CN114605364B - 一种赤霉素ga4的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的赤霉素GA4的提取方法。该提取方法是发酵料液经过前期处理后，经过板框过滤、超滤和反渗透浓缩后得到浓缩液，浓缩液用乙酸乙酯进行萃取，萃取轻液进行减压浓缩，浓缩至一定体积后，转入到结晶罐，待料液结晶完全后，进行过滤、洗涤、干燥得到赤霉素GA4结晶粉。母液可以继续进行减压浓缩，或者与下一批GA4萃取液进行减压浓缩后继续结晶。该方法只需使用一种乙酸乙酯有机溶剂，且其中的乙酸乙酯可以进行溶剂回收，循环使用，摒弃了N‑甲基苄胺、正丙醇、甲醇等价格昂贵的多种化学试剂使用，工艺流程短，提取成本低，操作简单、易于实施，并且安全、环保，提取收率高，粉剂母液比值高，结晶粉中GA4含量高，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物生长调节剂生产提取技术领域，具体涉及一种赤霉素GA4的提取方法，该方法适用于赤霉素GA4的液体发酵体系。
背景技术
植物生长调节剂(plant growth regulators)是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质。在农业生产上经常用于有效调节作物的生长发育过程，达到稳产增产、改善品质、增强作物抗逆性等目的。而赤霉素(Gibberellins，GAs)是目前使用最广泛的植物调节剂之一，其种类繁多目前已发现的赤霉素共有136种，总称为赤霉素类(GAs)。赤霉素类化合物是一类属于双萜类化合物，其在植物的不同生长阶段，产生的部位不尽相同，产生的调节作用也不一样。赤霉素GA3主要是调节植物的茎叶的生长，且活性最强。GA4主要对植物果实细胞的伸长调节作用最为明显。GA7主要用于核果类植物的开花期，调节植物的开花数量，从而保证果实的质量，但总的来说，GA3的活性最高。
目前市场上商用的赤霉素几乎都是用微生物发酵所得。在发酵过程中会产生很多有机杂质，这些杂质在前期过程很难去掉，因此会给赤霉素提取带来一些困难。尤其是赤霉素GA4的提取，其工艺冗长且复杂。
目前GA4的提取方法主要采用1982年日本专利59106478所公开的提取方法，其主要工艺流程为GA4发酵液经过前期处理后，再进行一般的赤霉素萃取，蒸出大部分乙酸乙酯，加入正丙醇，再加入N-甲基苄胺，形成N-甲基苄胺盐沉淀，将铵盐分离后用甲醇水溶液溶解，加酸使GA4结晶析出。其工艺不仅需要使用价格昂贵的N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等化学试剂，同时其工艺复杂、冗长。其中还涉及到成盐的化学反应，不适合工业上生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中的赤霉素GA4的提取工艺不仅需要使用价格昂贵的N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等化学试剂，同时其工艺复杂冗长等缺陷与不足，提供一种工艺简单，易于实施的赤霉素GA4的提取方法。该提取方法摒弃了N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等化学试剂的使用，只需使用一种乙酸乙酯有机溶剂，不需脱色，母液可以重复使用，其中的乙酸乙酯可以进行溶剂回收，循环使用，环保条件好，得到的赤霉素GA4结晶粉含量能达到92％以上，萃取后提取收率也能达到80％以上。
本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。
一种赤霉素GA4的提取方法，它包括下列步骤：
S1：发酵料液前期处理：发酵料液用碱调节pH；
S2：板框过滤：将调节pH后的发酵料液进行板框过滤，收集滤液；板框过滤的主要目的是固液分离，得到板框滤液与滤渣；滤渣进行资源化处理。
S3：超滤：将板框滤液进行超滤，收集超滤液；超滤的主要目的是除去大分子可溶杂质与板框过滤未除尽的不溶物，得到超滤液与超滤渣；超滤渣进行资源化处理。
S4：反渗透浓缩；将超滤液进行反渗透浓缩，收集反渗透浓缩液；反渗透浓缩的主要目的是除去水分子和无机离子。
S5：萃取：反渗透浓缩液调节pH后加入破乳剂和乙酸乙酯进行萃取分离，转入有机相，收集萃取轻液；萃取重液(萃余液)进入环保处理。
S6：减压浓缩：将萃取轻液进行减压浓缩(即真空浓缩)，浓缩液效价控制在10-15万μg/mL；减压浓缩回收得到的乙酸乙酯进行循环利用。之所以将浓缩液效价控制在10-15万μg/mL，是因为：如果高于15万μg/mL，易使下一步的结晶同时将杂质结晶析出，而影响结晶粉中GA4含量；如果低于10万μg/mL，容易使GA4结晶析出很不完全，而降低结晶粉的析出重量。
S7：结晶：将减压浓缩液转入结晶罐，开启搅拌，进行结晶，结晶时间为2-5个小时；之所以将结晶时间限定为2-5个小时，是因为：结晶时间如果高于5个小时，则易将杂质结晶析出；结晶时间如果低于2个小时，则GA4结晶析出不完全。
S8：过滤、洗涤、干燥：浓缩液结晶完全后，进行过滤操作，在过滤过程中加入少量的乙酸乙酯进行洗涤，洗涤完成后，得到的GA4结晶粉进行干燥，称重并测其含量；
