CN112834591A - 基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents

基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及光电化学传感领域，本发明公开了一种基于CdSeQDs‑TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法：首先提取丝素蛋白的提取和合成，并使Au‑MOFs负载Ab2，然后逐层自组装制备间接型传感器。可与TiO2构成异质结，通过能带匹配来增大光电流信号的响应；将纳米金属与MOFs相结合可克服单一纳米材料自身性质的局限性；Au由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性；Au‑MOFs与CdSeQDs‑TiO2@Au之间竞争吸收光激子，会导致能量转移而导致半导体材料光电流的猝灭。将光激发过程与电化学检测相结合可极大减少背景信号的干扰，灵敏度高。

Description

基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器 的制备方法
技术领域
本发明涉光电化学传感领域，尤其涉及一种基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法。
背景技术
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中最负盛名的纺织品就是中国的丝绸，故中国又被称为“丝绸之国”。丝绸文物不仅具有科技、文化、艺术等多方面的价值，更是社会交替，人文交融的历史见证者。丝绸文物中丝绸的主要成分是桑蚕丝，桑蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶两部分组成，丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，约占总重量的70%。但是，丝绸文物中的桑蚕丝作为一种有机高分子材料，由于常年处于地下墓葬环境中易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，另一方面，丝绸文物出土时往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。而常规的丝素蛋白检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对丝绸文物进行检测，因此需要开发一种灵敏度好，特异性强的检测古代丝织品的方法存在着很重要的意义。
国内外报道的纺织品残留物的分析方法主要有化学降解法和生物质谱法等。然而，古代纺织品成分复杂，微小的成分变化就会导致质谱测定的较大误差，而且整个实验过程也必须经过残留物提取、酶切、质谱分析、结果分析等实验步骤，较为繁琐。因此，寻找一种灵敏度极高、特异性极强、快速高效的方法对纺织品残留物进行鉴定显得尤为重要。将光激发过程与电化学检测相结合使得PEC传感器极大地减少了背景信号的干扰。此外，因其设备简单、成本低廉、灵敏度高的优点而引起了人们的广泛关注。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法，本发明首先进行丝素蛋白的提取和CdSeQDs的合成，并使Au-MOFs上负载Ab2，然后通过逐层自组装工艺，制备间接型CdSeQDs-TiO2@Au/ITO传感器，最后用自组装PEC系统测试传感器性能。
本发明的具体技术方案为：
一种基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：以µg、mg、g和µl、ml计，包括以下步骤：
步骤1：丝素蛋白的提取：量取360-440ml含0.018-0.022M的碳酸钠溶液，向溶液中添加9-11g桑蚕丝，75-85℃水浴加热55-65min，取出，用去离子水清洗，干燥后得到丝素，取4.6-5.4g硝酸钙，3.6-4.4g丝素，加入甲酸96-104ml，搅拌80-90min过滤，加入碳酸氢钠至溶液呈中性后，透析冷冻干燥，研磨，得到将丝素蛋白。
步骤2：CdSeQDs的合成：取0.80-0.88ml的巯基乙酸和55-65ml的去离子水混合均匀，然后加入45-55ml0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1MNaOH溶液调节溶液pH为9.5-10.5，然后通入惰性气体除去溶液中的氧气，接着加入11-13ml0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将所得反应前驱液在惰性气体保护下75-85℃下反应3-5h，最后将所得的亮黄色溶液冷却至室温，离心清洗后保存备用。
本发明CdSeQDs作为一种窄禁带（宽度为1.7eV）半导体，与较宽禁带的TiO2(宽度为3.2eV，只能吸收部分紫外光)构成了异质结，通过能带的匹配，来增大光电流信号的响应。
步骤3：Au-MOFs@Ab2的制备：称取1.4-2.8mmol 2，5-二氨基对苯二甲酸溶解于25-35ml的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌1-2h后，所得产物依次用无水乙醇和N，N-二甲基甲酰胺清洗，真空干燥，得到MOFs材料；然后在70-80℃搅拌下，将MOFs材料和氯金酸溶液混合，超声分散，干燥后焙烧，得到粉末状的Au-MOFs，最后向18-22ml0.01g/ml的BSA溶液中加入Au-MOFs和8-12ulAb2，置于25-35℃保温箱孵育0.5-1.5h，得到Au-MOFs@Ab2。
