CN114585397A - 通过β-消除接头而交联的水凝胶的蒸汽灭菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种对通过β‑消除接头而交联的水凝胶进行蒸汽灭菌的方法，该方法没有显著降解的缺点。

Description

通过β-消除接头而交联的水凝胶的蒸汽灭菌
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月7日提交的美国临时申请第62/883,982号的优先权，其内容通过引用将其全文纳入本文。
发明背景
可降解聚合物生物材料的灭菌是一个巨大的挑战。任何用于注射或植入的生物材料都必须以无菌形式提供，以获得监管部门的批准并安全投入临床应用。植入医疗器械所引起的感染仍是健康护理中的一个严重问题。然而，由于生物材料所固有的复杂性，几乎不可能预测灭菌方法的结果并据此制定出一套用于实现充分无菌的通用指南。用于水凝胶的现代灭菌方法的综述已发表(Galante等人,“Sterilization of hydrogels forbiomedical applications:a review(生物医学应用水凝胶的灭菌：综述)”,J.BiomedicalMaterials Res B:App Biomaterials(J.生物医学材料研究报告B:应用生物材料)(2018)106B:2472-92)。
在水凝胶灭菌的情况下，无论是聚合物主链还是控制降解的不稳定交联亦或这两者双方都会受到常用灭菌方法的不利影响。尽管有时能在PCT公开WO2011/05140中披露的保护性溶剂的存在下使用电离伽马辐射对水凝胶进行灭菌，显著的化学降解始终成为问题，并增加了再现性问题和毒理学问题。使用高温可加速化学反应并例如通过加速酯键水解使水凝胶降解。
美国专利9,649,385公开了通过包含β-消除接头的基团而交联的水凝胶的制备。这些凝胶的降解由介质的pH值来控制，并主要由接头中所存在的一个或多个吸电子调节剂基团的性质来控制(Santi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国自然科学院学报)(2012)109:6211-6)。然而，这种水凝胶的灭菌通常使用无菌制造技术、例如2019年1月31日提交的PCT申请PCT/US2019/016090中所披露的无菌制造技术来进行。然而，在多步骤制造过程中保持无菌条件是一项挑战，对无菌过程的监管负担相当高，增加了大量费用。而本发明克服了这些缺点。
本申请中所引用的所有文献均通过引用并入本文。
发明内容
本发明涉及一种对通过β-消除接头而交联的水凝胶进行蒸汽灭菌的方法，该方法没有显著降解的缺点。该方法通过在非反应性缓冲液中提供水凝胶、并将缓冲后的水凝胶暴露于灭菌循环中足够长的时间以对水凝胶进行灭菌来实现的。缓冲液在最高灭菌温度下的pH值和时间经调整以将灭菌循环期间的交联接头切断减至最少。
附图说明
图1示出具有调节剂R1＝(N,N-二甲氨基磺酰基)的测试探针在不同缓冲液中以121℃下pH 6.2(-●-)、5.0(-■-)和4.0(-▲-)经八次连续高压灭菌循环(保持时间20分钟)后的切断。缓冲液、25℃下pH值和用于估算121℃下pH值的ΔpH/ΔT值为：HEPES，pH7.4，-0.014；乙酸盐，pH 5，-0.0002，以及柠檬酸盐，-0.0024。
图2示出氨基-水凝胶微球在不同缓冲液中经0次、1次、2次、3次或4次高压灭菌循环后的微观形态。
图3A～3C示出式2(R1＝(N,N-二甲氨基)磺酰基)的氨基-水凝胶微球在不同缓冲液中以pH 9.4经0～4次高压灭菌循环后的溶解度曲线。图3A：pH 4.0的柠檬酸盐；图3B：pH4.0的乙酸盐；以及图3C：pH 4.0的磷酸盐。tRG值纪录于表2。
图4示出(R1＝(N,N-二甲氨基)磺酰基)的氨基-水凝胶微球在不同缓冲液中以pH9.4经0～4次高压灭菌循环后游离胺基与PEG的比率。
图5示出β-消除接头在37℃～80℃间切断的阿伦尼乌斯图，其中，吸电子调节剂为吗啉代磺酰基。该图中的数据给出了线性关系ln(k)＝39.047–14077/T，其中k是每小时接头切断的速率常数，T是以°K为单位的反应温度。这些参数估算出活化能Ea＝117kJ/mol。
图6示出高压灭菌前后水凝胶微球的溶解度曲线。式1的水凝胶通过R1＝N,N-二甲基磺酰胺的预聚物A与预聚物B反应来制备，其中，这两种情况下PEG均为10-kDa四臂PEG。水凝胶微球样品的溶解度(n＝2)通过以下方式测定：将水凝胶微球样品置于pH 9.4的37℃硼酸盐缓冲液中，并采用BaCl2/I2/KI法来定期测定已溶解的PEG。溶解度曲线的分析表明，高压灭菌前tRG＝12.0±0.7小时，高压灭菌后tRG＝11.9±0.7小时。高压灭菌水凝胶微球的无菌性测试显示出没有可检测的生长。
发明的实施方式
已经发现，通过将水凝胶提供到非反应性缓冲液中、并将缓冲后的水凝胶暴露于灭菌循环中足够长的时间以对水凝胶进行灭菌，能够实现对通过β-消除接头而交联的水凝胶的蒸汽灭菌。本发明人发现，通过控制最高灭菌温度下的pH值和时间，可将灭菌循环期间的交联接头切断减至最少。
在某些实施方式中，最高灭菌温度下的缓冲液pH值在2～5、或3～4之间。在某些实施方式中，非反应性缓冲液为柠檬酸盐、磷酸盐或乙酸盐，优选磷酸盐或乙酸盐。在某些实施方式中，最高灭菌温度为121℃，且最高温度下的时间小于1小时，但这些参数可根据需要来调整以根据本发明的方法实现令人满意的灭菌。在特定实施方式中，缓冲液为pH值3～4的乙酸盐或磷酸盐。
通过β-消除接头而交联并包含用于后续衍生化的活性胺基团的PEG水凝胶的通式结构如下所示。水凝胶如下所示由两种“预聚物”聚合而成。
Figure GDA0003620875210000041
在式1或式2的化合物的一些实施方式中，R1为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代。
