CN114660018A - 一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器 - Google Patents
一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及光电化学传感领域，本发明公开了一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器。本发明首先进行丝素蛋白的提取和H‑TiO2的合成，并使磁珠上负载Ab2，然后通过逐层自组装工艺，制得基于RGO/H‑TiO2/MoS2得光电探测器。本发明在相互接触的石墨烯片之间均匀插入H‑TiO2纳米颗粒作为光电流，弹簧结构可促进光穿透弹簧内部和光生电子的转移，从而使探测器具有高度光敏和光电响应。同时，弹簧具有快速可恢复的形状记忆特性，在盐溶液中灵敏度和稳定性高；将光激发过程与电化学检测相结合可极大减少背景信号的干扰，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及光电化学传感领域，尤其涉及一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器。
背景技术
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中最负盛名的纺织品就是中国的丝绸，故中国又被称为“丝绸之国”。丝绸文物不仅具有科技、文化、艺术等多方面的价值，更是社会交替，人文交融的历史见证者。丝绸文物中丝绸的主要成分是桑蚕丝，桑蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶两部分组成，丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，约占总重量的70%。但是，丝绸文物中的桑蚕丝作为一种有机高分子材料，由于常年处于地下墓葬环境中易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，另一方面，丝绸文物出土时往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。而常规的丝素蛋白检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对丝绸文物进行检测，因此需要开发一种灵敏度好，特异性强的检测古代丝织品的方法存在着很重要的意义。
国内外报道的纺织品残留物的分析方法主要有化学降解法和生物质谱法等。然而，古代纺织品成分复杂，微小的成分变化就会导致质谱测定的较大误差，而且整个实验过程也必须经过残留物提取、酶切、质谱分析、结果分析等实验步骤，较为繁琐。因此，寻找一种灵敏度极高、特异性极强、快速高效的方法对纺织品残留物进行鉴定显得尤为重要。为了满足移动电子设备的需求，线状的光电探测器已经不断地被开发出来。柔性石墨烯基光纤电极在很大程度上取决于光敏材料的功能化。二氧化钛/石墨烯纤维被报道是非常有前途的，因为二氧化钛具有光稳定性、高光催化活性、无毒、低成本和高灵敏的光电响。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器。本发明首先进行丝素蛋白的提取和H-TiO2的合成，并使磁珠上负载Ab2，然后通过逐层自组装工艺，制得基于RGO/H-TiO2/MoS2得光电探测器。本发明在相互接触的石墨烯片之间均匀插入H-TiO2纳米颗粒作为光电流，弹簧结构可促进光穿透弹簧内部和光生电子的转移，从而使探测器具有高度光敏和光电响应。同时，弹簧具有快速可恢复的形状记忆特性，在盐溶液中灵敏度和稳定性高；将光激发过程与电化学检测相结合可极大减少背景信号的干扰，灵敏度高。
本发明的具体技术方案为：一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器，制备方法包括以下步骤：
步骤1：丝素蛋白的提取：将蚕茧先在Na2CO3水溶液中煮沸，再冲洗去除丝胶蛋白；将所得的丝素蛋白纤维在干燥后溶解于氯化钙混合溶液中；经透析、离心、冷冻干燥和研磨后，得到丝素蛋白。
步骤2：H-TiO2纳米颗粒的制备：将TiO2纳米颗粒在500-600℃的管式炉中用氢气和氩气的混合气体进行退火处理，得到H-TiO2纳米颗粒。
TiO2作为一种金属半导体光活性材料，光电性能受到了人们的广泛关注，例如高化学稳定及热稳定性、良好的生物相溶性、环境友好及原料充足等。尽管TiO2有上述这些优点，但是由于它具有很高的光生电子空穴对重组率，使其在光电化学中的应用受到了很大限制，必须对TiO2进行改性处理，氢化可以进一步增强二氧化钛纳米颗粒的光电化学性能，氢化不仅提高了长波长的光吸收，而且提高了二氧化钛的电导率。将H-TiO2纳米颗粒整合到石墨烯纤维中，可提高其光敏性、光催化能力和电导率。
步骤3：GO/H-TiO2均匀分散体的制备：在搅拌下，将步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到GO水溶液中，得到H-TiO2/GO均匀分散体。
步骤4：GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液的制备：将步骤3所得的 GO/H-TiO2均匀分散体与十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在水浴中加热搅拌；离心，加入钼酸钠粉，超声处理，获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
本发明GO表面带有丰富的羧基活性位点，可以进一步共价偶联生物分子，同时增加了溶液的分散性。石墨烯片靠弱的范德华力聚拢在一起，只有原子厚的石墨烯片拥有极大的表面积，被拉成纤维后，彼此依附排列，如同鱼身上的鳞片一样；如果将纤维打结，结头处的强度取决于纤维的弯曲系数，由于氧化石墨烯的弯曲系数非常低，好似结头根本不存在，因此强度很高。