本发明考虑到生物探针的结合位点通常有限，金属纳米材料与生物探针直接结合产生光电流信号变化不大。MOFs作为一种高效负载材料，通过将金属纳米材料与具有大表面积的MOFs功能材料相结合，可以克服单一纳米材料自身性质的局限。Ab2可以通过Au-S键被固定在Au-MOFs上面。
步骤4：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.4-0.5cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗，干燥。
步骤5：逐层自组装制备免疫传感器：将AuNPs通过电沉积法修饰于ITO导电玻璃电极表面，即将裸露的ITO导电玻璃电极浸泡在0.05-0.06wt%HAuCl4溶液中，沉积电压为0.8-1.0V，时间为120-150s。
步骤6：溶胶-凝胶法制备CdSeQDs-TiO2@Au电极材料：将5ml Ti(i-OC3H7)4、40-45ml乙醇和40-45ml乙二醇混合，将所得混合液在室温下搅拌25-35min，然后加入3-7ml步骤2所得溶液，得到TiO2-CdSeQDs凝胶；之后将步骤5所得电极置于TiO2-CdSeQDs凝胶中5-20min使电极表面形成一层均匀的凝胶膜，然后于管式炉中退火煅烧，得到CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极。
本发明半导体纳米晶体与金属纳米粒子之间的荧光共振可以使能量转移，Au由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性。因为在较短的工作距离内，半导体材料的发射可以激发金属纳米材料中的表面等离子体共振。
步骤7：活化CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极：采用滴涂法在干燥后的步骤6所得电极表面滴加10-15ul0.05M的MPA水溶液，于50-60℃中孵育50-70min形成饱和MPA单层，用PBS缓冲液洗净，将所得修饰有MPA的电极浸泡在MES缓冲液中，并于55-65℃中孵育50-70min，将MPA的末端羧基转化为活性NHS酯，用PBS缓冲液洗净，得到活化的CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极。
MPA的巯基可以和AuNPs形成Au-S键而被固定。
步骤8：构建间接型免疫传感器：滴加5-10ul1ul/ml的步骤1所得丝素蛋白的CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10-15ul的0.8-1.2%BSA在35-40℃下将电极封闭25-35min；随后，用0.8-1.2%的BSA封闭0.5-1.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加3-7ul1ul/ml的兔抗丝素蛋白抗体溶液，即Ab1抗体溶液，置于25-35℃下50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加8-12ul步骤3所得Au-MOFs@Ab2，置于25-35℃中50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Au-MOFs@Ab2，即得到丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器。
本发明PEC免疫分析中，空间位阻效应是一种重要的信号放大策略，因为大多数生物分子如蛋白质分子的导电性较差，所以，当目标分子（主要为蛋白质分子）修饰到电极表面上时，会在电极表面产生空间位阻效应，从而阻碍电子的转移和传递，进而影响光电流的产生。而且Au-MOFs与CdSeQDs-TiO2@Au之间竞争吸收光激子，会导致能量转移（EET）而导致半导体材料光电流的猝灭。构建间接型免疫传感器，不同于常规的夹心型光电化学免疫传感器。
作为优选，步骤1中，所得溶液用截留分子量为8000-10000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔4-5h换一次水，将所得丝素蛋白溶液真空冷冻干燥2-3天。
作为优选，步骤2中，所述惰性气体为高纯氮气，且边搅拌边通入高纯氮气30-50min。
作为优选，步骤3中，焙烧为：管式炉中以4-6℃/min的速度升温至490-510℃，焙烧2-3h。
作为优选，步骤3中，所述Ab2为羊抗兔多克隆抗体。
作为优选，步骤4中，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10-20min，干燥温度为50-60℃。
作为优选，步骤6中，退火煅烧为：于管式炉N2气氛下370-400℃退火煅烧50-70min。
作为优选，步骤7中，所述MES缓冲液中含有0.05M的EDC和0.03M的NHS。
作为优选，步骤7和8中，所述PBS缓冲液的pH=7.4。
作为优选，步骤8中，所述CB液的pH=9.6。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
（1）本发明作为一种窄禁带半导体，与较宽禁带的TiO2构成了异质结，通过能带的匹配，来增大光电流信号的响应。
（2）本发明考虑到生物探针的结合位点通常有限，金属纳米材料与生物探针直接结合产生光电流信号变化不大。MOFs作为一种高效负载材料，通过将金属纳米材料与具有大表面积的MOFs功能材料相结合，可以克服单一纳米材料自身性质的局限性。Ab2可以通过Au-S键被固定在Au-MOFs上面。
（3）本发明半导体纳米晶体与金属纳米粒子之间的荧光共振可以使能量转移，Au由于局域表面等离子体共振效应来增强光催化活性。