S9：过滤和洗涤后的母液继续进行减压浓缩，或者与下一批GA4萃取轻液进行减压浓缩后继续结晶，或者做成乳油产品；得到的GA4结晶粉进行干燥，称重并测其含量，同时，记录剩余母液的体积，并测其效价，计算收率。
步骤S1中所述的pH为6.0-7.5；较优选为6.6-7.0；最优选6.8。将pH调高至6.0-7.5的主要目的是GA4分子由酸态转为盐态，增加在水中的溶解度，使残留在胞内的GA4分子尽量释放出来。之所以需将pH调至6.0-7.5，是因为pH如果低于6.0，则GA4分子未能由酸态全部转为盐态，从而显著影响GA4的提取收率；如果高于7.5，则GA4分子很易分解，同样显著影响GA4的提取收率。
步骤S2中所述的板框过滤设备是板框压滤机。
步骤S3中所述的超滤，其设备为超滤机，超滤膜的分子截留量为5-8万。
步骤S4中所述的反渗透浓缩倍数为3-5倍；较优选为3.5-4.5倍；最优选4倍；浓缩设备优选为二级浓缩纳滤膜设备。
步骤S5中所述的萃取中调节pH为4.0-5.0；较优选为4.2-4.6；最优选4.4，同时加入0.1-0.3％的破乳剂，控制萃取剂和反渗透浓缩液的比例为0.6-1:1；较优选为0.7-0.9:1；最优选为0.8:1。将pH调低至4.0-5.0的主要目的是将GA4分子由盐态重新转成酸态，以利于溶媒萃取转入有机相。
步骤S6中所述的减压浓缩中温度控制在40-60℃；较优选为50-54℃；最优选52℃，真空度控制在-0.07至-0.10MPa，浓缩设备为旋转蒸发仪或真空浓缩蒸发器。减压浓缩中温度如果高于60℃则容易使GA4分子衰变，低于40℃则有机溶媒难以有效蒸出。
步骤S8中所述的干燥设备为真空干燥箱或双锥真空干燥器。
步骤S9中所述的干燥设备为真空干燥箱或双锥真空干燥器。
步骤S9中所述的计算收率的公式为：
【一次结晶粉质量*含量+二次结晶粉质量*含量+
剩余母液效价(μg/mL)*母液体积(mL)*10-6】/
【萃取轻液效价(μg/mL)*萃取液体积(mL)*10-6】
有益效果：
(1)本发明提供的一种赤霉素GA4的提取方法，提取流程由原来的十五个以上步骤缩短至不到十个步骤，减压浓缩液效价10-15万μg/mL左右，得到的赤霉素GA4结晶粉含量由原来的不到90％提高到92.7-98.0％，萃取后的提取收率由原来的不到72％提高到80.93％-88.96％，粉剂母液比值由原来的2：1左右提高到2.64-4.56：1。说明本发明所公开的一种赤霉素GA4的提取方法，提取工艺合理简便，可显著提高提取效率，粉剂母液比值高，得到的结晶粉GA4含量高。
(2)本发明提供的一种赤霉素GA4的提取方法，只需使用一种乙酸乙酯有机溶剂，且其中的乙酸乙酯可以进行溶剂回收，循环使用，摒弃了N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等价格昂贵的多种化学试剂使用，不仅消除了有毒有害的N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇对操作人员的身心健康影响，保证了操作人员的身心健康，而且显著地降低了提取成本。
(3)本发明提供的一种赤霉素GA4的提取方法，不需脱色，结晶分离后的母液既可以继续进行减压浓缩，也可以与下一批的轻液混合进行浓缩，母液的连续处理和重复使用，不仅可以加快生产效率，而且显著减少了生产废液的产生与排放，有效地保护生态环境。
附图说明：
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下述实施例与对比例的所列数据，均为同期制备、同期试验而得到。
实施例1：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1280μg/mL，用碱调节pH＝6.8，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝6.5左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数4倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:0.8加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.4，并加入0.15％的“1231”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1660L效价为7363μg/mL。
6)减压浓缩
取2.0L效价为7363μg/mL的萃取轻液，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在52℃左右，真空度控制在-0.081MPa，浓缩至体积为110mL效价为132447ug/mL后迅速转入至烧杯中。
7)结晶、过滤、干燥