步骤5：湿法纺丝结合水热法合成弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的注射器中，将纺丝液注入氯化钙乙醇水溶液凝固浴中，凝固后用水和乙醇依次洗涤，将获得的纤维和L-半胱氨酸加入至水中，转移到高压釜中进行水热反应；将所得纤维置于750-800℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火处理，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在管状炉中退火处理，获得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
L-半胱氨酸在高温下可生成谷胱甘肽，谷胱甘肽含有巯基等活性基团，可以与Na2MoO4作用，生成二硫化钼。
MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。尽管MoS2纳米材料具有相对较低的禁带宽度，但是其本身也如同TiO2一样具有很多不足。本发明将TiO2/GO与MoS2纳米材料结合起来形成异质结，使电子的扩散距离相对短，通过能带的匹配，光电转换效率高，光电流较稳定，可以有效的抑制光生电子空穴对的重组并且增强其光捕获能力。
本发明在相互接触的石墨烯片之间均匀插入H-TiO2纳米颗粒作为光电流，弹簧结构促进了光穿透弹簧内部和光生电子的转移，从而使探测器具有高度光敏和光电响应。同时，弹簧具有快速可恢复的形状记忆特性，在盐溶液中灵敏度和稳定性高。
步骤6：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取羧基磁珠于离心管中，用水洗涤，除去上清；接着用MES洗涤，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液进行反应，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用PBST、PBS清洗，后用BSA溶液封闭；加入含Tween 20和NaN3的PBS溶液震荡混匀，得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
本发明羧基磁珠为以聚苯乙烯微球为核心的MPS100 /羧基磁珠，其高分子聚合物表面带有丰富的羧基，可以与活性氨基共价偶联。抗体是一种具有游离活性氨基的蛋白质，可以与羧基结合形成稳定的酰基铵键。免疫磁珠还可以增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
步骤7：逐层自组装肖特基异质结免疫传感器：在室温下将多巴胺Tris-HCl 溶液滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上以聚集聚多巴胺；用PBS缓冲液洗净，滴加步骤1所得丝素蛋白CB溶液，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用BSA溶液将电极封闭，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加鼠抗丝素蛋白抗体Ab1溶液，用PBS缓冲液洗净未固定的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1，最后滴加步骤7所得免疫磁珠混合液，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
考虑到生物探针的结合位点通常有限，通过将纳米材料与具有大表面积的聚多巴胺膜材料相结合。仿生类材料聚多巴胺可以在不同类型的无机物和有机物表面上自发地形成均匀的超薄涂层，并且具有很高的生物相容性。聚多巴胺具有丰富的官能团，如聚多巴胺膜上的醌官能团可以通过迈克尔加成反应，与胺封端的抗体共价偶联，从而负载更多的生物复合物。当目标分子（主要为蛋白质分子）修饰到电极表面上时，会在电极表面产生空间位阻效应，从而阻碍电子的转移和传递，进而影响光电流的产生。
作为优选，步骤2中，所述氢气和氩气的体积比为1:0.8-1.2，退火时间为2-2.5h。
作为优选，步骤3具体包括：将5-8mg步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到10-12ml14-18mg ml−1的GO水溶液中，在30-37℃、400-800r min-1下搅拌30-40min，得到H-TiO2/GO均匀分散体。
作为优选，步骤4具体包括：将4-5ml步骤3所得的 GO/H-TiO2均匀分散体与50-55ml 0.04M 十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在35-40℃水浴中加热搅拌22-24h；离心，并在4-5ml水中分散后再离心，反复2-3次；加入0.38-042g钼酸钠粉，超声处理25-30min，获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
作为优选，步骤5具体包括：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的10ml塑料注射器中，将纺丝液注入4-6wt%的氯化钙乙醇水溶液凝固浴中，凝固后30-35min用水和乙醇依次洗涤3-5次，将获得的纤维和1-1.5g l-半胱氨酸加入至水中，转移到高压釜中在220-240℃下水热反应20-24h；将所得纤维置于750-800℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火处理3.5-4h，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在450-500℃的管状炉中退火处理1.5-2h，获得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