在一些实施方式中，R1为CN或SO2R3，其中R3为H或任选取代的烷基；芳基或芳烷基，每个均任选取代；杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环。在一些实施方式中，R1为CN；SO2Me；SO2NMe2；SO2N(CH2CH2)2X或SO2(Ph-R10)，其中X为不存在、O或CH-R10，R10为H、烷基、烷氧基、NO2或卤素。
应当理解，术语“烷基”包括含1～20个、1～12个、1～8个、1～6个或1～4个碳原子的线性、支链或环状饱和烃基团。在一些实施方式中，烷基为直链或支链。直链或支链烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。在一些实施方式中，烷基为环状。环状烷基的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基等。
应当理解，术语“烷氧基”包括与氧结合的烷基，包括：甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基等。
应当理解，术语“烯基”包括具有碳-碳双键的含2～20个、2～12个、2～8个、2～6个或2～4个碳原子的非芳香不饱和烃。
应当理解，术语“炔基”包括具有碳-碳三键的含2～20个、2～12个、2～8个、2～6个或2～4个碳原子的非芳香不饱和烃。
应当理解，术语“芳基”包括含6～18个、优选6～10个碳的芳族烃基，包括诸如苯基、萘基和蒽基的基团。术语“杂芳基”包括含有至少一个N、O或S原子的含3～15个碳的芳环，优选含有至少一个N、O或S原子的含3～7个碳的芳环，包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等。
在某些情况下，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可通过烷基键与分子的其余部分偶联。在这些情况下，取代基会被称为烯基烷基、炔基烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，表明亚烷基部分位于烯基、炔基、芳基或杂芳基部分与偶联于烯基、炔基、芳基或杂芳基的分子之间。
应当理解，术语“卤素”或“卤”包括溴、氟、氯和碘。
应当理解，术语“杂环”或“杂环基”是指含有至少一个N、O或S原子的3～15元芳族环或非芳族环。其例子包括但不限于：哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷和四氢呋喃基，以及上述为术语“杂芳基”所提供的那些示例性基团。在一些实施方式中，杂环或杂环基为非芳族。在一些实施方式中，杂环或杂环基为芳族。
应当理解，除非另有规定，“任选取代”是指基团可以未取代也可以被一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)相同或不同取代基取代。取代基的例子包括但不限于：烷基、烯基、炔基、卤素、CN、ORaa、SRaa、NRaaRbb、NO2、-C＝NH(ORaa)、-C(O)Raa、-OC(O)Raa、-C(O)ORaa、-C(O)NRaaRbb、-OC(O)NRaaRbb、-NRaaC(O)Rbb、-NRaaC(O)ORbb、-S(O)Raa、-S(O)2Raa、-NRaaS(O)Rbb、-C(O)NRaaS(O)Rbb、-NRaaS(O)2Rbb、-C(O)NRaaS(O)2Rbb、-S(O)NRaaRbb,-S(O)2NRaaRbb、-P(O)(ORaa)(ORbb)、杂环基、杂芳基或芳基，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、杂芳基和芳基均各自独立地被Rcc任选取代，其中，
Raa和Rbb各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、杂环基、杂芳基或芳基，或
Raa和Rbb与它们所连接的氮原子一起形成杂环基，其被烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷氧基或-CN任选取代，其中：
每个Rcc均独立地为烷基、烯基、炔基、卤素、杂环基、杂芳基、芳基、-CN或-NO2。
对于本文所用，除非另有明确指示，否则术语“一个”、“一种”(“a”、“an”)等指一个或多个。
包含可生物降解的β-消除接头的水凝胶的制备已公开于现有技术、例如美国专利9,649,385中，进一步包含通过使用赖氨酸间隔子而引入的可官能化胺基的水凝胶则已公开于例如2019年1月31日提交的PCT申请PCT/US2019/016090和2019年4月5日提交的美国临时专利申请62/830,280中。β-消除接头处的交联接头切断速率主要由基团R1的结构来决定，如美国专利8,680,315所述，但接头所连接的胺基的碱度起到了额外的作用，使得相同反应条件下对于给定的R1，通过赖氨酸的α-胺而连接的交联接头的切断比通过ε-胺而连接的交联接头更快。这些因素的相互作用使得水凝胶的制备能够根据可预测并可控的动力学进行生物降解；例如参见Henise等人的Internat.J.Polymer Sci(国际J.聚合物科学),2019卷,文章编号9483127。
水凝胶的各种特性取决于交联程度，并因此取决于灭菌期间交联接头切断的程度。这种特性之一是水凝胶在置于特定pH值和温度下时溶解的时间，其被称为反向凝胶时间(trg)。交联与trg之间的关系在Reid等人的Macromolecules(高分子)2015,48:7359-69中被描述成公式(1)
trg＝t1/2,L2·ln[(1-f)/0.39]/ln(2) (1)
其中t1/2,L2是单个交联接头的切断半衰期，f是水凝胶质量因子，等于起初存在于水凝胶中的随机分布的已切断交联接头的初始分数。因此，如果在灭菌期间交联接头切断，则trg相对于初始的未灭菌水凝胶会降低。如下文实施例3中所示，灭菌期间交联接头切断的耐受程度取决于水凝胶的初始质量和trg能够变化的容许度。灭菌后水凝胶trg的变化是在灭菌前水凝胶trg的20％以内，优选在15％以内，更优选在10％以内。
