CN114682232B

CN114682232B - 一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114682232B
Application number: CN202210432970.3A
Authority: CN
Inventors: 吕海霞; 刘玥; 曾宇
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114682232A

Abstract

本发明公开了一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法及应用，属于分析化学领域。所述整体柱通过桥联环糊精和壳聚糖双单体构建手性环境，与尿素和甲醛一锅热缩聚法在30 min内快速制备得到。本发明制备方法简单，反应快速，以桥联环糊精和壳聚糖作为手性功能单体，建立双手性选择剂“协同作用”的共功能化系统，使整体柱骨架上同时拥有双手性选择剂，提高手性中心数量和分离效果，通过电色谱实现了N‑苄氧羰基‑DL‑天冬酰胺、DL‑酪氨酸、DL‑苯丙氨酸的手性分离。

Description

一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法及应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法及应用。

背景技术

手性异构体是分子式相同但空间结构不同的两种化合物，广泛应用于药物、临床、病理等领域，虽然其物理和化学性质几乎相同，但不同对映异构体在药理活性、代谢作用、毒性等方面有很大差异，甚至有相反的作用，因此，实现手性化合物的拆分具有重要研究意义。在过去的几十年中，手性整体柱因其良好的传质性能、低背压和高分离效率，在对映体分离领域受到广大研究者的青睐。但大多数的手性整体柱制备过程相对复杂且耗时，因此，寻求一种快速制备高分离性能手性整体柱的方法是一项有意义的研究。

桥联环糊精(BCD)是一种由两种或多种天然CD偶联而成的新型超分子化合物。通过功能桥联剂桥接两个或多个空腔，BCD可以显著增强天然CD的原始结合能力和分子选择性，因此被广泛应用于手性分离领域。我们课题组( Polymer Chemistry. 2021, 42(12):6123-6133)分别以亚甲基双丙烯酰胺和1,2-二羟乙烯双丙烯酰胺为桥联剂，通过“一锅法”制备得到BCD手性整体柱，实现了七种对映体的基线分离。但目前对桥联剂的研究还不够广泛，因此，开发新型桥联剂对于对映体分离具有重要意义。

壳聚糖(CS)是甲壳素脱去乙酰基的衍生物，是光学活性的阳离子型天然多糖，具有生物相容性、生物可降解性和无毒等特点，其结构上存在着大量的手性中心，具有出色的对映分离能力，目前CS填充柱和CS开管柱广泛用于手性化合物的识别和分离，但关于CS整体柱应用于该领域的研究较少。

“协同作用”指的是两种或两种以上组分构成的复合系统，只要选择得当，其复合效果会优于各组分单独作用之和。根据“协同作用”，制备新型BCD和CS双单体手性整体柱，可以提升BCD单手性整体柱的手性分离性能，同时也可避免复杂的CD衍生反应，而且目前基于BCD及CS的“协同作用”用于对映异构体的手性拆分研究还未见报道。

发明内容

针对目前桥联环糊精桥联剂的开发还不够广泛，且未与壳聚糖“协同作用”用于手性分离领域的问题，本发明提供了一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法，并应用于对映体分离。以桥联环糊精和壳聚糖为手性功能单体，建立双手性选择剂“协同作用”的共功能化系统，通过分子模拟初步探讨了手性分离机理。本发明中所制备的桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱操作简单，反应迅速，整体柱骨架上同时拥有双手性选择剂，提高手性中心数量和分离效果，通过电色谱实现了N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺、DL-酪氨酸、DL-苯丙氨酸的手性分离。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)毛细管柱的预处理：

将酸性试剂通入毛细管柱中30 min，以除去管壁残留的油污、碎屑等杂质，通入二次水洗涤，直至柱末端流出液中性，再将碱性试剂通入毛细管柱中3 h，对毛细管内壁进行刻蚀，使其管壁裸露出更多活性的硅羟基，向其中通入二次水直至中性，通入甲醇洗涤，氮吹30 min后，再向其中通入硅烷化试剂，60 ℃水浴条件下反应24 h后，取出毛细管柱，70℃下氮吹3 h。

