CN114622013A - 一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术及医学领域，具体公开了一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，所述产品包括能特异性扩增致病基因的引物，致病基因为突变的AGPAT5基因，所述突变的AGPAT5基因与野生型AGPAT5基因的差异包括1个突变，突变为野生型AGPAT5基因编码区7号外显子第856位碱基G突变为A，突变的AGPAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。产品为检测试剂盒时，检测灵敏度高、检测结果准确，经济节约。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品。
背景技术
脊柱侧弯又称脊柱侧凸，它是一种脊柱的三维畸形，包括冠状位、矢状位和轴位上的序列异常。其中，青少年特发性脊柱侧弯是一种常见的脊柱畸形，常发生于患者10岁至骨骼成熟期。青少年特发性脊柱侧弯的发病率在青少年中大约为2%-4%，女性发病率显著高于男性，男女发病率大约为1:8。目前针对青少年特发性脊柱侧弯处理的手段主要有非手术治疗和手术治疗，非手术治疗主要适用于程度较低，例如Cobb角在四十度以下同时进展较慢的情况；手术治疗用于畸形较为严重的情况，例如Cobb角在四十度以上的情况。
青少年特发性脊柱侧弯的病因很多，例如激素紊乱、发育性神经肌肉功能障碍（椎旁肌）等，然而这些因素都不能完全揭示其机制。越来越多的研究发现，青少年特发性脊柱侧弯有明显的遗传倾向，多个相关的家系也被报道。基于家系连锁分析定位了多个与其相关的区间，例如，19p13.3 (IS1)、17p11.2 (IS2)、8q12 (IS3)、9q31–q34 (IS4)以及17q25-qter (IS5)。通过关联分析，研究已经报道LBX1、DNAAF1、ZMYND10、PAX1、KIF6、SLC39A8、CHD7及PTK7与青少年特发性脊柱侧弯相关。然而，目前通过家系研究，报道与青少年特发性脊柱侧弯相关的基因仅有MAPK7、HSPG2、POC5、AKAP2、 TTLL11与CELSR2。针对以上可能的致病基因的研究也只能部分揭示青少年特发性脊柱侧弯的发病机制。因此，定位更多的疾病相关基因，且开发更多的检测产品，为其诊断、预防与治疗提供新的思路迫在眉睫。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种首次发现的青少年特发性脊柱侧弯的致病基因为突变的AGPAT5基因，并提供了一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，检测灵敏度高、检测结果准确，经济节约。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，所述产品包括能特异性扩增所述青少年特发性脊柱侧弯致病基因的引物，致病基因为突变的AGPAT5基因，所述突变的AGPAT5基因与野生型AGPAT5基因的差异包括1个突变，突变为野生型AGPAT5基因编码区7号外显子第856位碱基G突变为A，突变的AGPAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的引物B7-F以及核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的引物B7-R。
进一步地，所述产品包括芯片或试剂盒或生物试剂。
进一步地，所述产品为检测试剂盒，所述检测试剂盒还包括DNA扩增酶、缓冲液、dNTP混合物。
进一步地，所述DNA扩增酶为Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶的浓度为1U/μL；所述缓冲液为MgCl2溶液，MgCl2溶液的浓度为10mM；所述dNTP混合物的浓度为10 mM。
进一步地，检测试剂盒中，引物组、DNA扩增酶、缓冲液、水的体积比为2:1:2: 4。
本发明还涉及一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，所述产品包括引物组，引物组包括PCR扩增引物对，所述PCR扩增引物对包括引物B1-F、引物B1-R、引物B2-F、引物B2-R、引物B3-F、引物B3-R、引物B4-F、引物B4-R、引物B5-F、引物B5-R、引物B6-F、引物B6-R、引物B7-F、引物B7-R、引物B8-F、引物B8-R中的至少一对；
当PCR扩增引物对包括引物B8-F和引物B8-R时，所述引物组还包括测序引物，测序引物包括B8测序引物1、B8测序引物2、B8测序引物3、B8测序引物4、B8测序引物5、B8测序引物6中的至少一个；其中：
引物B1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物B1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
引物B2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
引物B2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
引物B3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
引物B3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
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B8测序引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
B8测序引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
B8测序引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
B8测序引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
有益效果：
1）本发明所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其公开了一种在常染色体显性遗传青少年特发性脊柱侧弯家系中首次鉴定到的新的致病基因，其为突变的AGPAT5（NM_018361.5），该基因位于8号染色体8p23.1上，该基因为野生型AGPAT5基因的7号外显子第856位碱基G突变为A的杂合突变。并基于该致病基因设计了青少年特发性脊柱侧弯的检测产品，从而进一步扩大青少年特发性脊柱侧弯家突变谱，为该疾病的预防、诊断及治疗提供新的依据
2）本发明所述的新的致病基因AGPAT5（NM_018361.5）的检测产品的提出，有利于明确青少年特发性脊柱侧弯的分子诊断及分型，用于开展基因诊断与遗传咨询，应用于青少年特发性脊柱侧弯者子代产前诊断，指导优生优育。此外，新的家族性多发性脂肪瘤致病基因AGPAT5编码1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶，定位于线粒体外膜，可以将LPA转化为PA，与线粒体的Fission与Fusion相关，可能通过影响线粒体功能，进而影响成骨参与疾病的发生。
