CN115728368A - 一种基于MXene复合材料构建的光电化学生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于MXene复合材料构建的光电化学生物传感器及其在检测5‑羟甲基胞嘧啶中的应用。首次提出以构建肖特基结Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料为基底材料，二维材料Ti3C2属于类金属，零维材料Ti3C2QDs属于n型半导体，两种材料复合时，金属与半导体的交界面形成肖特基结。Ti3C2属于二维纳米材料且表面呈负电性，而Ti3C2QDs属于零维纳米材料带有正电性，两种材料在静电吸附的作用下，紧密接触形成肖特基结，有效地促进光生电子空穴对的分离，从而获得优异的光电化学性能。本发明提出的光电化学生物传感器具有良好的灵敏，在1fM‑1nM范围内具有良好的线性。
Description
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种基于MXene复合材料构建的光电化学生物传感器及其在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用。
背景技术
5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是一种重要的表观遗传修饰，被认为是DNA的第六碱基。它是由5-甲基胞嘧啶(5mC)通过十—十一易位(TET)蛋白的催化氧化作用形成的。5hmC在不同类型的细胞和组织中的分布存在显著差异，其中在人、小鼠大脑及胚胎干细胞中表达丰富，因此引起了人们的广泛关注。此外，5hmC水平在结肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌和脑癌等多种癌症中均显著降低，这表明5hmC在癌症发展中发挥重要作用。因此，开发准确、高效、灵敏的5hmC检测方法已成为当务之急。
目前用来检测5hmC的方法主要包括，液相色谱质谱联用法、荧光法、单碱基分辨率测序法和单分子技术。然而上述方法都需要用到昂贵的仪器和繁琐的操作步骤，因此开发简单、快捷、低成本、高灵敏性的检测方法是必要的。
近些年来，光电化学(PEC)生物传感器在生物分析领域中快速发展成为一种重要的分析技术。利用不同的生物识别元件，人们已经设计出了多种PEC生物传感器来检测相应的目标分析物。由于激发源和检测信号的分离，与传统的电化学和光学方法相比，PEC分析具有高灵敏度和低背景信号的优点。同时，在利用电子读数技术的基础上，该技术具有成本低、操作简单、易于小型化等优点，因此，被广泛地应用在生物分析方面，尤其是在DNA检测中。MXene是一种新型的二维层状过渡金属碳/氮化物。其具有许多优良的性质，包括导电性、机械性能、巨大的比表面积，特别是与其他纳米材料之间有良好的相容性等。因此，利用MXene与其他半导体制备复合材料实现信号放大，对PEC传感器的灵敏度的提升具有十分重要的意义。但目前尚未有基于MXene复合材料的光电化学分析方法检测5hmC的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于MXene复合材料构建光电化学生物传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法，实现了对5hmC的快速、简单和灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了利用Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料制备的光电化学生物传感器，所述光电化学生物传感器包括：玻碳电极，依次固定在所述玻碳电极表面的上述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料与金纳米粒子；所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料按如下方法制备：将Ti3C2纳米片和Ti3C2 QDs混于水中，充分分散，所得Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液经后处理，得所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料；所述Ti3C2纳米片与所述Ti3C2 QDs的质量比为1-5：10(优选3：10)。
进一步，所述光电化学生物传感器由玻碳电极，依次固定在所述玻碳电极表面的上述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料与金纳米粒子组成。
本发明中，先在玻碳电极表面形成Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料薄膜，再在Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料薄膜表面修饰金纳米粒子，得到所述光电化学生物传感器。
所述金纳米粒子按如下方法制备：将100mL质量分数为0.01％的HAuCl4水溶液煮沸后，在剧烈搅拌下将2mL质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液快速注入溶液中继续搅拌15min；停止加热，继续搅拌30分钟冷却，所得反应液变成酒红色，高速离心，所得沉淀物即为所述金纳米粒子；所述HAuCl4水溶液与所述柠檬酸三钠水溶液的体积比为50：1。