上述的酸性试剂为1mol/L HCl溶液；碱性试剂为1 mol/L NaOH溶液；硅烷化试剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷/甲醇混合溶液，体积比为1:1。

(2)桥联环糊精的制备：

将环糊精和桥联剂溶于去离子水中，加入引发剂，涡旋1 min使其充分溶解，超声30 min，60 ℃水浴条件下聚合6 h，生成桥联环糊精。

上述的环糊精为单取代-巯基-β-环糊精SH-β-CD；桥联剂为N,N'-乙烯基双丙烯酰胺EBA；引发剂为2,2偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AIBA；其组成按质量分数计为：SH-β-CD 2.94-8.28%，EBA 0.21-0.60%，去离子水90.71-96.42%，AIBA 0.38-0.46%。

(3)桥联环糊精整体柱的制备：

再向桥联环糊精中加入壳聚糖、致孔剂、亲核试剂和催化剂，涡旋1 min，超声30min，加入去质子化试剂，再次涡旋和超声各30 s，将上述预聚液快速注入用3-氨丙基三甲氧基硅烷预处理好的毛细管柱中，用柱塞密封，然后在75 ℃水浴，30 min，得到桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇洗去未反应的物质直至压力稳定，于4 ℃温度下保存。

上述的壳聚糖CS粘度小于200 mPa.s；致孔剂为分子量在8500-11500的聚乙二醇PEG；亲核试剂为尿素；去质子化试剂为质量浓度为33%-37%的甲醛溶液；催化剂为0.1 mol/L HCl溶液；各部分组成按质量分数计为：桥联环糊精21.23-21.29%，CS 0.13-0.26%，PEG1.32-1.33%，尿素19.85-19.90%，甲醛溶液48.51-48.64%，催化剂8.82-8.84%。

所述整体柱应用于N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺、DL-酪氨酸、DL-苯丙氨酸的手性分离，但是所述对映异构体种类不仅限于以上种类。

(4)分离机理的研究：

通过分子模拟初步探讨了桥联环糊精-壳聚糖对手性对映体的分离机理，采用分子动力学软件对桥联环糊精进行分子模拟，实现整个系统能量最小化，再将对映体与桥联环糊精和壳聚糖对接，得到最稳定的包合物，优化后计算各部分单点能。

上述使用的分子动力学软件为Desmond；采用OPLS3e实现整个系统的能量最小化；利用Gaussian16软件包进行全优化得到最为稳定的包合物，再利用密度泛函理论(DFT)中的B3LYP方法，在6-31G(d)基组水平下对所得到的稳定包合物进行优化，得到稳定复合物后，计算主体、客体和主-客体包合物能量E_guest (kJ/mol)、E_host (kJ/mol)和E_host-guest (kJ/mol)，得到结合能∆E。

本发明的显著优点在于：

(1)本发明制备的桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱骨架上同时拥有双手性选择剂，引入更多手性中心和更多分子间相互作用，使对映体与整体柱的结合能增强。

(2)本发明制备的手性整体柱的双功能单体之间具有“协同作用”，较现有技术，本发明可以明显提升手性分离效率和分离效果。

(3)本发明制备的手性整体柱可以实现N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺、DL-酪氨酸、DL-苯丙氨酸的手性分离，分离性能优于桥联环糊精手性整体柱。

(4)本发明使用乙烯基双丙烯酰胺作为桥联剂制备桥联环糊精，与1,2-二羟乙烯双丙烯酰胺相比，桥联剂极性变小，对手性对映体的保留时间变短，柱效提高；与亚甲基双丙烯酰胺相比，桥联剂碳链长度增加，桥联剂两端连接的SH-β-CD识别区域增大，分离效率提高。

(5)本发明制备的双功能手性整体柱分离性能优于单手性整体柱，是由于双功能手性整体柱上桥联环糊精和壳聚糖通过“协同效应”，与手性对映体形成更多的π-π共轭相互作用；另一方面，双功能手性整体柱表面羟基数目增多，与对映体形成更多的氢键，手性分离能力提高。