3）本发明公开的青少年特发性脊柱侧弯检测产品可用于突变的AGPAT5基因在任意可能影响氨基酸编码或者蛋白表达情况的核苷酸序列突变的检测，通过设计PCR扩增引物组，结合Sanger测序，可检测AGPAT5基因所有UTR区、编码区的变异、剪切位点变异，提供了的用于青少年特发性脊柱侧弯致病基因检测的检测试剂盒，检测方便，灵敏度高，结果精准，且扩增次数少，经济节约。
附图说明
图1 为青少年特发性脊柱侧弯家系图。
图2 为先证者临床表型之术前X射线影像学图（a为正面示意图，b为侧面示意图）。
图3 为连锁分析图。
图4为突变点测序表。
图5为保守性分析表。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1
本实施例涉及到的突变的AGPAT5基因为青少年特发性脊柱侧弯的致病基因，所述突变的AGPAT5基因与野生型AGPAT5基因的差异包括1个突变，突变为野生型AGPAT5基因编码区7号外显子第856位碱基G突变为A，突变的AGPAT5基因的核苷酸序列如下所示（SEQ IDNO.1），其中突变位点用下划线标记。
SEQ B7：
ctttgttagAATTTCTCTGCAAAGAATGTCCAAAAATTCATATTCACATTGATCGTATCGACAAAAAAGATGTCCCAGAAGAACAAGAACATATGAGAAGATGGCTGCATGAACGTTTCAAAATCAAAGATAAgtgagta。
野生型AGPAT5基因的核苷酸序列如下所示（SEQ ID NO.2）.
SEQ B7WT：
ctttgttagAATTTCTCTGCAAAGAATGTCCAAAAATTCATATTCACATTGATCGTATCGACAAAAAAGATGTCCCAGAAGAACAAGAACATATGAGAAGATGGCTGCATGAACGTTTCGAAATCAAAGATAAgtgagta。
该致病基因的鉴定流程如下：
1）研究对象收集。采集到一个青少年特发性脊柱侧弯家系，如图1所示，其中，外圆圈所指为本次采集的样品；箭头所指为先证者，先证者年龄为12岁；灰色色块为无脊柱侧弯表型的携带者。
采集到其中8人，其中患者4人，携带者1人，正常人3人。其中先证者、先证者父亲等患者表现出脊柱侧弯的表型，但先证者奶奶无显著脊柱侧弯表型，根据家系图分析，可能存在外显不全的情况，为携带者。先证者年龄为12岁，先证者的临床表型图如图2所示，可见其脊柱有显著的侧弯表型。先证者的父亲出现侧弯表型年龄为15岁。在征得知情同意后，每人采静脉血5mL，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取，DNA经分光光度计测量浓度后，稀释为50ng/μL，用于后续PCR反应、DNA芯片测序及外显子测序。
2）外显子组测序：选取家系内先证者、先证者父亲（V-3）、先证者姑姑（V-2）、先证者爷爷（IV-1）、先证者奶奶（IV-2）以及家系内两名患者IV-6与IV-9进行外显子组测序。外显子组测序流程简要说明如下：将基因组DNA随机超声破碎为250bp左右的片段，接上测序接头，随后利用DNA测序芯片捕获进行高通量测序，测序仪器为illumina3000平台。
3）候选基因筛选。测序下机数据进行质控后，经过注释进行分析筛选。筛选标准如下：（1）筛选出最小等位基因频率为小于或者等于0.1%的位点；（2）筛选出非同义变异、框移、插入缺失、可能的剪切位点变异；（3）考虑到该家系为常染色体显影遗传，筛选出杂合子变异；（4）筛选出患者共有而正常人没有的突变位点。在此策略下，共计筛选出7个位点（表1）。
表1 外显子组测序筛选结果表
4）DNA芯片测序与连锁分析。选取家系内所有收集到的样品进行DNA芯片测序。使用Illumina ASA 750K芯片进行测序，测序后得到数据，使用MERLIN进行连锁分析。以LOD值0为阈值，认定0以上区间为连锁，0以下区间为不连锁。结合外显子组测序的结果，关注7、8及12号染色体上连锁区间，结果显示仅在7与8号染色体上有连锁区间，12号染色体上无连锁区间。
5）致病基因定位。结合连锁分析的数据与外显子测序候选基因数据，两者重合的部分仅有AGPAT5基因第856位碱基G突变为T的杂合突变。
实施例2
一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，产品包括芯片、试剂盒或生物试剂等。
本实施例以检测试剂盒为例。检测试剂盒用于检测青少年特发性脊柱侧弯的致病基因，致病基因为突变的AGPAT5基因，突变的AGPAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的引物B7-F以及核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的引物B7-R。
引物设计：候选基因的变异基因标准序列来自与UCSC GENOME BROSWER（https://genome.ucsc.edu/），编号为NM_018361.5，使用在线引物设计软件Primer 3.0 (v. 0.4.0)（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计引物并合成，利用BLAT（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat）在线预测引物特异性。
用于检测脊柱侧弯的检测试剂盒，其中引物组、DNA扩增酶、缓冲液、水的体积比为2:1:2: 4，其中所述DNA扩增酶为Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶的浓度为1U/μL；所述缓冲液为MgCl2溶液，MgCl2溶液的浓度为10mM；所述dNTP混合物的浓度为10 mM。检测时，加入的DNA模板与缓冲液的体积比为1:1，DNA模板的浓度为50ng/μL。
检测试剂盒在青少年特发性脊柱侧弯致病基因检测中的应用。
分别以正常人（IV-1、 V-2、V-4、VI-1）和患者（IV-2、IV-6、IV-9、V-3、VI-2）为被检者，进行如下操作：
1.采集被检者外周静脉血5mL，使用DNA提取试剂盒进行提取，DNA经分光光度计测量浓度后，稀释为50ng/μL。
2. PCR反应条件为：98℃预变性2分钟；40个扩增循环98℃ 10秒，59℃30秒，72℃1分钟；4℃保存。反应总体系为10μL，按照顺序分别加入4μL PCR水，1μL正向扩增引物（B7-F），1μL反向扩增引物（B7- R），2μL 缓冲液，1μL DNA模板，1μL DNA聚合酶。
利用试剂盒完成PCR后，进行琼脂糖凝胶电泳确定是否有条带，送测序公司进行Sanger测序，获得ABI文件。利用Seqman软件，将获得的ABI文件与标准序列进行比对，鉴定到突变位点，Sanger测序图如图4中所示。
正常人与的患者Sanger测序图，箭头所指为突变位点，该位点为c.856 G>T变异，该序列为反向互补序列因此显示为C>A变异；（B）通过保守性分析，如图5所示，发现该突变导致的第286位氨基酸谷氨酸在物种中保守。可见正常人的AGPAT5基因没有突变，而患者的基因发生了G突变为T的杂合子变异，该变异发生在AGPAT5基因编码区第856位上，与事先诊断重合度较好，准确度高。
实施例3