本发明的第二方面，提供上述光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：玻碳电极经预处理后，滴加所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液，在空气中自然干燥成膜后，滴加浓度为0.5-3mg/mL(优选1mg/mL)的金纳米粒子的水溶液，室温下孵育0.5-2h(优选1h)后，用超纯水润洗电极，自然干燥，得到所述光电化学生物传感器；
所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液中，Ti3C2的浓度为1-5mg/mL(优选3mg/mL)。
进一步，所述预处理为：所述玻碳电极用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光其表面，并依次在乙醇和超纯水中超声处理30s，重复所述超声处理步骤2次，即完成预处理。
进一步，所述金纳米粒子的水溶液按如下方法制备：
将质量分数为0.01％的HAuCl4水溶液煮沸后，在剧烈搅拌下将质量分数为1％的柠檬酸三钠水溶液快速注入溶液中继续搅拌15min；停止加热，继续搅拌30分钟冷却，所得反应液变成酒红色，高速离心，所得沉淀物加入超纯水，均匀分散，即得到所述金纳米颗粒的水溶液；所述HAuCl4水溶液与所述柠檬酸三钠水溶液的体积比为50：1。
本发明的第三方面，提供一种上述光电化学生物传感器在检测单链DNA中5-羟甲基胞嘧啶中的应用。
具体地，所述应用为：
(1)将末端有-SH的单链DNA水溶液滴加到所述光电化学生物传感器表面，37℃潮湿条件下孵育1-3h(优选2h)，超纯水润洗电极，自然干燥，得到ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2QDs/GCE；
(2)以步骤(1)所述ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为对电极，铂丝电极为参比电极，以0.1M，pH6-9(优选pH＝7.4)磷酸盐缓冲液(优选0.1MKH2PO4,0.1M Na2HPO4·12H2O，0.1M KCl)为电解质溶液，以0V电压为工作电压，300W氙灯为可见光光源，在CHI760 E电化学工作站上进行光电流信号采集，建立电流与5hmC浓度之间的线性关系，从而检测5-羟甲基胞嘧啶的含量。
通过Au-S键的相互作用将末端有-SH的DNA链固定于电极表面，在5hmC存在的条件下，其氧化反应消耗复合材料所产生的光生空穴，导致光电流强度增大，以此定量检测5hmC。
本发明中，光电流强度随含有5hmC的单链DNA溶液浓度的增加而增大，且5hmC浓度在1fM-1nM范围内，具有良好的线性。
需要说明的是，上述方法可以用于非疾病诊断方面，在医学上具有广阔的应用前景。
基于肖特基结的Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的制备，以及通过光电化学传感器实现对单链DNA中5hmC浓度的灵敏检测。
本发明的第四方面，提供制备上述光电化学生物传感器的原料Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料，按如下方法制备：将Ti3C2纳米片和Ti3C2 QDs混于水中，充分分散，所得Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料的水分散液经后处理，得所述Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料；所述Ti3C2纳米片与所述Ti3C2 QDs的质量比为1-5：10(优选3：10)。
进一步，所述Ti3C2纳米片按如下方法制备：将LiF在室温下搅拌溶解于9M盐酸中，获得LiF/HCl溶液；在5min内将Ti3AlC2(MAX相，购自莱州凯烯陶瓷材料有限公司，CAS:196506-01-1)缓慢加入所述LiF/HCl溶液中，并在35℃下搅拌24h；所得产物用超纯水离心洗涤至上清液的pH值达到6，所得沉淀物添加至超纯水中以获得10mg mL-1Ti3C2悬浮液；将所述Ti3C2悬浮液在氮气气氛下超声处理30min，(在7500rpm下)离心(20min)，收集Ti3C2纳米片的上清液，冷冻干燥，即得所述Ti3C2纳米片；
所述盐酸的体积以所述LiF的质量计为20mL/g；所述Ti3AlC2与所述LiF的质量比为1：1。
进一步优选地，所述Ti3C2 QDs以Ti3C2 QDs的水分散液形式加入，即直接将所述Ti3C2纳米片分散于Ti3C2 QDs的水分散液中。优选所述Ti3C2 QDs的水分散液的浓度为1％。
所述于Ti3C2 QDs的水分散液以Ti3C2为前驱体，加入聚乙烯亚胺溶液，经水热反应，最后通过真空抽滤得到。
具体地，所述Ti3C2 QDs的水分散液按如下方法制备：在5min内将Ti3AlC2(MAX相，购自莱州凯烯陶瓷材料有限公司，CAS:196506-01-1)缓慢加入所述LiF/HCl溶液中，并在35℃下搅拌24h；所得产物用超纯水离心洗涤至上清液的pH值达到6，所得沉淀物添加至超纯水中以获得10mg mL-1Ti3C2悬浮液；将所述Ti3C2悬浮液在氮气气氛下超声处理30min，(在7500rpm下)离心(20min)，所得上清液均匀分散在超纯水中，得到分散液；加入聚乙烯亚胺并搅拌1h，氮气气氛120℃下加热36h，所得含有Ti3C2 QDs的淡黄色悬浮液用220nm膜过滤，所得滤液即为所述Ti3C2 QDs的水分散液；
