炎症,对过敏性气道炎症的治疗和用药具有重要的指导作用。

Description

一种诊断过敏性气道炎症的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种诊断过敏性气道炎症的方法。
背景技术
随着医学的进展,许多研究者已经认识到过敏性鼻炎和哮喘病往往同时存在。临床上有些患者以过敏性鼻炎为主而哮喘未确诊或处于亚临床状态,而更多的病人则可两种疾病同时存在。因此近年来提出了过敏性鼻炎-哮喘综合征(Combined Allergic Rhinitisand Asthma Syndrome,CARAS)这个新的医学术语。过敏性鼻炎与哮喘病的关系源于呼吸道的连续性。呼吸道起于鼻腔,终止于肺泡,解剖结构和生理功能上呈连续性。由此早有学者提出了“联合呼吸道”(unitedairways)、“过敏性鼻支气管炎”和“全气道炎症综合征”等类似的新概念,认为上下呼吸道疾病需要整体对待,进行联合诊断和联合治疗。也有人提出了过敏综合征(atopicsyndrome)的概念,认为应该全身综合治疗。目前世界变态反应组织(WAO)及下属的Allergy&Clinical Immunology International杂志和InternationalArchives of Allergy and Immunology杂志根据读者的反馈意见,提出采用过敏性鼻炎-哮喘综合征这一术语。目前,WAO已经将过敏性鼻炎-哮喘综合征以正式病名列入该组织网站的关键词。
过敏性鼻炎-哮喘综合征的诊断标准参照过敏性鼻炎(AR)、支气管哮喘(BA)的临床诊断标准。目前尚无用于诊断CARAS的生物标志物。寻找特异、敏感的生物标志物,为临床提供一种新的诊断CARAS的方法,及时确诊后可将过敏性鼻炎和哮喘病进行联合治疗,同时控制上、下呼吸道炎症,并通过控制上呼吸道的炎症来预防哮喘的发作。
发明内容
本发明公开了一种诊断过敏性气道炎症的方法。具体来说,本发明人发现了一种可用于诊断过敏性气道炎症的非编码RNA,所述的非编码RNA为OVCH1-AS1。
基于上述发现,本发明提供了以下技术方案:
本发明第一方面提供了测量样品中非编码RNA表达水平的试剂在制备诊断过敏性气道炎症的工具中的应用,所述的非编码RNA包括OVCH1-AS1。
在本发明中,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
本文所用的术语“ncRNA”或“非编码RNA”指不能翻译成蛋白的功能性RNA分子。从其转录非编码RNA的DNA序列通常在本领域称为RNA基因。本领域常用的术语“lncRNA”或“长非编码RNA”指包含大于200个核苷酸的ncRNA。
在本发明中,所述非编码RNA例如OVCH1-AS1(Gene ID:101055625)包括gene及其突变。
术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用,用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物,其包含有待根据例如物理,生化,化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。样本包括但不限于,组织样本(例如肿瘤组织样本),原代或培养的细胞或细胞系,细胞上清,细胞裂解物,血小板,玻璃体液,淋巴液,滑液,滤泡液,精液,羊水,乳,血液,血液衍生的细胞,尿液,脑脊髓液,唾液,痰,泪,汗液,粘液,肿瘤裂解物,和组织培养液,组织提取物如匀浆化的组织,肿瘤组织,细胞提取物,及其组合。
在本发明中,所述的样品为血液。
本发明第二方面提供了一种诊断过敏性气道炎症的工具,所述的工具包括测量样品中非编码RNA表达水平的试剂,所述的非编码RNA包括OVCH1-AS1。
进一步,所述的试剂包括通过微阵列分析、聚合酶链式反应、逆转录酶聚合酶链式反应、Northern印迹、Southern印迹或基因表达的系列分析测量所述的非编码RNA的表达水平的试剂。
生物标志物的表达水平是通过测量生物标志物的多核苷酸水平来测定。特定生物标志物基因的转录物水平可由生物样本中所存在的mRNA或来源于其的多核苷酸的量来测定。多核苷酸可通过多种方法检测和定量,所述方法包括(但不限于)微阵列分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、Southern印迹和基因表达的系列分析(SAGE)。参见例如Draghici《DNA微阵列的数据分析工具(DataAnalysisTools for DNA Microarrays)》,Chapman and Hall/CRC,2003;Simon等人《DNA微阵列研究的设计和分析(Design and Analysis of DNA Microarray Investigations)》,Springer,2004;《实时PCR:当前技术和应用(Real-Time PCR:Current TechnologyandApplications)》,Logan,Edwards和Saunders编,Caister Academic Press,2009;Bustin《定量PCR的A-Z(A-Z of Quantitative PCR)》(IUL生物技术,第5期),InternationalUniversity Line,2004;Velculescu等人(1995)《科学》270:484-487;Matsumura等人(2005)《细胞微生物学(Cell.Microbiol.)》7:11-18;《基因表达的系列分析(SAGE):方法和方案(分子生物学方法)(Serial Analysis of Gene Expression(SAGE):Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology))》,Humana Press,2008;其以全文引用的方式并入本文中。
进一步,所述的试剂包括:
(1)能够特异性扩增OVCH1-AS1的引物;或
(2)能够与OVCH1-AS1特异性杂交的探针。