作为优选，步骤6具体包括：取1-1.2 mg羧基磁珠于离心管中，180-200 µl去离子水洗涤，除去上清；接着用150-250 µl 100 mM MES洗涤1-2次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，800-1000 rpm下反应1.5-2.5 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用400-600 µLPBST、PBS清洗20-40 min，去除上清液，后用BSA溶液封闭4-6 h；加入0.8-1.2 ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀，得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
作为优选，步骤7具体包括：在室温下将150-200µL 3 mg mL-1多巴胺Tris-HCl 溶液滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上0.5-1.5h以聚集聚多巴胺；用PBS缓冲液洗净，滴加10-20 ul 1ul/ml步骤1所得丝素蛋白CB溶液，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后， 用10-20 ul的0.8-1.2% BSA溶液在35-40℃下将电极封闭25-35 min；随后用0.8-1.2%的BSA溶液封闭0.5-1.5 h，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加10-20 ul 1ul/ml的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1溶液，置于25-35℃下50-70 min，用PBS缓冲液洗净未固定的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1，最后滴加10-20 ul步骤7所得免疫磁珠混合液，置于25-35℃中50-70 min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，即得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
（1）本发明对TiO2进行改性处理，氢化可以进一步增强二氧化钛纳米颗粒的光电化学性能，氢化不仅提高了长波长的光吸收，而且提高了二氧化钛的电导率。将H-TiO2纳米颗粒整合到石墨烯纤维中，可提高其光敏性、光催化能力和电导率。
（2）本发明GO表面带有丰富的羧基活性位点，可以进一步共价偶联生物分子，同时增加了溶液的分散性。石墨烯片靠弱的范德华力聚拢在一起，只有原子厚的石墨烯片拥有极大的表面积，被拉成纤维后，彼此依附排列，如同鱼身上的鳞片一样；如果将纤维打结，结头处的强度取决于纤维的弯曲系数，由于氧化石墨烯的弯曲系数非常低，好似结头根本不存在，因此强度较高。
（3）本发明MoS2是一种由弱范德华力共同作用的层状结构。该结构具有带隙窄、载流子迁移率高等优点。尽管MoS2纳米材料具有相对较低的禁带宽度，但是其本身也如同TiO2一样具有很多不足。将TiO2/GO与MoS2纳米材料结合起来形成异质结，使电子的扩散距离相对短，通过能带的匹配，光电转换效率高，光电流较稳定，可以有效的抑制光生电子空穴对的重组并且增强其光捕获能力。
（4）本发明在相互接触的石墨烯片之间均匀插入H-TiO2纳米颗粒作为光电流，弹簧结构促进了光穿透弹簧内部和光生电子的转移，从而使探测器具有高度光敏和光电响应。同时，弹簧具有快速可恢复的形状记忆特性，在盐溶液中灵敏度和稳定性高。
（5）本发明的羧基磁珠为以聚苯乙烯微球为核心的MPS100/羧基珠粒，其表面带有丰富的羧基，可以与活性氨基共价偶联。抗体是一种具有游离活性氨基的蛋白质，可以与羧基结合形成稳定的酰基铵键。免疫磁珠还可以增大空间位阻，来降低光电流信号的响应。
（6）考虑到生物探针的结合位点通常有限，通过将纳米材料与具有大表面积的聚多巴胺膜材料相结合。仿生类材料聚多巴胺可以在不同类型的无机物和有机物表面上自发地形成均匀的超薄涂层，并且具有很高的生物相容性。聚多巴胺具有丰富的官能团，如聚多巴胺膜上的醌官能团可以通过迈克尔加成反应，与胺封端的抗体共价偶联，从而负载更多的生物复合物。当目标分子（主要为蛋白质分子）修饰到电极表面上时，会在电极表面产生空间位阻效应，从而阻碍电子的转移和传递，进而影响光电流的产生。
附图说明
图1为实施例1所得光电探测器RGO/H-TiO2/MoS2的光电流响应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
步骤1：丝素蛋白的提取：将1 g家蚕茧在100 ml 0.5％ Na2CO3水溶液中煮沸30min，然后用蒸馏水冲洗3次，以完全去除丝胶蛋白；将脱胶的蚕丝纤维在50℃干燥箱中干燥24h；将干燥的丝素蛋白纤维在98℃的100 ml氯化钙混合溶液中（氯化钙，乙醇和蒸馏水的摩尔比为1:2:8）溶解1.5h；使用透析袋（截留分子量，MWCO：8000）对溶解后的混合溶液进行10次透析，每隔3h更换一次蒸馏水；使用离心机（6000 r/min）纯化获得的溶液；最后取上清液冷冻干燥，研磨，得到丝素蛋白。
步骤2：H-TiO2纳米颗粒的制备：将纯TiO2纳米颗粒在550℃的管式炉中用氢气和氩气混合物（体积比为1：1）退火2h，得到H-TiO2纳米颗粒备用。
步骤3：氧化石墨烯（GO）/H-TiO2均匀分散体的制备：在30℃下剧烈搅拌（600r min-1）30min，将5mg步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到10ml GO水溶液(16mg ml−1)中，最终得到TiO2/GO均匀分散体。