所述上清液与超纯水的体积比为1：2；所述聚乙烯亚胺与所述分散液的质量体积比为0.06g：10mL。
进一步所述聚乙烯亚胺以聚乙烯亚胺的水溶液形式加入，所述聚乙烯亚胺的水溶液中，聚乙烯亚胺的质量分数为30％。
优选地，所述分散采用如下操作完成：在室温下于300-500rpm的转速下搅拌20-30min，在150W-300W的超声功率下超声5-10min。
进一步，所述后处理为：将所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水溶液离心，所得沉淀冷冻干燥，即得所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次提出以构建肖特基结Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料为基底材料，二维材料Ti3C2属于类金属，零维材料Ti3C2 QDs属于n型半导体，两种材料复合时，金属与半导体的交界面形成肖特基结。Ti3C2属于二维纳米材料且表面呈负电性，而Ti3C2 QDs属于零维纳米材料带有正电性，两种材料在静电吸附的作用下，紧密接触形成肖特基结，有效地促进光生电子空穴对的分离，从而获得优异的光电化学性能。相对于复合材料如CuPi/Ti3C2 QDs具备更好的光电性能，CuPi属于p型半导体，n型半导体和p型半导体交界面形成p-n异质结。但Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的光电流是CuPi/Ti3C2 QDs的三倍。
(2)本发明提出的光电化学生物传感器具有良好的灵敏，在1fM-1nM范围内具有良好的线性。
(3)本发明的检测方法简单，且易于操作，仅对GCE电极表面进行简单处理，即可实现对5hmC的检测。
附图说明
图1是光电化学生物传感器的构建过程。
图2是不同浓度的5hmC的光电化学响应曲线，曲线a-h代表的浓度分别是0.001，0.01，0.1，1，10，100，1000pM的5hmC。
图3是光电流对数值与5hmC浓度的线性拟合曲线。
图4是利用光电化学生物传感器分别检测含5hmC-ssDNA和不含5hmC-ssDNA的光电流响应曲线。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
5hmC-DNA序列号：5′-(S-S)GGTACCATCGATACT(5hmC)AGATAGACTACACTCCAGAAGCTT-3′，厂家：宝生物工程(大连)有限公司。
将10μL的Ti3C2/Ti3C2 QDs悬浮液滴到GCE上并在室温下干燥，将改性的光电极定义为Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE。
将10μL金纳米颗粒(1mg/mL)的水溶液滴于Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE上室温下孵育0.5-2h，将光电极定义为Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE。
将10μL包含5hmC的DNA溶液滴加到Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE上，在37℃潮湿条件下孵育1-3h，将光电极定义为5hmC/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2QDs/GCE。
实施例1：Ti3C2的合成
将LiF(0.5g)在室温下搅拌溶解于盐酸(9M，10mL)中，以获得LiF/HCl溶液。然后，在5min内将Ti3AlC2(MAX相，0.5g，购自莱州凯烯陶瓷材料有限公司，CAS:196506-01-1)缓慢加入上述LiF/HCl溶液中，并在35℃下搅拌24h。随后，将产物用超纯水在离心(3500rpm，5min)下洗涤，直到上清液的pH值达到6，然后取出沉淀物并将其添加至超纯水中以获得Ti3C2悬浮液(10mg mL-1，30mL)。将Ti3C2Tx悬浮液在氮气气氛下超声处理30min。最后，在7500rpm下离心20min收集Ti3C2纳米片的上清液。
实施例2：Ti3C2 QDs的合成
将5mL按实施例1中方法制备的Ti3C2纳米片的上清液重新分散在10mL超纯水中，然后添加0.2mL的PEI(聚乙烯亚胺)的水溶液(质量分数为30％)并搅拌1h。将混合物在氮气气氛120℃下加热36h。将所得含有TQD的淡黄色悬浮液用220nm膜过滤，所得滤液保存在4℃冰箱中，经荧光量子产率测试，其量子产率为1％。
实施例3：Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的制备
Ti3C2表面Zeta电位值为负，而Ti3C2 QDs经PEI溶液改性后表面Zeta电位值为正，通过静电吸附的方式制备Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料。
将Ti3C2纳米片的上清液放入冷冻干燥机中，冻干并抽真空，使其水溶液升华，获得固体海绵状Ti3C2。
