CN114605357A - 一种紫杉醇-油酸小分子的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种紫杉醇‑油酸小分子的分离纯化方法，该方法纯化效率高，并保证化合物I在洗脱过程中的稳定性，成功获得纯度98％以上的化合物I，使其能够通过工业生产的方法制备得到满足质量要求的化合物I。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种紫杉醇-油酸小分子的分离纯化方法。
背景技术
紫杉醇(Paclitaxel,PTX)前体药物也被广泛研究用来克服紫杉醇的成药性差问题。其中，关于紫杉醇的不饱和脂肪酸前药的研究取得了很大的进展。例如：紫杉醇-二十二碳六烯酸前药(PTX-DHA)已经进入了临床III期研究。然而，最新的临床结果显示，与现存的化疗药物相比，PTX-DHA的疗效并没有展现出优势。分析PTX-DHA的结构，研究发现紫杉醇和二十二碳六烯酸是通过酯键相连的，这可能会导致紫杉醇很难从前药上断裂下来，进而导致其疗效不佳。
发明专利CN105833284B公开了一系列紫杉醇-油酸前药，紫杉醇和油酸是通过一系列氧化还原敏感的化学连接臂连接在一起，这些氧化还原敏感的化学连接臂在肿瘤细胞内的高氧化还原环境中能快速断裂，释放出药物。这些小分子疏水性前药能自组装形成均匀的前药纳米粒。在这些小分子前药纳米系统中，由于前药自身既作为载体材料又作为被包载的药物，其载药量非常高，超过了 50％。
化合物I作为一种紫杉醇-油酸前药，化合物I中的杂质可能来自API本身的降解和制造过程，包括化学合成。工艺杂质包括未反应的原材料、原材料中所含的杂质的化学衍生物、合成副产物和降解产物。故我们需要通过了解相关杂质的化学结构和合成途径，及通过鉴定终产品的杂质和确定终产品的杂质的量来大大加强工艺杂质的控制。
发明专利CN105617394A中公开了油酸-紫杉醇偶联物的纯化方法，粗品经过滤除去沉淀，滤液减压真空干燥，以少量溶剂溶解后经薄层分析法分离，所得产物条带用提取溶剂充分溶解后，抽滤，滤液经室温下氮气吹干或减压真空干燥，产物产率为63％。
研究发现，现有化合物I未纯化的样品为酒红色，其目标物含量80％左右，其中主要含杂质A 1.5％～2％，降解杂质B及其他工艺残留的有机盐，小分子物料，色素等物质。其中杂质A为化合物I的顺反异构体，结构差异小，且粗品I 在溶液中易降解产生B，故很难用常规的重结晶或常规柱层析方法去除。
发明内容
本发明所要解决的关键技术问题是克服现有技术的不足，提供一种紫杉醇- 油酸小分子I的分离纯化方法，所述方法包含如下步骤：
将化合物I粗品配成样品溶液通过柱层析分离纯化，所述流动相包括A：酸水溶液，B：有机溶剂A。
作为本发明的优选技术方法：将化合物I粗品溶于稀释液中，配制成样品溶液，浓度优选为0.1～0.5mg/mL。
作为本发明的优选技术方案，所述的稀释液选自四氢呋喃、乙腈中的一种，优选乙腈。
作为本发明的优选技术方案，所述酸水溶液中的酸选自磷酸、乙酸或三氟乙酸中的一种，优选为磷酸。
作为本发明的优选技术方案，所述酸水溶液的体积浓度为0.05％～0.2％。
作为本发明的优选技术方案，所述有机溶剂A选自甲醇、乙醇或乙腈中的一种，优选乙腈。
作为本发明的优选技术方案，所述流动相A、B的体积比为0:100～20:80，优选10:90。
作为本发明的优选技术方案，层析柱选用C18填料，层析柱规格：直径 30mm×长250mm。
作为本发明的优选技术方案，所述柱层析分离后采用等度洗脱收集层析液。
作为本发明的优选技术方案，还包括将层析液减压浓缩并用有机溶剂B萃取，合并有机相，再过滤干燥得到目标产物。
进一步，所述的有机溶剂B选自二氯甲烷、乙酸乙酯或2-甲基四氢呋喃中的一种，优选二氯甲烷。
再进一步，较为具体的，本发明所述方法包括如下步骤：
1)取化合物I的粗品溶液，溶于稀释液中，配制成浓度为0.1～0.5mg/mL的样品溶液；
2)将样品溶液通过制备柱经流动相等度洗脱，并收集化合物I的层析液；
3)将所述的层析液在25～35℃减压蒸馏浓缩至溶液变浑浊，用有机溶剂萃取，分液合并有机相；
4)将合并后的有机相加入无水硫酸钠干燥过滤，滤液控制25～35℃减压蒸馏浓缩干，得固体化合物I。
本发明的有益效果：本发明本工艺解决了化合物I的较难纯化问题，该方法纯化效率高，并通过调整流动相体系，保证化合物I在洗脱过程中的稳定性，成功获得纯度高达98％以上的化合物I，使其能够通过工业生产的方法制备得到满足质量要求的化合物I。
附图说明
图1是实施例1中的0.1％磷酸水体系0.3mg/mL全分析图；
图2是实施例2中的0.1％三氟乙酸水体系0.3mg/mL全分析图；
图3是实施例3中的0.1％乙酸水体系0.3mg/mL全分析图；
图4是实施例4中的0.1％磷酸水体系0.1mg/mL全分析图；
