CN114591946A - 小麦醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明属于小麦分子育种领域，具体涉及一个与小麦籽粒中与醇溶蛋白含量相关位点qGLI‑6DS的分子遗传标记。发明人在6DS染色体156.8‑337.1Mb处检测到一个与总醇溶蛋白含量以及醇溶蛋白α、γ和ω各个组分含量相关的主效QTL qGLI‑6DS，可解释5.44‑8.55%表型变异。进一步定位分析后，标记AX‑109331772序列的第36处碱基存在一个C/T的等位基因突变，对该位点的多态性基因分型分析结果表明，当该位点处碱基为C时，小麦籽粒中醇溶蛋白及其组分含量较高，可有效筛选基因型为CC的高醇溶蛋白含量的小麦品种，从而可为优质小麦新品种培育提高技术支持。
Description
技术领域
本发明属于小麦分子育种领域，具体涉及一个与小麦籽粒中与醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子遗传标记。
背景技术
小麦作为世界上分布最广、消费最多的粮食作物，具有悠久的栽培历史，小麦的种植面积仅次于水稻，是我国第二大粮食作物。小麦的品质主要指营养品质与加工品质两个方面，营养品质主要指蛋白质、氨基酸、脂类、糖类等营养物质的成分及比例等。加工品质主要是针对面粉制作加工方面的品质性状，其中面筋蛋白是影响小麦品质的重要因素。
研究表明，面筋蛋白包括醇溶蛋白和麦谷蛋白，麦谷蛋白占小麦面筋蛋白的35%~45%，赋予面团弹性；醇溶蛋白占小麦面筋蛋白的50%~60% ，赋予面团延展性。而醇溶蛋白依据其在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）中呈现的不同迁移率又可分为α、β、γ和ω四类醇溶蛋白。通过对它们的氨基酸序列分析，α和β类醇溶蛋白存在结构同源性，因此又通常将二者统称为α类醇溶蛋白。进一步对醇溶蛋白的氨基酸组成分析显示，其富含疏水性氨基酸，缺乏亲水性氨基酸，由单肽链组成，主要是以单体的形式存在。总体上，小麦中醇溶蛋白和麦谷蛋白含量、质量以及组成，决定了面粉的伸展性、弹性、粘性等方面的品质。
近年来，随着分子标记育种技术的快速发展，以及以提高小麦品质为主要育种目标的技术目标情况下，充分发掘与醇溶蛋白及其组分含量相关性状的遗传位点，可为小麦优质育种工作奠定良好的理论支撑和技术支持。
发明内容
在对小麦醇溶蛋白及其组分含量进行QTL（Quantitative trait locus）定位的基础上，本申请目的在于提供一个与小麦籽粒中醇溶蛋白含量相关的遗传标记，从而为小麦籽粒中醇溶蛋白调控的分子机制研究和小麦新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
小麦醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子标记，将该分子遗传标记名称命名为：AX-109331772，其位于6D染色体短臂上，核苷酸序列为：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACA[C/T]GATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC；
在该序列的第36位碱基存在一个C/T的等位基因的突变；
当第36位碱基为C时，为高醇溶蛋白含量的CC基因型，所述醇溶蛋白包括：ω-醇溶蛋白、α-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白，其碱基序列为SEQ ID No.1所示，具体如下（71bp）：TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACACGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC；
当第36位碱基为T时，为低醇溶蛋白含量的TT基因型，其碱基序列为SEQ ID No.2所示，具体如下：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACATGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC。
依据该遗传标记AX-109331772的多态性（核苷酸多态性）所开发的KASP分子标记，可有效用于小麦籽粒面筋品质的快速预测；
所述KASP分子标记为一组PCR检测用引物组，具体KASP标记引物序列设计为：
AX-109331772F1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCGCGCACTGTATGTATACACAC-3’（“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT” 部分序列为FAM荧光标签），
AX-109331772F2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCGCGCACTGTATGTATACACAT-3’，（“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT” 部分序列为HEX荧光标签）
AX-109331772R：5’- GGAGATACATATATACGAACATGCGATGGC-3’。
所述KASP分子标记在小麦育种或者小麦籽粒中醇溶蛋白及其组分含量检测中的应用，通过检判定测基因型为CC或者为TT来检测判定小麦籽粒中醇溶蛋白含量高低及其组分差别，从而进一步用于小麦育种；具体应用时：
AX-109331772F1与AX-109331772R联合时，用于鉴定筛选基因型为CC的高醇溶蛋白组分含量小麦品种；
AX-109331772F2与AX-109331772R联合时，用于鉴定筛选基因型为TT的低醇溶蛋白组分含量小麦品种。