分别将10mg,20mg,30mg,40mg,50mg的Ti3C2加入到10ml Ti3C2 QDs溶液(质量分数1％)中，在室温下于500rpm的转速下搅拌30min，在150W的超声功率下超声10min，得到1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL,5mg/mL Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的悬浮液。
实施例4：不同浓度Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的悬浮液的光电化学性能测试
将实施例3制备的1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL,5mg/mL Ti3C2/Ti3C2QDs复合材料的悬浮液，分别取10μL滴于GCE(天津艾达恒晟科技发展有限公司，直型GC140内芯直径5mm四氟长60mm)表面，在空气中自然干燥成膜后测试光电流响应(测试条件为：工作电压0V，300W氙灯光源)，3mg/mL Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的悬浮液的光电流值最高，因此选用3mg/mL Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的悬浮液作为接下来实验的条件。
实施例5：金纳米颗粒的制备
将100mL HAuCl4水溶液(质量分数0.01％)煮沸后，在剧烈搅拌下将2mL柠檬酸三钠水溶液(质量分数1％)快速注入溶液中继续搅拌15min；接下来，停止加热，继续搅拌30分钟冷却，溶液变成酒红色，然后高速离心取得沉淀物，加入10mL超纯水，得到1mg/mL的金纳米颗粒的水溶液。
实施例6：GCE电极预处理
用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光GCE(天津艾达恒晟科技发展有限公司，直型GC140内芯直径5mm四氟长60mm)表面，多次抛光后，用超纯水和乙醇交替3次超声处理30s。
实施例7：含有巯基修饰5hmC-ssDNA的制备
将10μL的150μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液(溶剂为超纯水)加入待还原的巯基修饰5μL的3μM 5hmC-DNA(溶剂为超纯水)中，振荡使之溶解。室温放置1小时，间歇性振荡3-5次，得到15μL的1μM巯基修饰5hmC-ssDNA，然后用超纯水将其分别稀释为1nM，100pM，10pM，1pM，100fM，10fM，1fM巯基修饰5hmC-ssDNA。
实施例8：电极构建过程
将10μL的Ti3C2/Ti3C2 QDs悬浮液(3mg/mL)滴到GCE上并在室温下干燥成膜，将10μL金纳米颗粒(1mg/mL)的水溶液滴于电极表面，室温下孵育1h后，用超纯水润洗电极，自然干燥后，将10μL包含不同浓度5hmC-ssDNA溶液滴加到电极表面，在37℃潮湿条件下孵育2h，然后用超纯水润洗电极，自然干燥。如图1所示。
实施例9：光电化学检测
以5hmC-ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE,铂丝电极，Ag/AgCl电极，分别为工作电极，对电极，参比电极。电解质溶液为0.1M(pH＝7.4)磷酸盐缓冲液(0.1M KH2PO4,0.1MNa2HPO4·12H2O，0.1M KCl)，以0V电压为工作电压，300W氙灯为可见光光源，在CHI760 E电化学工作站上进行光电流信号采集。建立光电流I(nA)与5hmC浓度c(pM)之间的关系，线性范围为0.001-1000pM，校正曲线为I(nA)＝451.663log c(pM)+49.735(R2＝0.9936)，检测限为0.36fM。如图2和图3所示。
实施例10：对比实验
以ssDNA(1nM，ssDNA未修饰5hmC,序列号：5′-HS-(CH2)6-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′)/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE,铂丝电极，Ag/AgCl电极，分别为工作电极，对电极，参比电极。电解质溶液为0.1M(pH＝7.4)磷酸盐缓冲液(0.1M KH2PO4,0.1M Na2HPO4·12H2O，0.1MKCl)，以0V电压为工作电压，300W氙灯为可见光光源，在CHI760 E电化学工作站上进行光电流信号采集。其光电流相比于Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE的光电流下降，而5hmC-ssDNA(1nM)/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE相比于Au NPs/Ti3C2/Ti3C2QDs/GCE的光电流值上升。可见存在5hmC时，其充当电子供体可以进一步增强光电流，进一步说明本发明的传感器可以灵敏识别含5hmC的DNA。
实施例11：稳定性实验
经过14次i-t曲线测试(基于开关照射周期)后，光电流强度仍保持在初始强度的95％以上，这表明我们构建的PEC传感器具有良好的稳定性。采用相同的方法制备5根5hmC-ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE电极，然后在0.1M(pH＝7.4)磷酸盐缓冲液(0.1MKH2PO4,0.1M Na2HPO4·12H2O，0.1M KCl)中进行光电流信号检测，得到电流的相对标准偏差为2.23％，说明该方法具有很好的重现性。将5hmC-ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE传感器在4℃下存放2周，再进行光电流检测，得到电流响应为原始电流响应的95.68％，说明该方法具有良好的储藏性。