水凝胶的另一个重要特性是在灭菌后保持活性官能团的效价。这种反应性官能团能够存在以使允许随后的化学衍生和荷载物如药物或可释放的接头-药物的连接，例如美国专利9,649,385、2019年1月31日提交的PCT申请PCT/US2019/016090以及2019年4月5日提交的美国临时专利申请62/830,280中所述。这种官能团可能会对水凝胶的其他部分或灭菌缓冲液中的组分呈现出不期望的反应性。这种官能团的分析方法在本领域是已知的，这种反应性基团为胺时的分析例提供于后述实施例中。
以下实施例对本发明进行说明，但非限制本发明。
制剂A
用于接头稳定性的PEG-接头-赖氨酸测试探针(R1＝N,N-二甲基磺酰基或吗啉代 磺酰基)
Figure GDA0003620875210000081
N(a)-(2,4-二硝基苯基)-N(e)-(4-叠氮-3,3-二甲基-1-(N,N-二甲氨基磺酰基)-2-丁氧羰基)-L-赖氨酸。根据Santi等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国自然科学院学报)(2012)109:6211-6的一般过程进行制备。将4-叠氮-3,3-二甲基-(N,N-二甲氨基磺酰基)-2-丁基琥珀酰亚胺碳酸酯(40mg，100umol)在2mL MeCN中的溶液加入N(a)-(2,4-二硝基苯基)-L-赖氨酸三氟乙酸盐(50mg，120umol)、0.2mL 1N NaOH、0.4mL 1M NaHCO3和1.4mL水的混合物中。10分钟后，用HCl酸化混合物，并用EtOAc萃取。提取物用水和盐水清洗，在硫酸镁上干燥、过滤和蒸发，得到黄色玻璃状产物(59mg，100umol，100％)。HPLC示为单峰；LC-MS显示[M+H]+m/z 589.1(对C21H33N8O10S+m/z 589.2的计算值)。
N(a)-(2,4-二硝基苯基)-N(e)-(4-叠氮-3,3-二甲基-1-(N,N-二甲氨基磺酰基)-2-丁氧羰基)-L-赖氨酸与PEG10kDa-四环辛炔的偶联。将步骤1的产物(11.2mg，19unmol)在0.2mL MeCN中的溶液添加到10-kDa四臂PEG-四环辛炔中[由10-kDa PEG-四胺和5-环辛-4-炔基琥珀酰亚胺碳酸酯制成](以环辛炔计为56.6mM，0.265mL，15umol环辛炔)在20mM乙酸盐缓冲液的溶液中，以pH 5.0在50℃下保持12小时。将溶液对甲醇透析(SpectraPor2膜，12-14kDa截留值)以除去未偶联物质，然后浓缩至干燥而提供偶联物(43mg，90％)，将其溶解在1mL水中以提供储液。HPLC显示游离DNP-赖氨酸含量<0.1％。
通过以4-叠氮-3,3-二甲基-1-(吗啉代磺酰基)-2-丁基琥珀酰亚胺碳酸酯为起始原料的相同步骤，制备R1＝吗啉代磺酰基的相应偶联物。
制剂B
氨基-水凝胶微球(R1＝N,N-二甲基磺酰基或吗啉代磺酰基)的制备
如以下专利文献中所述的那样制备氨基-水凝胶微球：2019年1月31日提交的PCT申请US2019/016090和2019年4月5日提交的美国临时专利申请62/830,280，其通过引用并入本文。
简而言之，微球如下所示由预聚物形成。
Figure GDA0003620875210000101
基团C和C'反应形成连接官能团C*。与C或C'之一连接的预聚物还包括通过与诸如式(3)的分子反应而引入的可切断接头，从而将可切断接头引入水凝胶的每个交联中：
Figure GDA0003620875210000102
其中n＝0～6，R1和R2独立地为吸电子基团、烷基或H，其中R1和R2中的至少一个是吸电子基团；每个R4独立地为C1～C3烷基或连在一起而可形成3～6成员环；X为卤素、活性酯如N-琥珀酰亚胺氧基、或硝基苯氧基、或五卤代苯氧基、或咪唑基、三唑基、四唑基或-N(R6)CH2Cl，其中-N(R6)CH2Cl中R6为任选取代的C1～C6烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；Z是用于将接头连接到大分子载体的官能团。在一些实施方式中，n为1～6。更一般而言，适用于本发明中的水凝胶包含含有式(4)的β-消除接头的交联接头
Figure GDA0003620875210000111
式中
m为0或1；
X包含将交联接头连接到第一聚合物的官能团；
R1、R2和R5中的至少一个包含将交联接头连接到第二聚合物的官能团Z；
其中R1和R2中的一个且仅有一个可为H，或者可为烷基、芳烷基或杂芳烷基，每个均任选取代；
R1和R2中的至少一个或两个独立地为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个
R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；
其中R1和R2可连接形成3～8元环；以及
每个R5独立地为H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，(OCH2CH2)pO-烷基中p＝1～1000，每个均任选取代。X通常为氨基甲酸酯O-(C＝O)-NH；Z通常为三唑(由叠氮化物与炔或环辛炔的环加成而形成)或甲酰胺或氨基甲酸酯；然而，述于以下专利文献中的其他可选物也适用：2019年1月31日提交的PCT申请PCT/US2019/016090(参见实施例4)和2019年4月5日提交的美国临时专利申请62/830,280(参见实施例14)。