附图说明

图1为桥联环糊精手性整体柱、桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的红外表征图谱；

图2为柱C、柱E、柱F对对映异构体N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺的手性分离性能对比；

图3为柱C、柱E、柱F对对映异构体DL-酪氨酸的手性分离性能对比；

图4为柱C、柱E、柱F对对映异构体DL-苯丙氨酸的手性分离性能对比。

具体实施方式

为进一步公开而不是限制本发明，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法，具体步骤为：

(1)精确称量1 mg EBA、13.69 mg SH-β-CD、1 mg AIBA和225 mg去离子水于离心管中，涡旋1 min使其充分溶解，超声30 min，60 ℃水浴条件下聚合6 h，生成桥联环糊精。

(2)将2.5 mg CS (粘度<200 mPa.s)、15 mg PEG (Mn=8500-115000)、100 mg HCl溶液 (0.1 mol/L)和225 mg尿素颗粒加入桥联环糊精中，涡旋1 min使其充分溶解，超声30min，加入550 mg甲醛溶液(质量分数为33%-37%，AR)，涡旋超声各30 s使离心管中溶液混合均匀，将上述溶液快速注入到氨丙基三甲氧基硅烷预处理过的毛细管柱中至一定长度(30cm)，用柱塞塞住柱两端，置于75 ℃水浴锅中反应30 min，聚合结束后，再向毛细管柱中通入CH₃OH以除去未反应的单体，得到柱C。

实施例2

在步骤(2)加入1.5 mg壳聚糖，其他步骤如实施例1，可得柱A。

实施例3

在步骤(2)加入2.0 mg壳聚糖，其他步骤如实施例1，可得柱B。

实施例4

在步骤(2)加入3.0 mg壳聚糖，其他步骤如实施例1，可得柱D。

实施例5

在步骤(2)不添加壳聚糖，其他步骤如实施例1，可得柱E。

实施例6

在步骤(2)不添加桥联环糊精，其他步骤如实施例1，可得柱F。

应用实例例1

用实施例1得到的手性整体柱(柱C、E、F)，考察桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱对N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺的手性分离能力，色谱条件为：80% ACN，pH 3.5，10 mmol/L HCOONH₄，-10 kV；反压阀：1000 psi；流速：0.1 mL/min；检测波长：214 nm。

桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱对N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺分离机理研究，具体步骤为：

(1) 将两个SH-β-CD放在同一界面下，并对其进行连接得到BCD，采用分子动力学软件Desmond对复合物进行MD模拟，使用OPLS3e实现整个系统的能量最小化。系统的平衡是在温度为300 K，压力为1.0 bar下完成的。模拟运行10 ns，时间步长为1.2 fs，每10 ps进行一次轨迹记录，总得到1000帧的记录。

(2) 固定优化好的BCD和CS，与N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺进行分子对接，以0.05nm为间隔，利用Gaussian16软件包进行全优化得到最为稳定的包合物。

(3) 利用密度泛函理论(DFT)中的B3LYP方法，在6-31G(d)基组水平下对所得到的稳定包合物进行优化，得到稳定复合物后，通过公式计算得到结合能∆E。

∆E= E_host-guest – (E_host + E_guest)

结果表明，相比桥联环糊精手性整体柱和壳聚糖手性整体柱，桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱通过双手性选择剂的“协同作用”，与N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺产生更多分子间相互作用，结合能增强。N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺在单手性整体柱上无法实现对映分离(Rs=0)；在双功能手性整体柱上实现手性拆分，Rs=1.65，N-苄氧羰基-L-天冬酰胺和N-苄氧羰基-D-天冬酰胺柱效分别为15355 plates/m，10220 plates/m。

应用实例例2

用实施例1得到的手性整体柱(柱C、E、F)，考察桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱对DL-酪氨酸的手性分离能力，色谱条件为：70% ACN，pH 3.0，10 mmol/L HCOONH₄，-10kV；反压阀：1000 psi；流速：0.1 mL/min；检测波长：214 nm。