步骤4：GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液的制备：将4ml步骤3 GO/H-TiO2与50ml 0.04M十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在35℃的水浴中搅拌22h；离心，并在4ml去离子水中分散后再离心，反复2次；加入0.38g钼酸钠粉，超声处理25min；获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
步骤5：湿法纺丝结合水热法合成弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的10ml塑料注射器中，然后将纺丝液注入5wt%氯化钙乙醇水溶液（1：3v/v）的凝固浴中；凝固30min后，用水和乙醇依次洗涤3次，将制备的纤维和1gl-半胱氨酸加入60ml去离子水中，转移到100 ml特氟隆内衬高压釜中，然后在220℃下水热加热20h；所得到的纤维最终在750℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火3.5h，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在管状炉中以450℃退火1.5h，获得间距可控的弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
步骤6：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取1 mg羧基磁珠于离心管中，用180 µl去离子水洗一次，除去上清；接着用150 µl 100 mM MES洗1次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，800 rpm反应1.5 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用400-600 µLPBST、PBS清洗20-40 min，去除上清液，后用BSA溶液封闭4 h；加入0.8ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀即得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
步骤7：逐层自组装肖特基异质结免疫传感器：在室温下将 150 µL 多巴胺 (3 mgmL-1) tris-HCl 溶液 (2 M， pH 8.5) 滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上 1 h以聚集聚多巴胺 (PDA)；用PBS缓冲液洗净，滴加10 ul 1ul/ml的步骤1所得丝素蛋白溶液（CB，100 ng ml-1），用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10 ul的0.8% BSA溶液在35℃下将电极封闭25min；随后，用0.8%的BSA溶液封闭0.5 h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加10ul 1ul ml-1的鼠抗丝素蛋白抗体(Ab1)溶液，置于25℃下50 min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加10 ul步骤6所得免疫磁珠混合液，置于25℃中50 min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，即得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
步骤8：电化学测量：采用CHI660B电化学工作站对其电化学性能进行了表征，循环伏安法(CV)电压窗口为0-1V之间，扫描速率为10 mV/s；在20μA的不同电流下，EIS测量是在0.01Hz-100kHz的频率范围和开路电位下进行的，交流扰动为5 mV；光电流测试在环境温度下在PBS (pH 7.4，10 mM) 中进行，在光电流测试期间，溶解在 PBS 中的氧气(O2)充当电子受体；每10 s打开和关闭500W氙灯，光谱范围为300-2500 nm，光强为300mW/cm2；使用420nm截止滤光片作为模拟日光源，光源与电极之间的距离固定为10 cm；以开路电压作为外加电压的时间-电流测试。
图1为实施例1所得光电探测器RGO/H-TiO2/MoS2的光电流响应。
实施例2
步骤1：丝素蛋白的提取：将2 g家蚕茧在110ml 0.5％ Na2CO3水溶液中煮沸35min，然后用蒸馏水冲洗4次，以完全去除丝胶蛋白；将脱胶的蚕丝纤维在55℃干燥箱中干燥27 h；将干燥的丝素蛋白纤维在98℃的100 ml氯化钙混合溶液中（氯化钙，乙醇和蒸馏水的摩尔比为1:2:8）溶解1.5 h；使用透析袋（截留分子量，MWCO：8000）对溶解后的混合溶液进行13次透析，每隔3.5 h更换一次蒸馏水；使用离心机（7000 r/min）纯化获得的溶液；最后取上清液冷冻干燥，研磨，得到丝素蛋白。
步骤2：H-TiO2纳米颗粒的制备：将纯TiO2纳米颗粒在550℃的管式炉中用氢气和氩气混合物（体积比为1：1）退火2h，得到H-TiO2纳米颗粒备用。
步骤3：氧化石墨烯（GO）/H-TiO2均匀分散体的制备：在30℃下剧烈搅拌（600r min-1）30min，将5mg步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到11mlGO水溶液(16 mg ml−1)中，最终得到TiO2/GO均匀分散体。
步骤4：GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液的制备：将4ml步骤3 GO/H-TiO2与50ml 0.04M十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在35℃的水浴中搅拌23h；离心，并在4ml去离子水中分散后再离心，反复2次；加入0.40g钼酸钠粉，超声处理28min；获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