将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在5℃，加入搅拌子在搅拌台上开启缓慢搅拌，至结晶3个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入少量乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量约为母液体积的0.5倍，即加入55mL乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为6.59g,含量为98.0％，剩余母液144mL。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将144mL的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积50mL，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉4.59g,含量为93.4％，母液62mL,效价为37996μg/mL，同时母液可以进行下一步套用。
发酵液至萃取前收率＝1660L*7363/10000L*1280＝95.49％
萃取后收率＝(6.59*98.0％+4.59*93.4％+37996*62*10-6)/(7363*2000*10-6)＝88.96％。
总收率＝95.49％*88.96％＝84.95％
粉剂/母液比＝(6.59*98.0％+4.59*93.4％)：37996*62*10-6＝10.7453：2.3558＝4.56：1
实施例2：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1250μg/mL，用碱调节pH＝6.25，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝6.25左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数3倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:0.7加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.95，并加入0.15％的“洗衣粉”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1420L效价为8237μg/mL。
6)减压浓缩
取2.0L效价为8237μg/mL的萃取轻液，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在45℃左右，真空度控制在-0.095MPa，浓缩至体积为124mL,效价为132054ug/mL后迅速转入至烧杯中。
7)结晶、过滤、干燥
将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在6℃，加入搅拌子在搅拌台上开启缓慢搅拌，至结晶3.5个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入少量乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量约为母液体积的0.5倍，即加入62mL乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为7.32g,含量为96.6％，剩余母液168mL。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将168mL的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积66mL，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉4.12g,含量为93.7％，母液78mL,效价为38687μg/mL，同时母液可以进行下一步套用。
发酵液至萃取前收率＝1420L*8237/10000L*1250＝93.57％
萃取后收率＝(7.32*96.6％+4.12*93.7％+38687*78*10-6)/(8237*2000*10-6)＝84.67％。
总收率＝93.57％*84.67％＝79.23％
粉剂/母液比＝(7.32*96.6％+4.12*93.7％)：38687*78*10-6＝10.9316：3.0176＝3.62：1
实施例3：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1310μg/mL，用碱调节pH＝6.05，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝6.05左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数3.5倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:0.75加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.8，并加入0.2％的“洗衣粉”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1640L效价为7087μg/mL。