在应用实例例1分离机理研究步骤(2)中与DL-酪氨酸进行分子对接，其他机理研究步骤如应用实例例1，可得出DL-苯丙氨酸与桥联环糊精、壳聚糖分子对接结果。

结果表明，相比桥联环糊精手性整体柱和壳聚糖手性整体柱，桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱通过双手性选择剂的“协同作用”，与DL-酪氨酸产生更多分子间相互作用，结合能增强。DL-酪氨酸在单手性整体柱上无法实现对映分离(Rs=0)；在双功能手性整体柱上实现手性拆分，Rs=1.72，L-酪氨酸和D-酪氨酸柱效分别为12760 plates/m，10998plates/m。

应用实例例3

用实施例1得到的手性整体柱(柱C、E、F)，考察桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱对DL-苯丙氨酸的手性分离能力，色谱条件为：80% ACN，pH 3.5，10 mmol/L HCOONH₄，-3 kV；反压阀：1000 psi；流速：0.1 mL/min；检测波长：214 nm。

在应用实例例1分离机理研究步骤(2)中与DL-苯丙氨酸进行分子对接，其他机理研究步骤如应用实例例1，可得出DL-苯丙氨酸与桥联环糊精、壳聚糖分子对接结果。

结果表明，相比桥联环糊精手性整体柱和壳聚糖手性整体柱，桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱通过双手性选择剂的“协同作用”，与DL-苯丙氨酸产生更多分子间相互作用，结合能增强，分离性能提高。DL-苯丙氨酸在壳聚糖手性整体柱无法实现对映分离(Rs=0)；在桥联环糊精手性整体柱和双功能手性整体柱上Rs分别为1.81、1.58，均实现完全分离，但在双功能手性整体柱上柱效有所提高(L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸在EBCMC上的柱效分别为10667 plates/m和3533 plates/m，在EBC/CSMC上的柱效分别为37633 plates/m和8800 plates/m)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将环糊精和桥联剂溶于去离子水中，加入引发剂，涡旋使其充分溶解，超声，水浴条件下聚合，生成桥联环糊精；

（2）向桥联环糊精中加入壳聚糖、致孔剂、亲核试剂和催化剂，涡旋超声，加入去质子化试剂，再次涡旋超声，将预聚液快速注入预处理好的毛细管柱中，用柱塞密封，然后通过一步热聚得到桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱；

步骤(1)中，环糊精为单取代-巯基-β-环糊精SH-β-CD；桥联剂为N,N'-乙烯基双丙烯酰胺EBA；引发剂为2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AIBA；其组成按质量分数计为：SH-β-CD 2.94-8.28%，EBA 0.21-0.60%，AIBA 0.38-0.46%，余量为去离子水；

步骤(1)中，涡旋振荡1 min，超声脱气30 min，60 ℃水浴条件下聚合反应6 h；

步骤(2)中，壳聚糖CS粘度小于200 mPa.s；致孔剂为分子量在8500~11500的聚乙二醇PEG；亲核试剂为尿素；去质子化试剂为质量浓度为33%-37%的甲醛溶液；催化剂为0.1 mol/L HCl溶液；各部分组成按质量分数计为：桥联环糊精21.23-21.29%，CS 0.13%-0.26%，PEG1.32-1.33%，尿素19.85-19.90%，甲醛溶液48.51-48.64%，催化剂8.82-8.84%，各组分质量分数之和为100%；

步骤(2)中，第一次涡旋1 min，超声30 min，第二次涡旋超声各30 s，毛细管柱事先用3-氨丙基三甲氧基硅烷预处理；

步骤(2)中一步热聚具体是指在75 ℃水浴条件下聚合反应30 min，反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱溶剂高压泵，采用甲醇洗去未反应的物质直至压力稳定，于4 ℃温度下保存。

2.如权利要求1所述方法制备的桥联环糊精/壳聚糖双功能手性整体柱的应用，其特征在于，所述整体柱应用于N-苄氧羰基-DL-天冬酰胺、DL-酪氨酸和DL-苯丙氨酸的手性分离。