在实际应用过程中，考虑到非编码区对于基因转录翻译的影响，设计引物覆盖UTR区、编码区及剪切位点区域。从而还可检测出存在于AGPAT5基因的可能影响氨基酸编码或者蛋白表达情况的核苷酸序列突变位点。
青少年特发性脊柱侧弯检测产品用于检测野生型AGPAT5基因在任意可能影响氨基酸编码或蛋白表达的核苷酸序列位点上的突变。在一些实施例中，检测产品为 用于检测AGPAT5基因的突变的试剂盒，检测试剂盒中，引物组由8组PCR扩增引物对和6个测序引物组成，所述PCR扩增引物对包括引物B1-F、引物B1-R、引物B2-F、引物B2-R、引物B3-F、引物B3-R、引物B4-F、引物B4-R、引物B5-F、引物B5-R、引物B6-F、引物B6-R、引物B7-F、引物B7-R、引物B8-F、引物B8-R；所述测序引物包括B8测序引物1、B8测序引物2、B8测序引物3、B8测序引物4、B8测序引物5、B8测序引物6；其中：
引物B1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物B1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
引物B2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
引物B2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
引物B3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
引物B3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
引物B4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
引物B4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
引物B5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
引物B5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
引物B6-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
引物B6-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
引物B7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
引物B7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
引物B8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
引物B8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
B8测序引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
B8测序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示
B8测序引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
B8测序引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
B8测序引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
B8测序引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
检测过程如实施例2所示，每次扩增选用其中的任一PCR扩增引物对进行扩增，当PCR扩增引物为引物B8-F和引物B8-R时，测序时候需提供测序引物，测序引物包括B8测序引物1、B8测序引物2、B8测序引物3、B8测序引物4、B8测序引物5、B8测序引物6中的至少一个。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品
<130> 2022
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 1
ctttgttaga atttctctgc aaagaatgtc caaaaattca tattcacatt gatcgtatcg 60
acaaaaaaga tgtcccagaa gaacaagaac atatgagaag atggctgcat gaacgtttcg 120
aaatcaaaga taagtgagta 140
<210> 2
<211> 140
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 2
ctttgttaga atttctctgc aaagaatgtc caaaaattca tattcacatt gatcgtatcg 60
acaaaaaaga tgtcccagaa gaacaagaac atatgagaag atggctgcat gaacgtttca 120
aaatcaaaga taagtgagta 140
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gagggtcatg gggtgtga 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gcagccacag cttcctagag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tgctttctgt acctgcgcta t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gcccatgtgc catctgtag 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cgctaactgg gtcctgtctc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gggtatggca gttcacacct 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tgatgactct ggccaattgt t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
agggtttctg ttacctcagc a 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ccctcttgaa acgaaggtca 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
aaatccatgg cacaagaata tg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