在该说明中，第一预聚物包含四臂PEG，其中每个臂端接具有两个相互不反应(“正交”)的官能团B和C的衔接子单元。B和C起初可以受保护形式存在，以允许在后续步骤中的选择性化学反应。衔接子单元可为氨基酸的衍生物，尤其是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，包括α-胺基已转化为叠氮化物的衍生物，例如2-叠氮谷氨酸单酯。衔接子单元通过连接官能团A*连接到每个第一预聚物臂，该连接官能团A*由每个预聚物臂上的官能团A与衔接子单元上的同源官能团A'缩合形成。第二预聚物包含四臂PEG，其中每个臂端接与第一预聚物的基团C具有互补反应性的官能团C'，使得C和C'反应形成C*时两个预聚物之间发生交联。
作为说明性示例，用Z＝叠氮化物的式(3)接头来酰化H-Lys(Boc)-OH而得到衔接子单元。将其偶联到20-kDa四臂PEG-四胺并且去除Boc基团而提供第一预聚物，其中A*＝酰胺，B＝NH2，C＝叠氮化物，且式(3)的可切断接头引入第一预聚物的每个臂和C基团之间的连接中。相应的第二预聚体通过20-kDa四臂PEG-四胺用5-环辛炔基琥珀酰亚胺碳酸酯来酰化而制备，从而得到第二预聚体，其中C'＝环辛炔。一旦混合第一与第二预聚物，C＝叠氮化物和C’＝环辛炔基团就反应形成相应的三唑基团，从而将两种预聚物交联成三维网络，其中每个交联都包含通过引入式(3)化合物而产生的切断接头，并且其中通过引入第一预聚物而产生的每个节点都包含剩余的官能团B＝NH2，其可衍生以连接其它接头、药物、荧光团、金属螯合剂等。这种类型的水凝胶已用不同尺寸如5-、10-、20-和40-kDa的PEG制备。这些水凝胶的微球悬浮液通常包含直径为20～100μm的颗粒，尽管也可以制备其他尺寸和物理形状的水凝胶。水凝胶在蒸汽灭菌下的稳定性主要由通过β-消除而产生的交联接头切断的速率来控制；由于这取决于接头的性质以及介质的pH值和温度，但与PEG或水凝胶的大小和形状无关，因此水凝胶结构的所有此类变体都适用于本发明。
实施例1
PEG-接头-赖氨酸测试探针的稳定性
A.切断速率的温度依赖性。
将R1＝吗啉代磺酰基的制剂A的测试探针溶解于HPLC自动进样瓶中25℃下pH＝7.4的0.1M磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液的pH值在较宽温度范围内基本恒定，参见Reinecke等人Int.J.Food Properties(2011)14:4870-881)中，然后在设定的温度下温育。定期移除等分试样，并通过添加1/10体积1N HCl来淬灭，然后对所释放的DNP-赖氨酸通过以下方式进行HPLC分析：注射10μL到C18柱(Phenomenex Jupiter，300a，5μm，4.6×150mm)上，在10分钟内以0～100％MeCN/水/0.1％TFA的线性梯度进行洗脱并在350nm处分析。游离DNP-赖氨酸的形成被定量为％反应＝(AUC DNP-赖氨酸)/[(AUC DNP-赖氨酸)+(AUC偶联物)]×100，其中AUC为曲线下面积。随后由ln(％反应)相对于以小时为单位的时间的斜率而计算出反应速率常数(h-1)。
在37、60和80℃下测定速率，然后根据通过绘制ln(k)与1/T关系而得的阿伦尼乌斯图进行分析，其中T是以°K为单位的反应温度。这提供了ln(k)＝39.0470－14077/T的线性关系，从而给出A＝9.07×1016h-1和Ea＝117kJ/mol，如图5所示。
B.pH值的影响
PEG-接头-赖氨酸测试探针在缓冲液中的溶液经高压灭菌循环，然后进行HPLC分析以通过确定所释放的DNP-赖氨酸来测定接头切断的程度。在在2-mL螺旋盖自动进样瓶中，将测试探针储液(0.1mL)用1.0mL缓冲液来稀释。所用的缓冲液(以及25℃下pH值)为：
0.125M HEPES(pH 7.6)，
0.1M柠檬酸盐(pH 5.0和4.0)，
0.1M甘氨酸(pH 2.0)。
将小瓶密封，并重复进行标准高压灭菌循环，循环包括：(a)排空至5.80psia；(b)加热至121℃并保持20分钟；(c)在约1.5小时内冷却至97℃、然后使其冷却至室温并进行分析。高压灭菌器温度通过将探针浸入100mL玻璃GL45介质瓶中的50mL水中来监测。所用的高压灭菌器为Sterivap型669autclave(BMT医疗技术公司(BMT Medical Technology))。样品通过以下方式进行HPLC分析：注射10μL到C18柱(Phenomenex Jupiter，300a，5μm，4.6×150mm)上，在10分钟内以0～100％MeCN/水/0.1％TFA的线性梯度进行洗脱并在350nm处分析。
游离DNP-赖氨酸的形成被定量为％反应＝(AUC DNP-赖氨酸)/[(AUC DNP-赖氨酸)+(AUC偶联物)]×100。表1给出了R1＝(N,N-二甲氨基)磺酰基时第一次高压灭菌循环后接头切断的观测值和估算值。
表1. 121℃下采用SO2N(CH3)2调节剂的β-消除接头切断的估算值和测量值。
Figure GDA0003620875210000141
a)缓冲液的pH值在25℃下测定并采用所报告的温度系数以121℃估算。缓冲液、25℃下pH值和△pH/△T值为：Hepes、pH 7.4、-0.014；磷酸盐、pH 6、-0.0028；邻苯二甲酸酯、pH 5、-0.00013；甘氨酸、pH 2、+0.00044；b)计算使用以121℃计算的pH值；它们不包括循环的缓慢冷却期，预期会比观测值低。
8次连续高压灭菌循环的累积结果示于图1。pH值为4.0时，接头每次循环切断0.11％，并在连续8次循环后有>99％是完整的。pH值为5.0时，接头每次循环切断0.77％。
实施例2
氨基-水凝胶微球的高压灭菌试验
像实施例1中所述那样对2mL自动进样瓶中约1.5mL的R1为(N,N-二甲氨基)磺酰基的制剂B的氨基-水凝胶微球进行灭菌，然后分析通过显微镜观测物理参数的变化、随时间分析反向凝胶、并通过游离胺含量分析化学结构中的变化来进行。