6)减压浓缩
取2.0L效价为7087μg/mL的萃取轻液，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在58℃左右，真空度控制在-0.070MPa，浓缩至体积为100mL，效价为140120ug/mL后迅速转入至烧杯中。
7)结晶、过滤、干燥
将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在0℃，加入搅拌子在搅拌台上开启缓慢搅拌，至结晶3.5个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入少量乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量约为母液体积的0.5倍，即加入50mL乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为5.89g,含量为97.3％，剩余母液138mL。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将138mL的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积50mL，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉3.47g,含量为94.5％，母液66mL,效价为38563μg/mL，同时母液可以进行下一步套用。
发酵液至萃取前收率＝1640L*7087/10000L*1310＝88.72％。
萃取后收率＝(5.89*97.3％+3.47*94.5％+38563*66*10-6)/(7087*2000*10-6)＝81.52％。
总收率＝88.72％*81.52％＝72.32％。
粉剂/母液比＝(5.89*97.3％+3.47*94.5％)：38563*66*10-6＝9.0101：2.5452＝3.54：1
实施例4：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1290μg/mL，用碱调节pH＝7.2，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝7.2左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数约4.5倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:1加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.6，并加入0.25％的“1231”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1780L效价为6642μg/mL。
6)减压浓缩
取9.922L效价为6642μg/mL的萃取轻液以及实施例2中的二次结晶母液(78mL效价为38687μg/mL)一起10L料液，效价为6892μg/mL，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在45℃左右，真空度控制在-0.090MPa，浓缩至体积为635mL，效价为108267ug/mL,后迅速转入至烧杯中。
7)结晶、过滤、干燥母液
将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在3℃，加入搅拌子在搅拌台上开启缓慢搅拌，至结晶4个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量为母液体积的0.45倍，即加入285mL乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为32.84g,含量为95.3％，剩余母液862mL。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将862mL的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积450mL，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉11.12g,含量为92.7％，母液421mL,效价为37372μg/mL，同时母液可以进行下一步套用。
发酵液至萃取前收率＝1780L*6642/10000L*1290＝91.65％。
萃取后收率＝(32.84*95.3％+11.12*92.7％+37372*421*10-6)/(6892*9922*10-6+38687*78*10-6)＝80.31％。
总收率＝91.65％*80.31％＝74.52％。
粉剂/母液比＝(32.84*95.3％+11.12*92.7％)：37372*421*10-6＝41.6048：15.7336＝2.64：1