步骤5：湿法纺丝结合水热法合成弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的10ml塑料注射器中，然后将纺丝液注入5wt%氯化钙乙醇水溶液（1：3v/v）的凝固浴中；凝固33min后，用水和乙醇依次洗涤4次，将制备的纤维和1.2gl-半胱氨酸加入65ml去离子水中，转移到100 ml特氟隆内衬高压釜中，然后在230℃下水热加热23h；所得到的纤维最终在750℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火3.5h，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在管状炉中以450℃退火1.5h，获得间距可控的弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
步骤6：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取1.1 mg羧基磁珠于离心管中，用190µl去离子水洗一次，除去上清；接着用200µl 100mM MES洗2次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，900rpm反应2 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用400-600 µLPBST、PBS清洗20-40 min，去除上清液，后用BSA溶液封闭5 h；加入1 ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀即得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
步骤7：逐层自组装肖特基异质结免疫传感器：在室温下将175 µL多巴胺 (3 mgmL-1) tris-HCl 溶液 (2 M， pH 8.5) 滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上 1 h以聚集聚多巴胺 (PDA)；用PBS缓冲液洗净，滴加15ul 1ul/ml的步骤1所得丝素蛋白溶液（CB，100 ng ml-1），使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用15 ul的1% BSA溶液在35℃下将电极封闭30min；随后，用1%的BSA溶液封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加15ul1ul ml-1的鼠抗丝素蛋白抗体(Ab1)溶液，置于30℃下60 min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加15 ul步骤6所得免疫磁珠混合液，置于30℃中60 min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，即得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
步骤8：电化学测量：采用CHI660B电化学工作站对其电化学性能进行了表征，循环伏安法(CV)电压窗口为0-1V之间，扫描速率为500 mV/s；在50μA的不同电流下，EIS测量是在0.01Hz-100kHz的频率范围和开路电位下进行的，交流扰动为5 mV；光电流测试在环境温度下在 PBS (pH 7.4，10 mM) 中进行，在光电流测试期间，溶解在 PBS 中的氧气 (O2) 充当电子受体；每10 s打开和关闭 500 W氙灯，光谱范围为300-2500 nm，光强为 300 mW/cm2；使用420 nm 截止滤光片作为模拟日光源，光源与电极之间的距离固定为12 cm；以开路电压作为外加电压的时间-电流测试。
实施例3
步骤1：丝素蛋白的提取：将3 g家蚕茧在120 ml 0.5％ Na2CO3水溶液中煮沸40min，然后用蒸馏水冲洗5次，以完全去除丝胶蛋白；将脱胶的蚕丝纤维在60℃干燥箱中干燥30 h；将干燥的丝素蛋白纤维在98℃的100 ml氯化钙混合溶液中（氯化钙，乙醇和蒸馏水的摩尔比为1:2:8）溶解2 h；使用透析袋（截留分子量，MWCO：8000）对溶解后的混合溶液进行15次透析，每隔4 h更换一次蒸馏水；使用离心机（8000 r/min）纯化获得的溶液；最后取上清液冷冻干燥，研磨，得到丝素蛋白。
步骤2：H-TiO2纳米颗粒的制备：将纯TiO2纳米颗粒在550℃的管式炉中用氢气和氩气混合物（体积比为1：1）退火2.5h，得到H-TiO2纳米颗粒备用。
步骤3：氧化石墨烯（GO）/H-TiO2均匀分散体的制备：在37℃下剧烈搅拌（600r min-1）40min，将8mg步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到12ml GO水溶液(16mg ml−1)中，最终得到TiO2/GO均匀分散体。
步骤4：GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液的制备：将5ml步骤3 GO/H-TiO2与55ml 0.04M十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在40℃的水浴中搅拌24h；离心，并在5ml去离子水中分散后再离心，反复3次；加入042g钼酸钠粉，超声处理30min；获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