经光学显微镜目视检测表明微球形态没有明显变化。用0.700mL的50％DMF/H2Ov/v稀释100mg微球浆样品。将0.200mL混合物样品置于显微镜载玻片(VWR，48300-026)上，并采用带5倍物镜(尼康E4/0.10，160/-NA)和单色CCD相机(Unibrain，Fire-I 580b)的白光显微镜(尼康TMS，SN:51436)来收集图像。使用图像分析软件(Image J v 1.52a)从三幅图像测定粒径(N＝≥150)。软件通过显微镜台测微计(电子显微镜科学公司(ElectronMicroscopy Sciences)，60210-3PG)图像的测定来校准而将像素转换为μm(1.98μm像素-1)。所观测到的微球示于图2。
其结果示于表2。
表2.胺-MSs以pH 4高压灭菌前后的特性。
Figure GDA0003620875210000151
a)平均值±SD，>50个微球测定值；b)平均值±SD，4次重复测定值。
测定胺和PEG含量，是将100mg等分的微球浆溶解于0.900mL的50mM NaOH中。如Schneider等人Bioconj Chem(2016)27:1210所述那样，用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸溶液)来测定0.060mL溶解后MSs的样品中的胺含量。对于PEG分析，是用0.980mL H2O来稀释0.020mL等分的上述溶解后微球的溶液，并用1.00mL的0.5M HClO4酸化。将0.200mL等分样品转移至96孔微量滴定板后，每份用0.050mL的5％w/v BaCl2和0.025mL Lugol溶液(0.18％w/w I2和0.35％w/w KI)的混合物来处理。5分钟后，用读板仪测定A535。PEG含量由A535 vs.[PEG]的标准曲线来确定，该标准曲线由1.25-至10ug mL-1的8000MW线性PEG标准品生成，其通过使用DMF标准品的NMR来预校准(Alvares等人Anal.Chem.(2016)88:3730)。氨基-MSs的nmol胺/mg PEG的比率通过测定同溶液中的游离胺和PEG来算出。
确定反向凝胶的时间，是用3×1mL的pH值为7.6的100mM HEPES，通过以21000g造粒5分钟，清洗1.5mL微型离心管中的0.5mL微球浆样品。用DMSO中的0.020mL 10mM 5-羧基荧光素HSE处理颗粒30分钟。用3×1mL水和3×1mL 100mM NaOAc清洗MSs。像(Schneider等人Bioconj Chem(2016)27:1210)所报告那样，对2.5mL的37℃下pH 9.4的100mM硼酸盐缓冲液中的0.1mL样品测定微球溶解度曲线。在溶解度50％～95％之间的区域进行线性回归。由公式：tRG＝100-Y截距/斜率算出100％溶解度的时间。溶解曲线示于图3A～3C。观测到反向凝胶的时间在平均值的7％标准偏差的范围内恒定，该标准偏差近似于相同样品4次重复所得的误差(8％)。
对于在磷酸盐或乙酸盐缓冲液中进行高压灭菌的氨基-水凝胶微球，其胺基与PEG的比率是稳定的，但在柠檬酸盐缓冲液中观测到胺基的损失(每次循环约7％)。(图4)料想这是由于高压灭菌循环期间柠檬酸酐的形成和随后的胺柠檬酰化(Chumsae等人Anal.Chem.(2014)86:8932)。
根据USP 71指南证明了最终氨基-水凝胶微球的无菌性。经高压灭菌后的水凝胶显示没有可检测的微生物生长。
实施例3
因水凝胶暴露于升温而导致的交联损失的计算
含β-消除接头的水凝胶在高压灭菌期间降解的一个机制是因接头在高温下切断而加速交联损失。其他机制可能也适用，例如官能团如胺在较高温度下反应性增强。
通过研究制剂A中所述的PEG-接头-赖氨酸探针(其表示水凝胶的单个交联单元)，可估算特定温度和pH值下单个交联的切断速率，并且可以通过标准分析方法如HPLC来容易分析切断。已证明β-消除切断反应在氢氧化物中是一级反应，因此根据公式2，每改变一个pH单元，切断速率就会改变10倍(Santi等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)2011,109(16):6211-6)：
kpH2＝kpH1·10(pH2–pH1) (2)
反应的温度依赖性由阿伦尼乌斯公式(公式3)表示
k＝A·e(-Ea/RT) (3)
其中k是速率常数(＝ln(2)/t1/2,L2)，T是以°K为单位的温度，A是指前因子，Ea是活化能，R是通用气体常数。A和Ea通过研究反应速率随温度的变化而实验确定，然后可用于预测不同温度下的反应速率。根据37～80℃之间的实验数据，式2的R1＝吗啉代磺酰基的PEG-接头-赖氨酸与接在ε-胺上的赖氨酸切断的阿伦尼乌斯图的示例示于图5。数据估算出活化能Ea＝117kJ/mol。R1为Me2N-SO2和4-(CF3)-苯基-SO2的比较数据示于表3。
表3.接头切断的阿伦尼乌斯参数
Figure GDA0003620875210000171
水凝胶中的交联接头切断速率随温度而呈指数增长，但随pH值的降低而呈指数下降。通过组合公式(2)和(3)，可通过公式(4)来计算出因温度从T1变化到T2(以开氏温度为单位)所导致的接头切断速率的补偿所需的pH值变化：
Figure GDA0003620875210000181
因此，如果已知一组温度和pH值条件T1和pH1下的包含β-消除接头的水凝胶的稳定性，只要用于切断反应的活化能Ea已知，则就能计算出水凝胶在温度T2下同样稳定的pH值pH2。例如，对于如上所述Ea＝117kJ/mol的通过β-消除接头而交联的水凝胶，如果这种水凝胶在pH 7.4和37℃(310.14°K)下1小时内经历特定量的交联接头切断，则在pH2＝3.2(△pH＝4.2)和121℃(394.14°K)下会观测1小时内到相同量的交联接头切断。
该关系可用于估算包含β-消除接头的水凝胶高压灭菌的合适条件。交联接头的切断速率、以及因此用于该过程的活化能通过R1和如上所述的间隔子连接的性质来决定。通过限定交联接头切断的可接受程度，例如通过对灭菌期间脱胶时间tRG的变化设定限值、并掌握Ea，则可以估算出合适的灭菌pH值。从公式(1)由公式(5)给出具有单个切断半衰期为t1/2,L2的接头上所包含的水凝胶中的交联程度从f1到f2的变化对trg的影响。