本文所用的“引物”是指可以在扩增方法(如聚合酶链式反应(PCR))中使用来基于对应于目的基因(例如,OVCH1-AS1的序列或其一部分)的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的至少一条PCR引物对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于多种因素,包括温度、引物来源和所用的方法。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂性,寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25或更多个核苷酸,但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。确定引物合适长度中涉及的因素是本领域技术人员熟知的。具体实施方案中所用的引物如本文的表4所示,其中标明了它们的具体应用。术语“引物对”表示与靶DNA分子的相反链杂交或与位于待扩增的核苷酸序列侧翼的靶DNA区域杂交的引物对。术语“引物位点”表示与引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
如本文所用,术语“探针”是指能够选择性结合特定预期目标生物分子的任何分子。在一些实施方案中,本文中,术语“探针”是指可间接地或直接地、共价地或非共价地结合至本文公开的任何底物和/或反应产物和/或蛋白酶的任何分子或与其相关,并且其相关或结合可使用本文公开的方法检测。在一些实施方案中,探针是荧光探针、抗体或基于吸光度的探针。如果是基于吸光度的探针,发色团pNA(对硝基苯胺)可用作检测和/或定量本文公开的靶核酸序列的探针。在一些实施方案中,探针可以是包含荧光分子或底物的核酸序列,该荧光分子或底物在暴露于酶时变为发荧光的,并且该核酸序列与一种核酸序列的片段互补。
在本发明的具体实施例中,所述的引物的序列如SEQ ID No.3-4所示。
进一步,所述的工具包括试剂盒、芯片、试纸。
本发明提供了用于诊断过敏性气道炎症的试剂盒,其中,所述的试剂盒可用于检测本发明的生物标志物。试剂盒可包括一种或多种用于检测生物标志物的试剂、用于盛放从疑似患有过敏性气道炎症的人类受试者分离的生物样本的容器;以及用于使试剂与生物样本或一部分生物样本反应以检测生物样本中至少一种过敏性气道炎症生物标志物的存在或量的印刷说明书。试剂可封装在单独的容器中。
试剂盒可包含一个或多个用于容纳试剂盒中所含组合物的容器。组合物可呈液体形式或可冻干。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料形成,包括玻璃或塑料。试剂盒还可包含药品说明书,其含有诊断过敏性气道炎症方法的书面说明。
在本发明中,“芯片”也称为“阵列”,指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列,也称为“微阵列”,通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列,所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面,或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列,从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上,所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质,例如,玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质,例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
本发明第三方面提供了一种筛选治疗过敏性气道炎症的候选药物的方法,包括步骤:
1)在测试组中,向待测对象施用待测试药物,检测测试组中来源于所述对象的样品中OVCH1-AS1的表达水平V1;在对照组中,向待测对象施用空白对照,检测对照组中来源于所述对象的样品中OVCH1-AS1的表达水平V2;
2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2,从而确定所述测试化合物是否是治疗过敏性气道炎症的候选药物。
进一步,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
本发明第四方面提供了OVCH1-AS1的促进剂在制备治疗过敏性气道炎症的药物组合物中的应用。
所述的OVCH1-AS1的促进剂是指任何可提高OVCH1-AS1基因或表达产物稳定性、上调OVCH1-AS1的表达、增加OVCH1-AS1的有效作用时间或促进OVCH1-AS1基因的转录的物质,这些物质均可用于本发明,作为对于上调OVCH1-AS1基因的表达有用的物质,从而可用于治疗过敏性气道炎症。
本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的载体。术语载体包括适用于制备所需特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括,但不限于,糖,诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素及其衍生物,诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;粉末黄蓍胶;麦芽;明胶;滑石;赋形剂,诸如可可脂和栓剂蜡;油,诸如花生油、棉籽油、红花油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;二醇,诸如丙二醇;酯,诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯;琼脂;缓冲剂,诸如氢氧化镁和氢氧化铝;海藻酸;无热原水;等渗盐水;林格氏液;乙醇和磷酸盐缓冲液,以及根据配制人员的判断,组合物中还可以存在其他无毒相容的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁,以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