（4）本发明PEC免疫分析中，除了空间位阻效应是一种重要的信号放大策略，而且Au-MOFs与CdSeQDs-TiO2@Au之间竞争吸收光激子，会导致能量转移（EET）而导致半导体材料光电流的猝灭。
（5）本发明构建间接型免疫传感器，不同于常规的夹心型光电化学免疫传感器。
附图说明
图1为实施例1所得CdSeQDs的高分辨TEM图；
图2为实施例1中不同电极之间的性能对比图；其中：a为TiO2@Au修饰的ITO电极；b为裸电极；c为Au-MOFs@Ab2 /CdSeQDs-TiO2@Au修饰的ITO电极；d为CdSeQDs-TiO2@Au修饰的ITO电极。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
步骤1：丝素蛋白的提取：量取360ml含0.018M的碳酸钠溶液，称取9g桑蚕丝放置其中，水浴加热，温度设为75℃，时间设为55min，取出用去离子水清洗3次，干燥后得到丝素，取4.6g硝酸钙，3.6g烘干的丝素，加入甲酸96ml，搅拌80min过滤，加入碳酸氢钠至溶液呈中性后，所得溶液用截留分子量为8000的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔4h换一次水，将所得丝素蛋白溶液真空冷冻干燥2天。，将丝素蛋白研磨成粉备用；
步骤2：CdSeQDs的合成：取0.80ml的巯基乙酸和55ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入45mL 0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH溶液调节上述溶液pH到9.5，然后边搅拌边通入高纯氮气30min以除去溶液中的氧气，接着继续加入1ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下75℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容并置于4℃条件下保存备用；图1为实施例1所得CdSeQDs的高分辨TEM图；
步骤3：Ab2上负载Au-MOFs：称取1.4mmol（0.2744g）2，5-二氨基对苯二甲酸溶解于30ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，磁力搅拌1.5h后，所得产物依次用无水乙醇和DMF洗3次，真空干燥，得到MOFs材料，然后70℃搅拌下，将MOFs材料和氯金酸溶液混合，将该混合溶液超声分散，干燥后在管式炉中焙烧以4℃/min的速度升温至490℃，焙烧2h，得到的粉末即为Au-MOFs，最后向20ml 0.01g/ml的BSA溶液中加入Au-MOFs和10ul Ab2（羊抗兔多克隆抗体），置于30℃保温箱孵育1h得到Au-MOFs@Ab2备用；
步骤4：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.45cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10min，在50℃烘箱中干燥过夜；
步骤5：逐层自组装工艺制备免疫传感器：AuNPs通过电沉积法修饰在ITO电极表面，即将裸露的ITO电极浸泡在0.05%HAuCl4溶液中，沉积电压为0.9V，时间为120s；
步骤6：溶胶-凝胶法制备CdSeQDs-TiO2@Au电极材料：将5ml Ti(i-OC3H7)4、40ml乙醇和40ml乙二醇混合，将所得混合液在室温下搅拌25-35min，然后加入5ml步骤2所得溶液，之后将步骤5所得电极置于TiO2-CdSeQDs凝胶中5min使电极表面形成一层均匀的凝胶膜，然后于管式炉N2气氛下370℃退火煅烧50min，得到CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极；
步骤7：活化CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极：采用滴涂法，用移液枪在干燥后的步骤6所得电极表面滴加10ul 0.05M的MPA水溶液，置于50℃的烘箱中孵育50min形成饱和MPA单层，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，将修饰有MPA的电极浸泡在0.05MEDC/0.03MNHS的MES缓冲液中，并置于60℃的烘箱中孵育50min，将MPA的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤8：构建间接型免疫传感器：滴加5ul 1ul/ml的步骤1丝素蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS(pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10ul的1%BSA在37℃下将电极封闭30min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul1ul/ml的丝素蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加10ul的Au-MOFs@Ab2，置于30℃的烘箱中50min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Au-MOFs@Ab2，即完成了电化学免疫传感器的组装。