图5是实施例5中的0.1％磷酸水体系0.5mg/mL全分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例用于理解本发明的方法和核心思想，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，进行任何可能的变化或替换，均属于本发明的保护范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件；未注明来源的试剂，通常为通过商业途径可购得的常规试剂。
实施例1
样品配置：取0.6g样品加入2mL乙腈溶解后用0.45um滤膜过滤，样品浓度约0.3mg/mL；进样：上述配制好的样品溶液全部通过仪器注入制备柱；设备： Waters自动纯化仪；制备柱：θ30mm×250mm；填料：纳微产C18，10um；流动相：流动相A 0.1％磷酸水，流动相B乙腈；色谱方法：采用90％的B相和 10％的A相等度洗脱90min，流速30mL/min,检测波长225nm；收集：主峰在46min 出峰，主峰出峰开始收集46min至54min的流出液，共计240mL溶液；收集液后处理：收集液控制30℃减压蒸馏浓缩至溶液变浑浊(约50mL左右)，转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取三次，每次30mL，分液合并有机相加入20g无水硫酸钠干燥过滤，滤液控制30℃减压蒸馏浓缩干，得固体0.32g，纯度98.1％。
制备峰收集后做全分析检测：载样量6g/L制备后的全分析图，制备过程中杂质分布曲线如图1所示，其中RRT＝1的曲线为主峰，其中RRT＝1.023的曲线为化合物I的杂质A，从制备后收集组分全分析的物质分布图看，该制备方法下，主峰和杂质A的交汇部分较少，收率较高。
实施例2
样品配置：取0.6g样品加入2mL乙腈溶解后用0.45um滤膜过滤，样品浓度约0.3mg/mL；进样：上述配制好的样品溶液全部通过仪器注入制备柱；设备： Waters自动纯化仪；制备柱：θ30mm×250mm；填料：纳微产C18，10um；流动相：流动相A 0.1％三氟乙酸水，流动相B乙腈；色谱方法：采用90％的B 相和10％的A相等度洗脱90min，流速30mL/min,检测波长225nm；收集：主峰在46min出峰，主峰出峰开始收集46min至54min的流出液，共计240mL溶液；收集液后处理：收集液控制30℃减压蒸馏浓缩干，得固体0.31g，纯度94.32％。
制备峰收集后做全分析检测：载样量6g/L制备后的全分析图，制备过程中杂质分布曲线如图2所示，其中RRT＝1的曲线为主峰，其中RRT＝1.023的曲线为化合物I的杂质A，0.1％的三氟乙酸体系水和乙腈体系的溶液直接浓缩干后，样品会变质，但是在制备液相的色谱系统中0.1％三氟乙酸水和0.1％的磷酸水体系，两种体系中杂质和主峰的分离情况基本相同。
实施例3
样品配置：取0.6g样品加入2mL乙腈溶解后用0.45um滤膜过滤，样品浓度约0.3mg/mL；进样：上述配制好的样品溶液全部通过仪器注入制备柱；设备： Waters自动纯化仪；制备柱：θ30mm×250mm；填料：纳微产C18，10um；流动相：流动相A 0.1％乙酸水，流动相B乙腈；色谱方法：采用90％的B相和 10％的A相等度洗脱90min，流速30mL/min,检测波长225nm；收集：主峰在46min 出峰，主峰出峰开始收集46min至54min的流出液，共计240mL溶液；收集液后处理：收集液控制30℃减压蒸馏浓缩干，得固体0.33g，纯度95.26％。
制备峰收集后做全分析检测：载样量6g/L制备后的全分析图，制备过程中杂质分布曲线如图3所示，其中RRT＝1的曲线为主峰，其中RRT＝1.023的曲线为化合物I的杂质A，在制备液相的色谱系统中0.1％乙酸水和0.1％的磷酸水体系，两种体系中杂质和主峰的分离情况基本相同，但是后处理过程中样品会变质。
实施例4
样品配置：取0.2g样品加入2mL乙腈溶解后用0.45um滤膜过滤，样品浓度约0.1mg/mL；进样：上述配制好的样品溶液全部通过仪器注入制备柱；设备： Waters自动纯化仪；制备柱：θ30mm×250mm；填料：纳微产C18，10um；流动相：流动相A 0.1％磷酸水，流动相B乙腈；色谱方法：采用90％的B相和 10％的A相等度洗脱90min，流速30mL/min，检测波长225nm；收集：主峰在 46min出峰，主峰出峰开始收集49min至54min的流出液，共计160mL溶液；收集液后处理：收集液控制30℃减压蒸馏浓缩至溶液变浑浊(约50mL左右)，转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取三次，每次30mL，分液合并有机相加入20g 无水硫酸钠干燥过滤，滤液控制30℃减压蒸馏浓缩干，得固体0.15g，纯度98.24％。