本发明第五方面提供了一种用于执行一种计算机实施的用于诊断疑似患有过敏性气道炎症的患者的方法的诊断系统,所述的计算机执行包含以下的步骤:
1)接受所输入的患者数据,包含来自所述患者的生物样本中OVCH1-AS1的表达水平值;
2)分析生物标志物的水平并与生物标志物的相应参考值范围相比,若所述患者的OVCH1-AS1的水平低于未患病的对照受试者的参考值范围提示所述患者患有过敏性气道炎症;
3)显示关于所述患者的诊断信息,
其中所述诊断系统包含:
1)用于存储数据的存储组件,其中所述存储组件具有用于确定存储在其中的受试者诊断的指令;
2)用于处理数据的计算机处理器,其中所述计算机处理器被耦合到所述存储组件并且被配置成执行存储在所述存储组件中的指令以便接收患者数据并根据一种或多种算法分析患者数据;以及
3)用于显示关于所述患者的诊断信息的显示器组件;
进一步,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
附图说明
图1是RNA电泳图;
图2是内参GAPDH基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图,其中,图A为GAPDH基因实时扩增曲线图,图B为产物溶解曲线图;
图3是OVCH1-AS1基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图,其中,图A为OVCH1-AS1基因实时扩增曲线图,图B为产物溶解曲线图;
图4是OVCH1-AS1差异表达的柱状图;
图5是OVCH1-AS1的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 Real Time PCR检测过敏性鼻炎-哮喘综合征患者血液样本中目的基因表达量的变化
一、实验目的
用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法检测过敏性鼻炎-哮喘综合征患者血液样本中目的基因lncRNA转录水平的变化情况。
二、实验材料
1.样本清单
本研究招募了20个过敏性鼻炎-哮喘综合征患者和20个正常人,临床信息如表1所示,采集血液样本用于分析研究。
表1参与这项研究的人员的基本临床信息
Figure BDA0003315663940000071
Figure BDA0003315663940000081
2.实验主要试剂
表2使用试剂清单
Figure BDA0003315663940000082
3.实验主要仪器
表3使用仪器清单
仪器名称 仪器型号 厂家
NanoVue Plus 28956057 BIOCHROM LTD
荧光定量PCR仪 ABI7300 Applied Biosystems
三、实验方法
1.引物设计
1.1 Real Time PCR检测目的基因引物。以下引物在博迈德公司合成。
表4引物序列
Figure BDA0003315663940000091
2.实验过程
2.1提取样本总RNA
①每0.25mL液体样本(血清,血浆,脑脊液等)加入0.75mL裂解液RLS,用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml裂解液RLS。裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3:1。
②在EP管中加入0.75mL裂解液RLS,再加入0.25mL血液样本,用力连续震摇30s,混匀,在15-30℃条件下孵育10min以使核蛋白体完全分解。
③每0.75mL裂解液RLS加0.2mL氯仿,剧烈震荡15s并室温下放置5min。
④于4℃12000rpm离心10min,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于上层水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
⑤加入1倍体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
⑥12000rpm离心45s,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
⑦加0.5mL去蛋白液RE,12000rpm离心45s,弃掉废液。
⑧加入0.5mL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心45s,弃掉废液。
⑨加入0.5mL漂洗液RW,12000rpm离心45s,弃掉废液。
⑩将吸附柱RA放回孔收集管中,13000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
Figure BDA0003315663940000101
取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50uL RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2min,12000rpm离心1min。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1min,或者另外加入再加30ul RNase free water,离心1min,合并两次洗脱液。
2.2逆转录合成lncRNA cDNA
采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR106)进行lncRNA反转录,首先去除基因组DNA反应,在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0ul,TotalRNA 1ug,加Rnase FreeddH2O使总体积至10ul,水浴锅中42℃加热3min,再将10×Fast RT Buffer 2.0uL,RTEnzyme Mix 1.0uL,FQ-RT Primer Mix 2.0uL,RNase Free ddH2O 5.0uL,混合后加入上述试管中一起混合共20uL,水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min,合成的cDNA需要长期保存时,请于-20℃或更低温度保存。