步骤9：自组装PEC系统测试传感器性能：光源为带有滤波片的500W氙灯，RST5200电化学工作站，波长范围为280nm，光源开关频率为每10s一次，外加电压为0.0V，所用频率范围为10Hz，正玄波振幅为5mV，经修饰的ITO电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和Ag/AgCl为参比电极。如图2所示为不同电极之间的性能数据：a为TiO2@Au修饰的ITO电极；b为裸电极；c为Au-MOFs@Ab2 /CdSeQDs-TiO2@Au修饰的ITO电极；d为CdSeQDs-TiO2@Au修饰的ITO电极。通过对比可以发现，经本发明的CdSeQDs-TiO2@Au修饰的ITO电极（d）的光电流响应明显强于裸电极。
实施例2
步骤1：丝素蛋白的提取：量取400ml含0.020M的碳酸钠溶液，称取10g桑蚕丝放置其中，水浴加热，温度设为80℃，时间设为60min，取出用去离子水清洗4次，干燥后得到丝素，取5.0g硝酸钙，4.0g烘干的丝素，加入甲酸100ml，搅拌85min过滤，加入碳酸氢钠至溶液呈中性后，所得溶液用截留分子量为9000的纤维素透析袋在去离子水中透析3天，并每隔4h换一次水，将所得丝素蛋白溶液真空冷冻干燥2天，将丝素蛋白研磨成粉备用；
步骤2：CdSeQDs的合成：取0.84ml的巯基乙酸和60ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入50mL 0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH溶液调节上述溶液pH到10，然后且边搅拌边通入高纯氮气40min以除去溶液中的氧气，接着继续加入12ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下80℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容并置于4℃条件下保存备用；
步骤3：Au-MOFs上负载Ab2：称取1.4mmol（0.2744g）2，5-二氨基对苯二甲酸溶解于30ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，磁力搅拌1.5h后，所得产物依次用无水乙醇和DMF洗4次，真空干燥，得到MOFs材料，然后75℃搅拌下，将MOFs材料和氯金酸溶液混合，将该混合溶液超声分散，干燥后在管式炉中以5℃/min的速度升温至500℃，焙烧3h，得到的粉末即为Au-MOFs，最后向20ml 0.01g/ml的BSA溶液中加入Au-MOFs和10ul Ab2（羊抗兔多克隆抗体），置于30℃保温箱孵育1h得到Au-MOFs@Ab2备用；
步骤4：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.45cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗15min，在55℃烘箱中干燥过夜；
步骤5：逐层自组装工艺制备免疫传感器：AuNPs通过电沉积法修饰在ITO电极表面，即将裸露的ITO电极浸泡在0.05%HAuCl4溶液中，沉积电压为0.9V，时间为135s；
步骤6：溶胶-凝胶法制备CdSeQDs-TiO2@Au电极材料：将5ml Ti(i-OC3H7)4、42ml乙醇和42ml乙二醇混合，将所得混合液在室温下搅拌30min，然后加入步骤2所得5ml 溶液，之后将步骤5所得电极置于TiO2-CdSeQDs凝胶中15min使电极表面形成一层均匀的凝胶膜，然后于管式炉N2气氛下385℃退火煅烧60min，得到CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极；
步骤7：活化CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极：采用滴涂法，用移液枪在干燥后的步骤6所得电极表面滴加10ul 0.05M的MPA水溶液，置于55℃的烘箱中孵育60min形成饱和MPA单层，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，将修饰有MPA的电极浸泡在0.05MEDC/0.03MNHS的MES缓冲液中，并置于60℃的烘箱中孵育60min，将MPA的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤8：构建间接型免疫传感器：滴加10ul 1ul/ml的步骤1丝素蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS(pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10ul的1%BSA在37℃下将电极封闭30min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的丝素蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中60min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加10ul的Au-MOFs@Ab2，置于30℃的烘箱中60min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Au-MOFs@Ab2，即完成了电化学免疫传感器的组装；
步骤9：自组装PEC系统测试传感器性能：光源为带有滤波片的500W氙灯，RST5200电化学工作站，波长范围为350nm，光源开关频率为每15s一次，外加电压为0.0V，所用频率范围为60KHz，正玄波振幅为5mV，经修饰的ITO电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，检测发现，经复合材料修饰后的电极光电流响应明显强于裸电极。
实施例3