实施例5：工业化实例
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液60000L，测其发酵液放罐效价为1230μg/mL，用碱调节pH＝6.8，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝6.8左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数4.0倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:0.8加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.4，并加入0.15％的“1231”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液11000L效价为6380μg/mL。
6)减压浓缩
将该11000L效价为6380μg/mL的萃取轻液，通过真空浓缩蒸发器进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在52℃左右，真空度控制在-0.081MPa，浓缩至体积为615L,效价为113745ug/mL后，迅速转入至结晶罐中。
7)结晶、过滤、干燥
对结晶罐开启结晶罐夹套冰水，冷水温度控制在5℃，开启缓慢搅拌，至结晶3个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入少量乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量约为母液体积的0.55倍，即加入338L乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在双锥真空干燥器中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为32.65kg,含量为96.9％，剩余母液910L。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将910L的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积310L，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉16.04kg,含量为92.7％，母液405L,效价为33937μg/mL，同时母液可以进行下一步套用。
发酵液至萃取前收率＝11000L*6380/60000L*1230＝95.09％。
萃取后收率＝(32650*96.9％+16040*92.7％+33937*405*10-3)/(6380*11000*10-3)＝85.85％。
总收率＝95.09％*85.85％＝81.63％。
粉剂/母液比＝(32650*96.9％+16040*92.7％)：33937*405*10-3＝46506.93：13744.485＝3.38：1
对比例1：
采用1982年日本专利59106478所公开的提取方法，提取步骤包括：GA4发酵液前期处理、赤霉素萃取、蒸出大部分乙酸乙酯、加入正丙醇、再加入N-甲基苄胺、形成N-甲基苄胺盐沉淀、将铵盐分离后用甲醇水溶液溶解、加酸使GA4结晶析出等近二十个步骤。具体步骤如下：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1280μg/mL，用碱调节pH＝6.8，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝6.8左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数4倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离
将反渗透浓缩液按1:0.8加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.2，并加入0.15％的“1231”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1590L效价为7589μg/mL。
6)减压浓缩
取2.0L效价为7589μg/mL的萃取轻液，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在52℃左右，真空度控制在-0.081MPa，浓缩至体积为500mL后转入至烧杯中。
7)脱水、脱色
在烧杯中，加入2％(质量和体积比)即10g的无水氯化钙,搅拌20min后加入0.5％即1g的活性炭,再继续搅拌10min后，过滤。过滤得到487ml的料液。
8)减压浓缩，蒸干乙酯
将脱水脱色后的料液再次置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在55℃左右，真空度控制在-0.081MPa，至乙酸乙酯全部蒸出后迅速转入200ml的正丙醇，继续保持该温度浓缩10min。