Figure GDA0003620875210000182
以Δtrg表示分数变化时(公式6)：
△trg/trg＝[ln(1-f2)–ln(1-f1)/[ln(1-f1)–ln(0.39)] (6)
因此，对于由100％起始交联接头(即f1＝0)构成的完美水凝胶，忽略灭菌期间水凝胶可能发生的任何其他结构变化，则灭菌期间这些交联接头的10％切断(即f2＝0.1)应导致trg降低11％。而对于起始不完美的水凝胶，这种交联损失对trg的影响更大：例如当f1＝0.2时，交联接头损失10％以致f2＝0.28使得trg变化了15％；并且例如当f1＝0.3时，交联接头损失10％以致f2＝0.37使得trg变化了18％。如果希望将trg保持在范围内。
相反，如果希望将trg保持在X＝△trg/trg的因子范围内，则f2值必须保持如公式(7)所示
f2<＝1–exp[(1+X)·ln(1-f1)–X·ln(0.39)] (7)
从公式(7)，表3示出交联△f＝f2–f1将△trg/trg保持在给定公差范围内的最大允许损失。从该表可见，要保持5％的trg公差，则需要从完美水凝胶(f1＝0)损失小于4.6％的交联接头，并从初始具有80％理论交联接头数(f1＝0.2)的水凝胶损失小于2.8％的交联接头。
表4.对具有切断交联接头初始分数f1的水凝胶在脱胶时间△trg/trg内所产生的分数变化△f的计算值。
Figure GDA0003620875210000191
已知灭菌期间交联接头切断的最大允许范围，则可根据温度和时间的灭菌条件下单个交联接头切断速率，采用公式(3)中的阿伦尼乌斯关系式来估算出高压灭菌所需的缓冲液pH值。例如，具有R1＝吗啉代磺酰基(pH 7.4、37℃下切断t1/2＝400小时)且具备图1中所示的阿伦尼乌斯关系的交联接头预计在pH 7.4、121℃下切断t1/2＝0.025小时(k＝28小时-1)。由于交联接头切断是一级反应，因此在时间段T内切断的交联接头分数表示为1-exp(-kT)。因此，在121℃、pH 7.4下灭菌20分钟会导致水凝胶基本上完全被破坏为单体单元(99.99％交联接头切断)。然而，在pH 5时，反应会减慢251倍，从而仅3.6％的交联接头切断，而在pH 4时仅0.4％的交联接头切断。从表3可见，pH 5对初始量低至f1＝0.3的水凝胶会给出将trg保持在10％以内的令人满意的结果，而pH 4有望对所有水凝胶给出trg公差在5％以内的令人满意的结果。在实践中，水凝胶因需要缓慢冷却而在高温下暴露的时间更长，并且保守估计水凝胶在灭菌温度(121℃)下要保持整整一小时，估计pH 4会产生1.1％的切断，同样适合保持5％的trg公差。
实施例5
可降解PEG-水凝胶的制备
Figure GDA0003620875210000211
本发明的水凝胶是由两种预聚物聚合制成，这两种预聚物包含基团C和C'，它们经反应而形成连接官能团C*。与C或C'之一相接的预聚物连接还包含可切断接头，其通过与式(3)的分子反应而引入，从而将可切断接头引入水凝胶的每个交联中。
在一实施方式中，第一预聚物包含四臂PEG，其中每个臂端接具有两个相互不反应(“正交”)的官能团B和C的衔接子单元。B和C起初可以受保护形式存在，以允许在后续步骤中的选择性化学反应。在某些实施方式中，衔接子单元可为氨基酸的衍生物，尤其是赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，包括α-胺基已转化为叠氮化物的衍生物，例如2-叠氮谷氨酸单酯。衔接子单元通过连接官能团A*连接到每个第一预聚物臂，该连接官能团A*由每个预聚物臂上的官能团A与衔接子单元上的同源官能团A'缩合形成。第二预聚物包含四臂PEG，其中每个臂端接与第一预聚物的基团C具有互补反应性的官能团C'，使得C和C'反应形成C*时两个预聚物之间发生交联。
作为说明性示例，第一聚合物如下制备。用Z＝叠氮化物的式3接头酰化H-Lys(Boc)-OH而得到A＝COOH、B＝Boc-保护的NH2且C＝叠氮化物的衔接子单元。将其偶联到20-kDa四臂PEG-四胺并且去除Boc基团而提供第一预聚物，其中A*＝酰胺，B＝NH2，C＝叠氮化物，且式3的可切断接头引入第一预聚物的每个臂和C基团之间的连接中。相应的第二预聚体通过20-kDa四臂PEG-四胺用5-环辛炔基琥珀酰亚胺碳酸酯来酰化而制备，从而得到C'＝环辛炔的第二预聚体。一旦混合第一和第二预聚物，C＝叠氮化物和C’＝环辛炔基团就反应形成相应的三唑基团，从而将两种预聚物交联成三维网络，其中每个交联都包含通过引入式3化合物而产生的切断接头，并且其中通过引入第一预聚物而产生的每个节点都包含剩余的官能团B＝NH2，其可衍生以连接其它接头、药物、荧光团、金属螯合剂等。
A*＝酰胺、B＝胺且C＝叠氮化物的预聚物A
Figure GDA0003620875210000221
(1)Nα-Boc-Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys-OH
用1M aq NaOH(12.0ml，12.0mmol)、1M aq NaHCO3(10.0ml、10.0mmol)和O-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁基}-O'-琥珀酰亚胺碳酸酯(3.91g，10.0mmol，0.1M最终浓度)在50ml MeCN中的溶液来连续处理Boc-Lys OH(2.96g，12.0mmol)在28mL H2O中的溶液。在室温下搅拌2小时后，通过C18 HPLC(ELSD)判断反应完成。用30mL的1MKHSO4(水溶液)淬灭反应。将混合物在500mL的1:1EtOAc:H2O之间分配。水相用100mL的EtOAc萃取。合并的有机相用H2O和盐水(各100mL)清洗，然后在MgSO4上干燥、过滤，并通过旋转蒸发浓缩，从而得到呈白色泡沫状的粗标题化合物(5.22g，9.99mmol，99.9％粗产率)。