2.3 mRNA荧光定量检测
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7300型荧光定量PCR仪,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
2.3.2操作过程如下:
(一)反应体系:用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号:FP205),进行扩增,实验操作按产品说明书进行。RealTime反应体系为:
表5 RealTime反应体系
试剂 使用量
2×SuperReal PreMix Plus 10μl
上游引物(10uM) 0.6μl
下游引物(10uM) 0.6μl
50×ROX Reference Dye<sup>△</sup> 2μl
DNA模板 2ul
灭菌蒸馏水 4.8ul
(二)扩增程序为:95°15min,(95℃10sec,55℃30sec,72℃32sec)×40个循环,95℃15sec,60℃60sec,95℃15sec)。
(三)引物筛选
将各样本cDNA混合后,以此为模板进行10倍梯度稀释,稀释后样品各取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增,同时在60-95℃进行融解曲线分析,根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(四)样品RealTimePCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见表五)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
表6样品RealTimePCR检测设计
模板 样品cDNA 样品cDNA
重复检测孔道数 3 3
引物 目的基因引物 内参基因引物
(五)数据统计
将运行程序下机所导出的原始结果ct值按照上样顺序进行整理,得到各个样本每个基因的三个复孔原始ct值,在excel中分别求出目的基因与内参基因的三个复孔ct值的平均值,分别计算对照组(癌旁组织)和试验组(胃癌组织)中目的基因相对于内参基因的表达,采用GraphPad软件进行统计分析,两者之间的差异采用t检验。
四、实验结果
1.RNA浓度检测结果及1.5%琼脂糖RNA电泳检测结果
表7 RNA浓度及纯度结果
Figure BDA0003315663940000121
Figure BDA0003315663940000131
注:
RNA溶于水中会导致A260/280比值偏低
A:浓度未达标准;B:A260/A280不合格;C:电泳图不合格;H:合格
样本评判标准:
(1)浓度>30ng/ul
(2)1.8<A260/A280<2.0
(3)电泳图可以看到较清晰三条带(第三条可能会看不到)
表8电泳上样情况
Figure BDA0003315663940000132
Figure BDA0003315663940000141
Figure BDA0003315663940000151
RNA电泳图如图1所示,其中M表示DNA Marker:DM2000,从下往上依次为100,250,500,750,1000和2000bp,其中750bp为亮带。
2.各样品RealTimePCR检测结果及分析
各样本实时扩增曲线图和样本扩增产物溶解曲线图如图2、3所示。
统计结果如图4所示,与健康对照组相比,过敏性鼻炎-哮喘综合征组样本中OVCH1-AS1表达下调。
实施例2 OVCH1-AS1的诊断效能验证
采用SPSS软件绘制受试者工作曲线(ROC),分析AUC值、敏感性和特异性,判断指标单独的诊断效能。
如表9、图5所示,OVCH1-AS1具有较高的诊断效能(AUC值为0.705,敏感性值为1.000,特异性值为0.500),提示OVCH1-AS1可用于诊断过敏性鼻炎-哮喘综合征。
表9 ROC曲线下方的区域
Figure BDA0003315663940000161
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式,但是,本申请并不限于上述实施方式中的具体细节,在本申请的技术构思范围内,可以对本申请的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本申请的思想,其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 常州市第二人民医院
<120> 一种诊断过敏性气道炎症的方法
<141> 2021-10-22
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgggctaca ctgagcacc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtggtcgt tgagggcaat g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggtcacag cacagatct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtgagaag ggccaaacac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttccccat ttgccctgtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattggtga gggtggtggt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtgagcga tggttgtgc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtccctcca gtgaaggct 19