9)铵盐沉淀
将上一步处理好的料液装入烧杯中，待料液冷却后，使用N-甲基苄胺缓慢调节pH至7.0，边调边搅拌。调节完后，将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在5℃,结晶4个小时。
10)铵盐过滤
将上一步的铵盐进行铵盐过滤得到铵盐和220ml铵盐母液，其中铵盐母液效价为16121ug/ml。
11)铵盐溶解
用甲醇和水配制体积比为(1:3)的溶剂，待溶剂配制好以后，缓慢加入装有铵盐的烧杯中，边加边搅拌，直至铵盐完全溶解。
12)调节pH、析出精粉
待铵盐完全溶解后，用盐酸调节pH,边加边搅拌，直至溶液pH＝3.0,缓慢搅拌2个小时，直至精粉全部析出。
13)过滤、干燥、计算收率
将上一步所得到的精粉进行过滤，得到精粉和滤液，精粉放置在真空干燥箱中，进行干燥，干燥后称重得精粉重量为8.27g,含量为88.4％(计算收率时铵盐母液也算入其中，但铵盐母液并不能套用)。
发酵液至萃取前收率＝1590L*7589/10000L*1280＝94.27％
萃取后收率＝(8.27*88.4％+16121*220*10-6)/(7589*2000*10-6)＝71.53％。
总收率＝94.27％*71.53％＝67.43％。
粉剂/母液比＝8.27*88.4％：16121*220*10-6＝7.31068：3.54662＝2.06：1
对比例2：
1)发酵料液前期处理
将已发酵好的赤霉素GA4料液10000L，测其发酵液放罐效价为1280μg/mL，用酸调节pH＝5.3，后将已调节好的发酵液作为板框过滤的进料液。
2)板框过滤
先将已调节好pH的赤霉素GA4发酵液经过板框过滤得板框滤液，再用已预先调至pH＝5.3左右的顶洗水，顶洗板框滤饼得水洗滤液，将板框滤液和水洗滤液合并，作为超滤膜的进料液。
3)超滤：操作步骤与工艺控制同实施例1。即：
板框滤液经过分子截留量为5-8万的卷式超滤膜，除去滤液中分子量为5-8万及以上的大分子物质，超滤液作为反渗透浓缩的进料液。
4)反渗透浓缩：操作步骤与工艺控制同实施例1。即：
超滤液进入反渗透卷式膜进行快速低倍浓缩，浓缩倍数4倍，得到反渗透浓缩液。
5)萃取分离：操作步骤与工艺控制同实施例1。即：
将反渗透浓缩液按1:0.8加入乙酸乙酯，开启搅拌，调节pH＝4.4，并加入0.15％的“1231”破乳剂，搅拌，并经离心机分离后得萃取轻液1580L效价为2880μg/mL。
6)减压浓缩：操作步骤与工艺控制同实施例1。即：
取2.0L效价为2880μg/mL的萃取轻液，置于旋转蒸发仪中，进行减压浓缩，减压浓缩中温度控制在52℃左右，真空度控制在-0.081MPa，浓缩至体积为60mL效价为95600ug/mL后迅速转入至烧杯中。
7)结晶、过滤、干燥：操作步骤与工艺控制同实施例1。即：
将烧杯置于冷水中，冷水温度控制在5℃，加入搅拌子在搅拌台上开启缓慢搅拌，至结晶3个小时。待结晶完全后，进行过滤操作，过滤使用真空抽滤，过滤快结束时缓慢加入少量乙酸乙酯冲洗结晶粉，加入量约为母液体积的0.5倍，即加入30mL乙酸乙酯进行冲洗，待结晶粉冲洗干净后，取出放置在真空干燥箱中进行干燥。干燥完成后，称量后得结晶粉质量为1.78g,含量为81.5％，剩余母液86mL。
8)母液进行二次结晶,计算总收率
将86mL的一次结晶母液继续进行减压浓缩，浓缩至体积35mL，继续重复以上操作进行结晶、过滤、干燥，得到结晶粉1.26g,含量为78.8％，母液50.5mL,效价为35680μg/mL。
发酵液至萃取前收率＝1580L*2880/10000L*1280＝35.55％。
萃取后收率＝(1.78*81.5％+1.26*78.8％+35680*50.5*10-6)/(2880*2000*10-6)＝73.71％。
总收率＝35.55％*73.71％＝26.20％。
粉剂/母液比＝(1.78*81.5％+1.26*78.8％)：35680*50.5*10-6＝2.44358：1.80184＝1.36：1
实施例与对比例的比较分析：
(1)由上可知：实施例1-5与对比例1相比，实施例1-5的提取流程不到十个步骤，减压浓缩料液效价为10-15万μg/mL，得到的赤霉素GA4结晶粉含量能达到92.7％至98.0％，萃取后提取收率可达到80.31％至88.96％，总收率达到72.32％至84.95％，粉剂与母液比值在2.64-4.56：1；而对比例1的提取流程超过十五个步骤，得到的赤霉素GA4结晶粉含量为88.4％，萃取后收率只有71.53％，总收率只有67.43％，粉母比为2.06：1。说明本发明所公开的一种赤霉素GA4的提取方法相比于原有的提取方法(日本专利59106478所公开的提取方法)，具有工艺合理简便，提取效率大幅提高，粉剂母液比值高，得到的结晶粉GA4含量高的显著效果。