步骤1：丝素蛋白的提取：量取440ml含0.022M的碳酸钠溶液，称取11g桑蚕丝放置其中，水浴加热，温度设为85℃，时间设为65min，取出用去离子水清洗5次，干燥后得到丝素，取5.4g硝酸钙，4.4g烘干的丝素，加入甲酸104ml，搅拌90min过滤，加入碳酸氢钠至溶液呈中性后，所得溶液用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析3天，并每隔5h换一次水，将所得丝素蛋白溶液真空冷冻干燥3天，将丝素蛋白研磨成粉备用；
步骤2：CdSeQDs的合成：取0.88ml的巯基乙酸和65ml的去离子水混合均匀，然后再向其中加入55ml 0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH溶液调节上述溶液pH到10.5，然后边搅拌边通入高纯氮气50min以除去溶液中的氧气，接着继续加入13ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将反应前驱液在高纯氮气保护下85℃下反应4h，最后将亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗定容并置于4℃条件下保存备用；
步骤3：Au-MOFs上负载Ab2：称取2.8mmol（0.5488g）2，5-二氨基对苯二甲酸溶解于30ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，磁力搅拌1.5h后，所得产物依次用无水乙醇和DMF洗5次，真空干燥，得到MOFs材料，然后80℃搅拌下，将MOFs材料和氯金酸溶液混合，将该混合溶液超声分散，干燥后在管式炉中以6℃/min的速度升温至510℃，焙烧3h，得到的粉末即为Au-MOFs，最后向20ml 0.01g/ml的BSA溶液中加入Au-MOFs和10ulAb2（羊抗兔多克隆抗体），置于30℃保温箱孵育1h得到Au-MOFs@Ab2备用；
步骤4：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.45cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗20min，在60℃烘箱中干燥过夜；
步骤5：逐层自组装工艺制备免疫传感器：AuNPs通过电沉积法修饰在ITO电极表面，即将裸露的ITO电极浸泡在0.06%HAuCl4溶液中，沉积电压为0.9V，时间为150s；
步骤6：溶胶-凝胶法制备CdSeQDs-TiO2@Au电极材料：将5ml Ti(i-OC3H7)4、45ml乙醇和45ml乙二醇混合，将所得混合液在室温下搅拌35min，然后加入步骤2所得5ml 溶液，之后将步骤5所得电极置于TiO2-CdSeQDs凝胶中20min使电极表面形成一层均匀的凝胶膜，然后于管式炉N2气氛下400℃退火煅烧70min，得到CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极；
步骤7：活化CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极：采用滴涂法，用移液枪在干燥后的步骤6所得电极表面滴加15ul 0.05M的MPA水溶液，置于60℃的烘箱中孵育70min形成饱和MPA单层，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，将修饰有MPA的电极浸泡在0.05MEDC/0.03MNHS的MES缓冲液中，并置于60℃的烘箱中孵育70min，将MPA的末端羧基转化为活性NHS酯，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净；
步骤8：构建间接型免疫传感器：滴加10ul1ul/ml的步骤1丝素蛋白CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS(pH=7.4)彻底清洗去除未结合的抗原后，再用15ul的1%BSA在37℃下将电极封闭30min，随后，用1%的BSA封闭1h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加5ul 1ul/ml的丝素蛋白抗体（Ab1）溶液，置于30℃的烘箱中70min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加10ul的Au-MOFs@Ab2，置于30℃的烘箱中70min，用0.01mol·L-1磷酸缓冲溶液(PBS)(pH＝7.4)洗净未固定的Au-MOFs@Ab2，即完成了电化学免疫传感器的组装；
步骤9：自组装PEC系统测试传感器性能：光源为带有滤波片的500W氙灯，RST5200电化学工作站，波长范围为500nm，光源开关频率为每20s一次，外加电压为0.0V，所用频率范围为100KHz，正玄波振幅为5mV，经修饰的ITO电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和Ag/AgCl为参比电极，检测发现，经复合材料修饰后的电极光电流响应明显强于裸电极。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于CdSeQDs-TiO2@Au的丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：丝素蛋白的提取：量取360-440ml含0.018-0.022M的碳酸钠溶液，向溶液中添加9-11g桑蚕丝，75-85℃水浴加热55-65min，取出，用去离子水清洗，干燥后得到丝素，取4.6-5.4g硝酸钙，3.6-4.4g丝素，加入甲酸96-104ml，搅拌80-90min过滤，加入碳酸氢钠至溶液呈中性后，透析冷冻干燥，研磨，得到将丝素蛋白；