C18 HPLC，通过ELSD测定纯度：99.1％(RV＝9.29mL)。
LC-MS(m/z)：计算值521.2；观测值521.3[M-H]-。
(2)Nα-Boc-Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys-OSu。将二环己基碳二亚胺(二甲苯中60％，2.6M，4.90mL，12.7mmol)添加到Nα-Boc-Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys-OH(5.11g，9.79mmol，0.1M最终浓度)和N-羟基琥珀酰亚胺(1.46g，12.7mmol)在98mL CH2Cl2中的溶液中。在室温下搅拌反应悬浮液，并通过C18 HPLC(ELSD)进行监测。2.5h后，过滤反应混合物，并将滤液加载到SiliaSep 120g柱上。产物用丙酮在己烷中的分步梯度洗脱(0％、20％、30％、40％、50％、60％，各240mL)。含有产物的澄清级分经合并和浓缩，从而提供呈白色泡沫状的标题化合物(4.95g，7.99mmol，81.6％产率)。
C18 HPLC，通过ELSD测定纯度：99.7％(RV＝10.23mL)。
LC-MS(m/z)：计算值520.2；观测值520.2[M+H-Boc]+。
(3)(Nα-Boc-Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys)4-PEG20kDa。
将PEG20kDa-(NH)4(20.08g，0.9996mmol，3.998mmol NH2，0.02M NH2最终浓度)溶解于145mL MeCN中。加入Nα-Boc-Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys-OSu(2.976g，4.798mmol)在50mL MeCN中的溶液。反应在室温下搅拌，并通过C18 HPLC(ELSD)进行分析。起始物质通过三个较慢的洗脱中间物峰转化为单个产物峰。1小时后，加入Ac2O(0.37mL，4.0mmol)。反应混合物搅拌30分钟，然后通过旋转蒸发浓缩至约50mL。将反应浓缩物添加到400mL经搅拌的MTBE中。将混合物在室温下搅拌30分钟，然后倾析。将MTBE(400mL)添加到湿固体中，悬浮液搅拌5分钟并倾析。将固体转移至真空滤器，并用3×100mL MTBE清洗/研磨。在过滤器上干燥10分钟后，将固体转移到已配衡的250mL HDPE包装瓶中。在高真空下去除剩余挥发物，直到重量稳定，从而提供呈白色固状的标题化合物(21.23g，0.9602mmol，96.1％产率)。
C18 HPLC，通过ELSD测定纯度：89.1％(RV＝10.38mL)，杂质含量为10.6％(RV＝10.08)。
(4)(Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys)4-PEG20kDa。
将(Nε-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-Lys)4-PEG20kDa(19.00g，0.8594mmol，3.438mmol Boc，0.02M Boc最终浓度)溶解于86mL的1,4-二噁烷中。搅拌5分钟以完全溶解PEG后，加入4M HCl在二噁烷中的溶液(86mL，344mmolHCl)。反应在室温下搅拌，并通过C18 HPLC(ELSD)进行分析。起始物质通过三个较快的洗脱中间物峰转化为单个产物峰。2小时后，将反应混合物浓缩至约40mL。向浓缩液中添加THF(10mL)，并再次将溶液浓缩至约40mL。将粘稠的油倒入400mL搅拌过的Et2O中。在室温下搅拌20分钟后，从沉淀物中倾析出上清液。在200mL Et2O的帮助下，将湿固体转移到真空滤器中，并用Et2O(3×75mL)清洗。固体在过滤器上干燥10分钟，然后转移到已配衡的250mLHDPE包装瓶中。在高真空下去除剩余挥发物过夜，从而提供呈白色固状的标题化合物(17.52g，0.8019mmol，93.3％产率@4HCl)。
C18 HPLC，通过ELSD测定纯度：99.2％(RV＝9.34mL)。
C'＝环辛基的预聚物B
在4-mL螺旋盖小瓶中装入PEG20kDa-[NH2]4(SunBright PTE-200PA；150mg，7.6μmolPEG，30.2μmol NH2，1.0当量，20mM最终胺浓度)、MeCN(1.5mL)和iPr2NEt(7μL，40μmol，1.3当量，27mM最终浓度)。加入活化的酯-环辛炔(39μmol，1.3当量，27mM最终浓度)溶液，并在室温下搅拌反应混合物。反应通过ELSD的C18 HPLC(20-80％B，历时11分钟)来监测。完成后，向反应混合物中加入Ac2O(3μL，30μmol，1当量/起始NH2)，并搅拌混合物30分钟。然后将反应混合物浓缩成浓稠的油并悬浮在MTBE(20mL)中。所得悬浮液剧烈搅拌10分钟。所得固体用MTBE(20mL)通过在离心机(2800rpm，4℃，10分钟)中剧烈混合、沉淀而研磨三次，并通过移液管除去上清液。所得固体在室温下真空干燥不超过30分钟。储液在20mM NaOAc(pH5)中制备，其目标胺浓度为20mM。然后用PEG7-N3(2当量)处理并用DBCO-CO2H反滴定未反应的PEG7-N3，以验证环辛炔浓度。
使用该方法制备的大分子单体包括环辛炔基团为MFCO、5-羟基环辛炔、3-羟基环辛炔、BCN(双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基)、DIBO、3-(羧基甲氧基)环辛炔和3-(2-羟基乙氧基)环辛炔的那些，分别使用MFCO五氟苯基酯、5-((4-硝基苯氧基-羰基)氧)环辛炔、3-(4-硝基苯氧基羰基)氧环辛炔、BCN羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、DIBO 4-硝基苯基碳酸酯、3-(羧基甲氧基)环辛炔琥珀酰亚胺酯和3-(羟基乙氧基)环辛炔-4-硝基苯碳酸酯来制备。