(2)由上可知：实施例1-5与对比例2相比，提取工艺主要差别在于第一步的发酵料液前期处理时调节pH的不同，实施例1-5调节pH为6.05-7.2，而对比例2调节pH为5.3。但实施例1-5发酵液至萃取前收率为88.72％至95.49％，萃取后提取收率为80.31％至88.96％，总收率为72.32％至84.95％，粉母比在2.64-4.56：1；而对比例2的发酵液至萃取前收率为35.53％，萃取后提取收率为73.71％，总收率为26.20％，粉母比在1.36：1。其主要原因可能是：调pH 4.8的对比例2，因其GA4在水中的溶解度较小又未形成盐态，造成有较多的GA4仍以酸态形式残留在菌丝内，并未游离释放到滤液中，从而造成萃取前收率(35.53％)和总收率(26.20％)均严重偏低；而萃取后的提取收率也相对偏低的原因是因为：萃取轻液中GA4含量少(2880μg/mL)，而其他杂质相对较多，当减压浓缩至10万μg/mL左右的浓缩液时，所需浓缩倍数大，杂质更富集，受杂质影响造成萃取后的提取收率也相对偏低(73.71％)。由此说明发酵料液前期处理时，用碱调节pH 6.0-7.5，使GA4由酸态充分转成盐态的工艺步骤至关重要，用碱调节pH6.8为最优选(实施例1)。
(3)由上可知：实施例1-5只使用了一种乙酸乙酯有机溶剂，且其中的乙酸乙酯还进行了溶剂回收，实现了循环使用；而对比例1的提取过程中，除乙酸乙酯外，还用到了N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等价格昂贵的多种化学试剂。本发明所公开的一种赤霉素GA4的提取方法，摒弃了N-甲基苄胺、正丙醇、甲醇等价格昂贵的多种化学试剂使用，不仅消除了有毒有害的N-甲基苄胺和正丙醇、甲醇对操作人员的身心健康影响，保证了操作人员的身心健康，而且显著地降低了提取成本。
(4)由上可知：实施例1-5在提取过程中不需脱色，结晶分离后的母液既可以继续进行减压浓缩，也可以与下一批的轻液混合进行浓缩；而对比例1的提取过程不仅步骤复杂、所用试剂众多、电能消耗大，且还产生了无水氯化钙和活性炭等废渣，以及铵盐母液、甲醇水溶液等废液，加大了环保处理工作量。本发明所公开的一种赤霉素GA4的提取方法，通过母液的连续处理和重复使用，不仅可以加快生产效率，而且显著减少了生产废液的产生与排放，有效地保护生态环境。
(5)由上可知：实施例1-5中得到的赤霉素GA4结晶粉含量最高的是实施例1(一次结晶为98％/二次结晶为93.4％)，萃取后提取收率最高的也是实施例1(88.96％)，粉剂/母液比为4.56：1，实施例1是本发明的较佳实施例。从实施例1中可得出本发明较优选的提取工艺参数为：步骤S1的用碱调节pH宜6.8±0.2，步骤S3超滤浓缩倍数宜60±5倍，步骤S4反渗透浓缩倍数宜4±0.5倍，步骤S5萃取分离宜按1:0.8±0.1加入乙酸乙酯并调节pH4.4±0.2，步骤S6减压浓缩中温度宜控制在52±2℃，步骤S7中冷水温度宜控制在5±2℃。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。
Claims (7)
1.一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于包括下列步骤：
S1：发酵料液前期处理：发酵料液用碱调节pH；所述的pH为6.0-7.5；
S2：板框过滤：将调节pH后的发酵料液进行板框过滤，收集滤液；
S3：超滤：将板框滤液进行超滤，收集超滤液；所述的超滤，其超滤膜的分子截留量为5-8万；
S4：反渗透浓缩：将超滤液进行反渗透浓缩，收集反渗透浓缩液；
S5：萃取：反渗透浓缩液调节pH后加入破乳剂和乙酸乙酯进行萃取分离，转入有机相，收集萃取轻液；所述的萃取中调节pH为4.0-5.0；控制萃取剂和反渗透浓缩液的体积比为0.6-1:1；
S6：减压浓缩：将萃取轻液进行减压浓缩，控制浓缩液效价在10-15万μg/mL；
S7：结晶：将减压浓缩液转入结晶罐，开启搅拌，进行结晶；
S8：过滤、洗涤、干燥：浓缩液结晶完全后，进行过滤操作，在过滤过程中加入少量的乙酸乙酯进行洗涤，洗涤完成后，得到的GA4结晶粉进行干燥；
S9：过滤和洗涤后的母液继续进行减压浓缩，或者与下一批GA4萃取轻液进行减压浓缩后继续结晶，或者做成乳油产品。
2.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S2中所述的板框过滤设备是板框压滤机。
3.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S4中所述的反渗透浓缩倍数为3-5倍。
4.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S5中所述的破乳剂的加入量，以重量百分比计为0.1-0.3％。
5.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S6中所述的减压浓缩中温度控制在40-50℃，真空度控制在-0.07至-0.10MPa。
6.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S7中所述的结晶时间控制在2-5个小时。
7.根据权利要求1所述的一种赤霉素GA4的提取方法，其特征在于：步骤S8中所述的干燥设备为真空干燥箱或双锥真空干燥器。
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