步骤2：CdSeQDs的合成：取0.80-0.88ml的巯基乙酸和55-65ml的去离子水混合均匀，然后加入45-55ml 0.1M的氯化镉水溶液并搅拌均匀，用0.1M NaOH溶液调节溶液pH为9.5-10.5，然后通入惰性气体除去溶液中的氧气，接着加入11-13ml 0.2M的NaHSe溶液并搅拌均匀，然后将所得反应前驱液在惰性气体保护下75-85℃下反应3-5h，最后将所得的亮黄色CdSeQDs溶液冷却至室温，离心清洗后保存备用；
步骤3：Au-MOFs@Ab2的制备：称取1.4-2.8mmol2，5-二氨基对苯二甲酸溶解于25-35ml的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌1-2h后，所得产物依次用无水乙醇和N，N-二甲基甲酰胺清洗，真空干燥，得到MOFs材料；然后在70-80℃搅拌下，将MOFs材料和氯金酸溶液混合，超声分散，干燥后焙烧，得到粉末状的Au-MOFs，最后向18-22ml 0.01g/ml的BSA溶液中加入Au-MOFs和8-12ul Ab2，置于25-35℃保温箱孵育0.5-1.5h，得到Au-MOFs@Ab2；
步骤4：ITO导电玻璃电极预处理：取面积为0.4-0.5cm2的ITO导电玻璃电极，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗，干燥；
步骤5：逐层自组装制备免疫传感器：将AuNPs通过电沉积法修饰于ITO导电玻璃电极表面，即将裸露的ITO导电玻璃电极浸泡在0.05-0.06wt%HAuCl4溶液中，沉积电压为0.8-1.0V，时间为120-150s；
步骤6：溶胶-凝胶法制备CdSeQDs-TiO2@Au电极材料：将5ml Ti(i-OC3H7)4、40-45ml乙醇和40-45ml乙二醇混合，将所得混合液在室温下搅拌25-35min，然后加入3-7ml步骤2所得溶液，得到TiO2-凝胶；之后将步骤5所得电极置于TiO2-CdSeQDs凝胶中5-20min使电极表面形成一层均匀的凝胶膜，然后于管式炉中退火煅烧，得到CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极；
步骤7：活化CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极：采用滴涂法在干燥后的步骤6所得电极表面滴加10-15ul 0.05M的MPA水溶液，于50-60℃中孵育50-70min形成饱和MPA单层，用PBS缓冲液洗净，将所得修饰有MPA的电极浸泡在MES缓冲液中，并于55-65℃中孵育50-70min，将MPA的末端羧基转化为活性NHS酯，用PBS缓冲液洗净，得到活化的CdSeQDs-TiO2@Au/ITO电极；
步骤8：构建间接型免疫传感器：滴加5-10ul 1ul/mL的步骤1所得丝素蛋白的CB液，使其端氨基与活化后的羧基结合，用PBS缓冲液彻底清洗去除未结合的抗原后，再用10-15ul的0.8-1.2%BSA在35-40℃下将电极封闭25-35min；随后，用0.8-1.2%的BSA封闭0.5-1.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，继续滴加3-7ul1ul/ml的兔抗丝素蛋白抗体溶液，即Ab1抗体溶液，置于25-35℃下50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Ab1抗体，最后滴加8-12ul步骤3所得Au-MOFs@Ab2，置于25-35℃中50-70min，用PBS缓冲液洗净未固定的Au-MOFs@Ab2，即得到丝素蛋白检测用光电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所得溶液用截留分子量为8000-10000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔4-5h换一次水，将所得丝素蛋白溶液真空冷冻干燥2-3天。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述惰性气体为高纯氮气，且边搅拌边通入高纯氮气30-50min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，焙烧为：管式炉中以4-6℃/min的速度升温至490-510℃，焙烧2-3h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述Ab2为羊抗兔多克隆抗体。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4中，分别用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗10-20min，干燥温度为50-60℃。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤6中，退火煅烧为：于管式炉N2气氛下370-400℃退火煅烧50-70min。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤7中，所述MES缓冲液中含有0.05M的EDC和0.03M的NHS。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤7和8中，所述PBS缓冲液的pH=7.4。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤8中，所述CB液的pH=9.6。
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