前期研究工作中，发明人构建了一个以漯珍一号为母本、郑育麦9987为父本的RIL群体。基于研究目的需要，发明人对该群体材料两年四个环境下所收获小麦籽粒中醇溶蛋白及其组分含量情况进行了详细测定，进一步结合SLAF测序技术构建的遗传连锁图谱对相关目的基因进行了初步的QTL定位分析。结果表明，共检测到30个QTL区间，其中在6DS染色体156.8-337.1Mb处检测到一个与总醇溶蛋白含量以及醇溶蛋白α、γ和ω各个组分含量相关的主效QTL，可解释5.44-8.55%表型变异，具有一定的应用前景。
基于上述结果，结合相关基因测序芯片，针对此区间附近的遗传标记AX-109331772（156.8Mb）开发设计了KASP分子标记，并进行了具体序列分析。结果表明，该标记序列的第36处碱基是一个C/T的等位基因突变，对该位点的多态性基因分型分析结果表明，当该位点处碱基为C时，小麦籽粒中醇溶蛋白及其组分含量较高，可有效筛选基因型为CC的高醇溶蛋白含量的小麦品种，从而可为小麦新品种培育奠定一定技术基础。
附图说明
图1为小麦醇溶蛋白及其组分BLUP值的QTL定位图；
图2为RIL群体中KASP标记AX-109331772基因分型图；彩色视图下，不同颜色表示不同等位基因型，红色荧光显示为CC基因型，蓝色荧光显示为TT基因型，绿色荧光显示为CT基因型，黑色为未加DNA的空白对照；
图3为AX-109331772不同基因型的醇溶蛋白及其组分含量的分布图；彩色视图下，橙色和蓝色分别表示CC和TT基因型的小麦材料中醇溶蛋白及其组分含量分布情况；
图4为 AX-109331772不同基因型的醇溶蛋白及其组分含量的显著型分布箱线图；彩色视图下，蓝色表示为TT基因型，橙色表示为CC基因型；*表示P<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
前期研究工作中，发明人以漯珍一号为母本、郑育麦9987为父本构建了一个RIL群体。在两年四环境下（2018-2019原阳（YY），2018-2019商丘（SQ），2019-2020原阳，2019-2020商丘），分别按照正常管理模式播种、管理、收获，利用脱粒机对RIL群体各个家系所收获小麦籽粒材料进行脱粒处理。测定时，分别称取100g籽粒样品，利用LM3100锤式实验粉碎磨进行全麦粉制备。对所制备全麦粉样品，利用多功能谷物近红外分析仪测定水分，利用高效反相液相色谱技术进行醇溶蛋白及其组分含量的测定与分析。
在相关测定结果基础上，本研究利用全基因复合区间作图法，结合两年四个环境下醇溶蛋白及其组分含量以及各个性状的BLUP值对目的基因进行了QTL定位，以期筛选与醇溶蛋白及其组分含量显著相关的潜在优良位点。
实施例1
如前所述，利用两年四个环境下醇溶蛋白及其组分含量以及各个性状的BLUP值，结合SLAF测序技术构建的遗传连锁图谱，利用全基因复合区间作图法进行了QTL定位分析。在阈值为-log10P=2.5情况下，共计检测到30个QTL（部分结果如图1所示）。其中，在6DS染色体156.8-337.1Mb处检测到一个与总醇溶蛋白以及醇溶蛋白α、γ和ω各个组分含量相关的主效QTL位点，解释了5.44-8.55%表型变异。
基于上述结果，结合基因芯片检测技术，在此QTL位点附近确定了一个遗传标记AX-109331772（156.8Mb），其核苷酸序列为：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACA[C/T]GATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC。
分析表明，在该序列的第36位碱基存在一个C/T的等位基因的突变，当第36位碱基为C时，将其简称为CC基因型，其碱基序列为SEQ ID No.1所示，具体如下（71bp）：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACACGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC；
当第36位碱基为T时，将其简称为TT基因型，其碱基序列为SEQ ID No.2所示，具体如下：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACATGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC。
实施例2
基于实施例1中筛选所确定的AX-109331772标记的核苷酸序列，基于KASP标记技术，发明人进一步设计了一组PCR检测用的引物组，结合实施例1所测定的RIL群体材料中普通小麦品种的基因分型分析结果，以及结合小麦籽粒的醇溶蛋白及其组分含量情况，发明人进行了进一步分析。具体实验过程简介如下。
（一）引物设计
基于KASP标记技术，针对AX-109331772序列，发明人设计了一组PCR检测用的引物组，具体如下：
AX-109331772F1：
5’- GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCGCGCACTGTATGTATACACAC-3’，
AX-109331772F2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCGCGCACTGTATGTATACACAT-3’，
AX-109331772R：5’- GGAGATACATATATACGAACATGCGATGGC-3’。
（二）基因分型检测
首先，将浓度均为10umol/L的3条引物与水按：12（AX-109331772F1）：12（AX-109331772F2）：30（AX-109331772R）：46（水）的体积比例，混合为Primer Mix；
然后，进行PCR反应；PCR反应时，10µl反应体系设计如下：
2×KASP Master Mix，5ul；
Primer Mix，1.4ul；
MgCl2，0.08ul；
DNA（100ng/ul），1ul；
水，2.52ul；
反应程序为：95℃、15min；95℃、20s，65℃~55℃、1min，10个循环（每个循环降低1℃）；95℃、20s，57℃、1min，30个循环；37℃ 1min；反应结束后进行基因分型分析。