制备峰收集后做全分析检测：载样量6g/L制备后的全分析图，制备过程中杂质分布曲线如图4所示，其中RRT＝1的曲线为主峰，其中RRT＝1.023的曲线为化合物I的杂质A，减小上样量之后，主峰和后杂分离度较好，但是上样量太低，导致制备纯化效率降低，溶剂使用成本变大。
实施例5
样品配置：取1.0g样品加入2mL乙腈溶解后用0.45um滤膜过滤，样品浓度约0.5mg/mL
进样：上述配制好的样品溶液全部通过仪器注入制备柱；设备：Waters自动纯化仪；制备柱：θ30mm×250mm，填料：纳微产C18，10um；流动相：流动相A 0.1％磷酸水，流动相B乙腈；色谱方法：采用90％的B相和10％的A相等度洗脱90min，流速30mL/min，检测波长225nm；收集：主峰在44min出峰，主峰出峰开始收集44min至54min的流出液，共计280mL溶液；收集液后处理：收集液控制30℃减压蒸馏浓缩至溶液变浑浊(约50mL左右)，转移至分液漏斗中，用二氯甲烷萃取三次，每次30mL，分液合并有机相加入20g无水硫酸钠干燥过滤，滤液控制30℃减压蒸馏浓缩干，得固体0.44g，纯度98.34％。
制备峰收集后做全分析检测：载样量6g/L制备后的全分析图，制备过程中杂质分布曲线如图5所示，其中RRT＝1的曲线为主峰，其中RRT＝1.023的曲线为化合物I的杂质A，增大上样量以后，主峰和后杂交汇部分很多，导致合格部分的主峰收率较低。
Claims (12)
1.一种紫杉醇-油酸小分子I的分离纯化方法，其特征在于：所述方法包含如下步骤：
将化合物I粗品配成样品溶液通过柱层析分离纯化，所述流动相包括A：酸水溶液，B：有机溶剂A；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将化合物I粗品溶于稀释液中，配制成样品溶液，进一步浓度优选为0.1～0.5mg/mL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的稀释液选自四氢呋喃、乙腈中的一种，优选乙腈。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酸水溶液中的酸选自磷酸、乙酸或三氟乙酸中的一种，优选为磷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酸水溶液的体积浓度为0.05％～0.2％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂A选自甲醇、乙醇或乙腈中的一种，优选乙腈。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A、B的体积比为0:100～20:80，优选10:90。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：层析柱选用C18填料，层析柱规格：直径30mm×长250mm。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述柱层析分离后采用等度洗脱收集层析液。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括将层析液减压浓缩并用有机溶剂B萃取，合并有机相，再过滤干燥得到目标产物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂B选自二氯甲烷、乙酸乙酯或2-甲基四氢呋喃中的一种，优选二氯甲烷。
12.如权利要求1～11之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)取化合物I的粗品溶液，溶于稀释液中，配制成浓度为0.1～0.5mg/mL的样品溶液；
2)将样品溶液通过制备柱经流动相等度洗脱，并收集化合物I的层析液；
3)将所述的层析液在25～35℃减压蒸馏浓缩至溶液变浑浊，用有机溶剂B萃取，分液合并有机相；
4)将合并后的有机相加入无水硫酸钠干燥过滤，滤液控制25～35℃减压蒸馏浓缩干，得固体化合物I。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| CONG LUO 等: ""Facile Fabrication of Tumor Redox-Sensitive Nanoassemblies of Small-Molecule Oleate Prodrug as Potent Chemotherapeutic Nanomedicine"", SMALL, vol. 12, no. 46, 12 December 2016 (2016-12-12), pages 6353 - 6362 * |
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