tgccggggtc tactagattg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ctcacacgac agccaagaaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ggctccagct tcctattcct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
agatgggccc actgtaacaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
cagagggacc gctgtctaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
tggggtttgt gatgacagtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
gaatttatta aggagtgtaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gccataagtg cttgaaaacg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ccacattaaa cataccagtt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
ataagaatgc cgtcgatgtg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ctgagtagtt tgtcccagct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
acaactcttc gatactatca 20
Claims (7)
1.一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，所述产品包括能特异性扩增青少年特发性脊柱侧弯致病基因的引物，致病基因为突变的AGPAT5基因，所述突变的AGPAT5基因与野生型AGPAT5基因的差异包括1个突变，突变为野生型AGPAT5基因编码区7号外显子第856位碱基G突变为A，突变的AGPAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示的引物B7-F以及核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示的引物B7-R。
3.根据权利要求1所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒或生物试剂。
4.根据权利要求1所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，所述产品为检测试剂盒，所述检测试剂盒还包括DNA扩增酶、缓冲液、dNTP混合物。
5.根据权利要求4所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，所述DNA扩增酶为Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶的浓度为1U/μL；所述缓冲液为MgCl2溶液，MgCl2溶液的浓度为10mM；所述dNTP混合物的浓度为10 mM。
6.根据权利要求5所述的青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，检测试剂盒中，引物组、DNA扩增酶、缓冲液、水的体积比为2:1:2: 4。
7.一种青少年特发性脊柱侧弯检测产品，其特征在于，检测产品包括引物组，引物组包括PCR扩增引物对，所述PCR扩增引物对包括引物B1-F、引物B1-R、引物B2-F、引物B2-R、引物B3-F、引物B3-R、引物B4-F、引物B4-R、引物B5-F、引物B5-R、引物B6-F、引物B6-R、引物B7-F、引物B7-R、引物B8-F、引物B8-R中的至少一对；
当PCR扩增引物对包括引物B8-F和引物B8-R时，所述引物组还包括测序引物，测序引物包括B8测序引物1、B8测序引物2、B8测序引物3、B8测序引物4、B8测序引物5、B8测序引物6中的至少一个；其中：
引物B1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
引物B1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
引物B2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
引物B2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
引物B3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
引物B3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
引物B4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
引物B4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
引物B5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
引物B5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
引物B6-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
引物B6-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
引物B7-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
引物B7-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
引物B8-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
引物B8-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
B8测序引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
B8测序引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示
B8测序引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
B8测序引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
B8测序引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
B8测序引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
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