利用上述反应体系与程序，对发明人所收集的196份RIL群体小麦材料进行基因分型。基因分型结果如图2所示。可以看出，所设计的引物组可以有效分离不同等位基因型的小麦籽粒。即：AX-109331772F1用于鉴定基因型为CC的小麦；AX-109331772F2用于鉴定基因型为TT的小麦。具体RIL群体中基因分型结果及醇溶蛋白组分含量结果如下表1所示。
表1 ，RIL群体中KASP标记基因分型及醇溶蛋白组分含量分布
续上表：
续上表：
续上表：
续上表：
注：表中“ID”表示重组自交系（RIL）群体材料编号，AU为106AU/mg的缩写。
对上表进行汇总统计归类，结果如下表2所示。
表2，小麦RIL群体材料中AX-109331772不同基因型间醇溶蛋白及其组分含量
分析可以看出，基因型为CC的小麦约占49%，基因型为TT的小麦为51%。基因型为CC的小麦中总醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白、α-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白含量平均值分别为62.46（106AU/mg）、11.70（106AU/mg）、31.52（106AU/mg）和19.24（106AU/mg）；基因型为TT的小麦中总醇溶蛋白及其组分含量平均值分别为58.80（106AU/mg）、10.98（106AU/mg）、29.75（106AU/mg）和18.07（106AU/mg）。且两种不同基因型间总醇溶蛋白含量以及具体醇溶蛋白组分含量之间存在显著性差异。
综合上述结果，可以认为：基因型为CC的小麦中总醇溶蛋白含量及各醇溶蛋白组分（ω-醇溶蛋白、α-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白）含量显著高于基因型为TT的小麦，基因型CC是增加小麦醇溶蛋白含量及各醇溶蛋白组分含量的优异等位基因型。也即：
针对AX-109331772标记，当第36位碱基为C时，CC基因型为高醇溶蛋白含量的基因型；当第36位碱基为T时，TT基因型为低醇溶蛋白含量基因型。基于这一结果，可为小麦分子标记辅助育种、或者为小麦籽粒中醇溶蛋白及醇溶蛋白组分含量高低的检测判定奠定一定理论基础和技术基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 小麦醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子标记
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
tgctacgcgt acaccgcgca ctgtatgtat acacacgatt agccatcgca tgttcgtata 60
tatgtatctc c 71
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 2
tgctacgcgt acaccgcgca ctgtatgtat acacatgatt agccatcgca tgttcgtata 60
tatgtatctc c 71
Claims (3)
1.小麦醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子标记，其特征在于，该分子遗传标记名称为：AX-109331772，其位于6D染色体短臂上， 核苷酸序列为：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACA[C/T]GATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC；
在该序列的第36位碱基存在一个C/T的等位基因的突变；
所述醇溶蛋白包括：ω-醇溶蛋白、α-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白；
当第36位碱基为C时，为高醇溶蛋白含量的CC基因型，其碱基序列为SEQ ID No.1所示，具体如下：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACACGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC；
当第36位碱基为T时，为低醇溶蛋白含量的TT基因型，其碱基序列为SEQ ID No.2所示，具体如下：
TGCTACGCGTACACCGCGCACTGTATGTATACACATGATTAGCCATCGCATGTTCGTATATATGTATCTCC。
2.针对权利要求1所述小麦醇溶蛋白含量相关位点qGLI-6DS的分子标记所开发的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记为一组PCR检测用引物组，具体KASP标记引物序列设计为：
AX-109331772F1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCGCGCACTGTATGTATACACAC-3’，
AX-109331772F2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCGCGCACTGTATGTATACACAT-3’，
AX-109331772R：5’- GGAGATACATATATACGAACATGCGATGGC-3’。
3.权利要求2所述KASP分子标记在小麦育种或者小麦籽粒中醇溶蛋白及其组分含量检测中的应用，其特征在于，通过检判定测基因型为CC或者为TT来检测判定小麦籽粒中醇溶蛋白含量高低及其组分差别进行应用；具体应用时：
AX-109331772F1与AX-109331772R联合时，用于鉴定筛选基因型为CC的高醇溶蛋白组分含量小麦品种；
AX-109331772F2与AX-109331772R联合时，用于鉴定筛选基因型为TT的低醇溶蛋白组分含量小麦品种。
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2022
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