步骤5：湿法纺丝结合水热法合成弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的10ml塑料注射器中，然后将纺丝液注入5wt%氯化钙乙醇水溶液（1：3v/v）的凝固浴中；凝固35min后，用水和乙醇依次洗涤5次，将制备的纤维和1.5gl-半胱氨酸加入70ml去离子水中，转移到100ml特氟隆内衬高压釜中，然后在240℃下水热加热24h;所得到的纤维最终在800℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火4小时，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在管状炉中以500℃退火2h，获得间距可控的弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
步骤6：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取1.2 mg羧基磁珠于离心管中，用200 µl去离子水洗一次，除去上清；接着用250 µl 100 mM MES洗2次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，1000 rpm反应2.5 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用400-600 µLPBST、PBS清洗20-40 min，去除上清液，后用BSA溶液封闭6 h；加入1.2 ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀即得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
步骤7：逐层自组装肖特基异质结免疫传感器：在室温下将200 µL多巴胺 (3 mgmL-1) tris-HCl溶液 (2M，pH 8.5) 滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上1h以聚集聚多巴胺 (PDA)；用PBS缓冲液洗净，滴加20 ul 1ul/ml的步骤1所得丝素蛋白溶液（CB，100ng ml-1），使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用20ul的1.2% BSA溶液在40℃下将电极封闭35 min；随后，用1.2%的BSA溶液封闭1.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加20ul1ul ml-1的鼠抗丝素蛋白抗体(Ab1)溶液，置于35℃下70 min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加20ul步骤6所得免疫磁珠混合液，置于35℃中70min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，即得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
步骤8：电化学测量：采用CHI660B电化学工作站对其电化学性能进行了表征，循环伏安法(CV)电压窗口为0-1V之间，扫描速率为1000 mV/s；在80μA的不同电流下，EIS测量是在0.01Hz-100kHz的频率范围和开路电位下进行的，交流扰动为5mV；光电流测试在环境温度下在 PBS (pH 7.4，10 mM) 中进行，在光电流测试期间，溶解在PBS中的氧气(O2)充当电子受体；每10 s打开和关闭500W氙灯，光谱范围为300-2500 nm，光强为300 mW/cm2；使用420 nm截止滤光片作为模拟日光源，光源与电极之间的距离固定为15 cm；以开路电压作为外加电压的时间-电流测试。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种丝素蛋白检测用近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于制备方法包括以下步骤：
步骤1：丝素蛋白的提取：将蚕茧先在Na2CO3水溶液中煮沸，再冲洗去除丝胶蛋白；将所得的丝素蛋白纤维在干燥后溶解于氯化钙混合溶液中；经透析、离心、冷冻干燥和研磨后，得到丝素蛋白；
步骤2：H-TiO2纳米颗粒的制备：将TiO2纳米颗粒在500-600℃的管式炉中用氢气和氩气的混合气体进行退火处理，得到H-TiO2纳米颗粒；
步骤3：GO/H-TiO2均匀分散体的制备：在搅拌下，将步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到GO水溶液中，得到H-TiO2/GO均匀分散体；
步骤4：GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液的制备：将步骤3所得的 GO/H-TiO2均匀分散体与十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在水浴中加热搅拌；离心，加入钼酸钠粉，超声处理，获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液；
步骤5：湿法纺丝结合水热法合成弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的注射器中，将纺丝液注入氯化钙乙醇水溶液凝固浴中，凝固后用水和乙醇依次洗涤，将获得的纤维和l-半胱氨酸加入至水中进行水热反应；将所得纤维置于750-800℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火处理，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在管状炉中退火处理，获得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维；