Claims (10)

1.测量样品中非编码RNA表达水平的试剂在制备诊断过敏性气道炎症的工具中的应用,其特征在于,所述的非编码RNA包括OVCH1-AS1,优选的,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选的,所述的过敏性气道炎症为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的样品为血液。
3.一种诊断过敏性气道炎症的工具,所述的工具包括测量样品中非编码RNA表达水平的试剂,其特征在于,所述的非编码RNA包括OVCH1-AS1。
4.根据权利要求3所述的工具,其特征在于,所述的试剂包括通过微阵列分析、聚合酶链式反应、逆转录酶聚合酶链式反应、Northern印迹、Southern印迹或基因表达的系列分析测量所述的非编码RNA的表达水平的试剂。
5.根据权利要求3所述的工具,其特征在于,所述的试剂包括:
(1)能够特异性扩增OVCH1-AS1的引物;或
(2)能够与OVCH1-AS1特异性杂交的探针。
6.根据权利要求5所述的工具,其特征在于,所述的引物的序列如SEQ ID No.3-4所示。
7.根据权利要求3所述的工具,其特征在于,所述的工具包括试剂盒、芯片、试纸。
8.一种筛选治疗过敏性气道炎症的候选药物的方法,其特征在于,包括步骤:
1)在测试组中,向待测对象施用待测试药物,检测测试组中来源于所述对象的样品中OVCH1-AS1的表达水平V1;在对照组中,向待测对象施用空白对照,检测对照组中来源于所述对象的样品中OVCH1-AS1的表达水平V2;
2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2,从而确定所述测试化合物是否是治疗过敏性气道炎症的候选药物;
优选的,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选的,所述的过敏性气道炎症为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
9.OVCH1-AS1的促进剂在制备治疗过敏性气道炎症的药物组合物中的应用。
10.一种用于执行一种计算机实施的用于诊断疑似患有过敏性气道炎症的患者的方法的诊断系统,所述的计算机执行包含以下的步骤:
1)接受所输入的患者数据,包含来自所述患者的生物样本中OVCH1-AS1的表达水平值;
2)分析生物标志物的水平并与生物标志物的相应参考值范围相比,若所述患者的OVCH1-AS1的水平低于未患病的对照受试者的参考值范围提示所述患者患有过敏性气道炎症;
3)显示关于所述患者的诊断信息,
其中所述诊断系统包含:
1)用于存储数据的存储组件,其中所述存储组件具有用于确定存储在其中的受试者诊断的指令;
2)用于处理数据的计算机处理器,其中所述计算机处理器被耦合到所述存储组件并且被配置成执行存储在所述存储组件中的指令以便接收患者数据并根据一种或多种算法分析患者数据;以及
3)用于显示关于所述患者的诊断信息的显示器组件;
优选的,所述的过敏性气道炎症包括过敏性鼻炎、哮喘病、过敏性鼻炎-哮喘综合征,优选的,所述的过敏性气道炎症为过敏性鼻炎-哮喘综合征。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130052258A1 (en) * 2009-09-22 2013-02-28 Xmedic Ab Polypeptides and uses thereof
CN104726601A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 常州市第二人民医院 与哮喘发病危险度相关的snp标记及其应用
CN106636413A (zh) * 2016-12-28 2017-05-10 常州市第二人民医院 一种用于诊断哮喘的分子标志物
CN107267649A (zh) * 2017-08-08 2017-10-20 常州市第二人民医院 Stradb在哮喘早期诊断中的应用
CN108676872A (zh) * 2018-07-11 2018-10-19 常州市第二人民医院 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用
CN109439744A (zh) * 2018-12-24 2019-03-08 常州市第二人民医院 重症哮喘诊断用分子标志物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130052258A1 (en) * 2009-09-22 2013-02-28 Xmedic Ab Polypeptides and uses thereof
CN104726601A (zh) * 2015-03-31 2015-06-24 常州市第二人民医院 与哮喘发病危险度相关的snp标记及其应用
CN106636413A (zh) * 2016-12-28 2017-05-10 常州市第二人民医院 一种用于诊断哮喘的分子标志物
CN107267649A (zh) * 2017-08-08 2017-10-20 常州市第二人民医院 Stradb在哮喘早期诊断中的应用
CN108676872A (zh) * 2018-07-11 2018-10-19 常州市第二人民医院 一种与哮喘相关的生物标志物及其应用
CN109439744A (zh) * 2018-12-24 2019-03-08 常州市第二人民医院 重症哮喘诊断用分子标志物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "Gene ID: 101055625", 《NCBI》 *

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