以上详细描述了本发明的较佳实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的实验与技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种光电化学生物传感器,其特征在于：所述的光电化学生物传感器包括：玻碳电极，依次固定在所述玻碳电极表面的所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料与金纳米粒子；
所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料按如下方法制备：将Ti3C2纳米片和Ti3C2 QDs混于水中，充分分散，所得Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液经后处理，得所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料；所述Ti3C2纳米片与所述Ti3C2 QDs的质量比为1-5：10。
2.如权利要求1所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：玻碳电极经预处理后，滴加所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液，在空气中自然干燥成膜后，滴加浓度为0.5-3mg/mL的金纳米粒子的水溶液，室温下孵育0.5-2h后，用超纯水润洗电极，自然干燥，得到所述光电化学生物传感器；
所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液中，Ti3C2的浓度为1-5mg/mL。
3.如权利要求2所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述预处理为：所述玻碳电极用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料抛光其表面，并依次在乙醇和超纯水中超声处理30s，重复所述超声处理步骤2次，即完成预处理。
4.如权利要求1所述的光电化学生物传感器在检测单链DNA中5-羟甲基胞嘧啶中的应用。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为：
(1)将末端有-SH的单链DNA水溶液滴加到所述光电化学生物传感器表面，37℃潮湿条件下孵育1-3h，超纯水润洗电极，自然干燥，得到ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE；
(2)以步骤(1)所述ssDNA/Au NPs/Ti3C2/Ti3C2 QDs/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为对电极，铂丝电极为参比电极，以0.1M，pH6-9磷酸盐缓冲液为电解质溶液，以0V电压为工作电压，300W氙灯为可见光光源，在CHI760 E电化学工作站上进行光电流信号采集，建立电流与5hmC浓度之间的线性关系，从而检测5-羟甲基胞嘧啶的含量。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)中所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
7.一种Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料，其特征在于按如下方法制备：将Ti3C2纳米片和Ti3C2QDs混于水中，充分分散，所得Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水分散液经后处理，得所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料；所述Ti3C2纳米片与所述Ti3C2QDs的质量比为1-5：10。
8.如权利要求7所述的Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料，其特征在于：所述Ti3C2纳米片与所述Ti3C2 QDs的质量比为3：10。
9.如权利要求7所述的Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料，其特征在于：所述分散采用如下操作完成：在室温下于300-500rpm的转速下搅拌20-30min，在150W-300W的超声功率下超声5-10min。
10.如权利要求7所述的Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料，其特征在于：所述后处理为：将所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料的水溶液离心，所得沉淀冷冻干燥，即得所述Ti3C2/Ti3C2 QDs复合材料。
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