步骤6：免疫磁珠与Ab2的核-壳结构制备：取羧基磁珠于离心管中，用水洗涤，除去上清；接着用MES洗涤，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液进行反应，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用PBST、PBS清洗，后用BSA溶液封闭；加入含Tween 20和NaN3的PBS溶液震荡混匀，得到免疫磁珠混合液，冷藏备用；
步骤7：逐层自组装肖特基异质结免疫传感器：在室温下将多巴胺Tris-HCl 溶液滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上以聚集聚多巴胺；用PBS缓冲液洗净，滴加步骤1所得丝素蛋白CB溶液，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用BSA溶液将电极封闭，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加鼠抗丝素蛋白抗体Ab1溶液，用PBS缓冲液洗净未固定的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1，最后滴加步骤7所得免疫磁珠混合液，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
2.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤2中，所述氢气和氩气的体积比为1:0.8-1.2，退火时间为2-2.5h。
3.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤3具体包括：将5-8mg步骤2制备的H-TiO2纳米颗粒加入到10-12ml 14-18mg ml−1的GO水溶液中，在30-37℃、400-800r min-1下搅拌30-40min，得到H-TiO2/GO均匀分散体。
4.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤4具体包括：将4-5ml步骤3所得的 GO/H-TiO2均匀分散体与50-55ml 0.04M 十二烷基二甲基苄基氯化铵溶液混合，在35-40℃水浴中加热搅拌22-24h；离心，并在4-5ml水中分散后再离心，反复2-3次；加入0.38-042g钼酸钠粉，超声处理25-30min，获得GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液。
5.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤5具体包括：将GO/H-TiO2/Na2MoO4纺丝液装入带有旋转喷嘴的10ml塑料注射器中，将纺丝液注入4-6wt%的氯化钙乙醇水溶液凝固浴中，凝固30-35min后用水和乙醇依次洗涤3-5次，将获得的纤维和1-1.5g l-半胱氨酸加入至水中，转移到高压釜中在220-240℃下水热反应20-24h；将所得纤维置于750-800℃的可控气氛炉中，在Ar流动中退火处理3.5-4h，得到RGO/H-TiO2/MoS2纤维；将RGO/H-TiO2/MoS2纤维包裹在玻璃棒上，然后在450-500℃的管状炉中退火处理1.5-2h，获得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维。
6.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤6具体包括：取1-1.2 mg羧基磁珠于离心管中，180-200 µl去离子水洗涤，除去上清；接着用150-250 µl100 mM MES洗涤1-2次，除去上清；加入MES重悬，加入稀释的兔抗鼠抗丝素蛋白抗体Ab2，震荡反应；加入EDC溶液，800-1000 rpm下反应1.5-2.5 h，去除上清，得到负载Ab2的免疫磁珠；先后用400-600 µLPBST、PBS清洗20-40 min，去除上清，后用BSA溶液封闭4-6 h；加入0.8-1.2 ml含0.01% Tween 20和0.02% NaN3的PBS溶液震荡混匀，得到免疫磁珠混合液，冷藏备用。
7.如权利要求1所述的近红外光响应弹簧状光电探测器，其特征在于：步骤7具体包括：在室温下将150-200µL 3 mg mL-1多巴胺Tris-HCl 溶液滴到步骤5所得弹簧状RGO/H-TiO2/MoS2纤维上0.5-1.5h以聚集聚多巴胺；用PBS缓冲液洗净，滴加10-20 ul 1ul/ml步骤1所得丝素蛋白CB溶液，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后， 用10-20 ul的0.8-1.2%BSA溶液在35-40℃下将电极封闭25-35 min；随后用0.8-1.2%的BSA溶液封闭0.5-1.5 h，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加10-20 ul1ul/ml的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1溶液，置于25-35℃下50-70 min，用PBS缓冲液洗净未固定的鼠抗丝素蛋白抗体Ab1，最后滴加10-20 ul步骤7所得免疫磁珠混合液，置于25-35℃中50-70 min，用PBS缓冲液洗净未固定的免疫磁珠，即得到近红外光响应弹簧状光电探测器。
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| CN112834591A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-05-25 | 浙江理工大学 | 基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法 |
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