水凝胶微球的制备。如Schneider等人(2016)Bioconjugate Chemistry(生物偶联化学)27:1210-15中所述的那样制备并活化水凝胶微球。
实施例6
无菌水凝胶偶联物的制备
本发明的无菌水凝胶可用于制备适合通过连接小分子、肽、蛋白质或核酸药物来体内给药的无菌水凝胶-药物偶联物，例如PCT申请US2020/026726(2020年4月3日提交)和美国专利9,649,385中所述那样。通常，制备无菌水凝胶偶联物的方法包括三个步骤：(1)水凝胶微球的灭菌；(2)激活用于偶联的水凝胶微球；(3)偶联。现有技术中已经描述过非无菌条件下步骤(2)和(3)的标准过程(例如参见Schneider等人Bioconjugate Chemistry 27:1210-15)。在本发明中，这些方法适用通过在密闭的无菌筛底搅拌下的清洗器/反应器(参见Henise等人(2020)Engineering Reports(工程报告).2020；e12213.https://doi.org/10.1002/eng2.12213)中实施而适用于无菌处理，其中所有液体都通过合适的无菌过滤器引入。对于步骤(1)，是将合适缓冲液如pH 2～5的乙酸盐或磷酸盐缓冲液中的水凝胶微球浆放入清洗器/反应器中，然后用无菌过滤器将其密闭，并根据本发明的方法进行高压灭菌。使悬浮液冷却至室温，并通过筛底排水来去除灭菌缓冲液。然后用无菌缓冲液或水来清洗所得的无菌微球浆，并将其交换到合适的溶剂中进行活化步骤。在步骤(2)中，用活化剂和连接活化基团所需的任何中和碱来处理有机溶剂中的无菌微球浆。所有试剂均通过合适的无菌过滤器进入清洗器/反应器中，并且反应结束时多余的试剂通过筛底去除。对于步骤(3)，是将无菌活化水凝胶微球悬浮于合适的上样缓冲液中，该上样缓冲液根据待偶联的接头-药物的溶解度和稳定性来选择，并通过合适的无菌过滤器引入接头-药物溶液。如有必要，可通过加热清洗器/反应器而在高温下进行偶联反应，或通过冷却而在低于室温的温度下进行偶联反应。一旦偶联完成，即通过筛底去除多余试剂，并将无菌微球偶联物交换到合适的储剂或给药制剂中。
实施例7
无菌水凝胶-艾塞那肽偶联物的制备
为了说明本发明的灭菌水凝胶的用途，制备了艾塞那肽衍生物[Gln28]艾塞那肽与水凝胶微球的无菌偶联物。
(1)接头-药物Nα-{4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁氧基羰基}-[Gln28]艾塞那肽的制备已述于PCT申请US/2020/026726(2020年4月3日提交；通过引用并入本文)。在25ml烧结SPE柱中，将在Rink酰胺树脂上的经保护的[Gln28]艾塞那肽(fmocα-胺)(0.63meq/g置换，0.12mmol肽/g肽-树脂，1.00g肽-树脂，0.12mmol肽)在10ml DMF中室温下溶胀30分钟。用f/f鲁尔转接器和12mL注射器通过注射器过滤去除DMF，并使用DMF中的5％4-甲基哌啶处理溶胀的树脂(2×10mL，各5分钟；然后2×10mL，各20分钟)。然后用DMF(10×10mL)清洗fmoc-去保护树脂，并通过注射器过滤去除上清液。将清洗后的树脂悬浮于8.4ml DMF中，并用3.6ml 4-叠氮-3,3-二甲基-1-[(N,N-二甲基)氨基磺酰基]-2-丁基琥珀酰亚胺碳酸酯(DMF中0.10m，0.36mmol，30mm最终浓度)和4-甲基吗啉(40μL，0.36mmol，30mM最终浓度)处理。使用回旋振荡器搅动反应混合物。20小时后，通过注射器过滤去除上清液，然后依次用DMF(5×15mL)和CH2Cl2(5×15mL)清洗树脂。Kaiser试验对中间体接头-改性树脂中的游离胺呈阴性。然后用10ml预冷(0℃)90:5:5三氟乙酸：三异丙基硅烷：水来处理树脂，同时在回旋振荡器上轻轻搅拌。2小时后，对树脂进行真空过滤，并用TFA(2×1.5mL)清洗。滤液通过旋转蒸发浓缩至约6ml。将TFA浓缩液滴加至已配衡的50ml Falcon管中的40ml-20℃MTBE中而沉淀出粗接头-肽。在-20℃下温育10分钟后，通过离心(3000x g，2分钟，4℃)沉淀出粗接头-肽悬浮液，并倾析上清液。将所得颗粒悬浮于40ml-20℃MTBE中，旋转混合，离心，并如上所述倾析。在高真空下干燥后，分离出灰白色固态沉淀(575mg)，然后将其溶解在8ml5％乙酸中(约70mg/mL)。在50℃水浴中加热45分钟后，溶液通过制备级C18HPLC来纯化，提供13ml呈水溶液状的标题化合物(3.33mM，43μmol，A280测定)。冻干提供235mg白色固体。在280nm处测定C18 HPLC纯度：90.0％(Rv＝11.47ml).Mav:4476.9计算值；4476观测值。
(2)如上述实施例5中那样制备式(2)中R1＝SO2NMe2的水凝胶微球。将水凝胶微球悬浮于pH 4.0的0.1M乙酸盐缓冲液中，置于清洗器/反应器中，并在121℃的高压釜中进行蒸汽灭菌，保持时间为20分钟。
(3)将缓冲液通过清洗器/反应器的筛底从无菌水凝胶微球悬浮液中排出，并将微球交换入通过无菌过滤器而引入的乙腈。通过灭菌过滤器加入BCN琥珀酰亚胺碳酸酯(26mM，1.2当量/当量微球胺)和三乙胺(172mM，4当量/当量微球胺)在乙腈中的溶液，并轻轻搅拌混合物3小时。多余试剂通过清洗器/反应器的筛底排出，用通过无菌过滤器而引入的乙腈清洗微球，然后清洗并再悬浮于50％0.1M柠檬酸盐、pH 3.5、50％异丙醇、30mM甲硫氨酸上样缓冲液中。
(4)通过无菌过滤器加入接头-药物(24mM，1.1摩尔当量/当量的微球胺)在上样缓冲液中的溶液，将混合物搅拌并温和加热至40℃21小时。多余的试剂通过清洗器/反应器的筛底排出，用IPA/柠檬酸盐/甲硫氨酸缓冲液清洗微球，提供了负载[Gln28]艾塞那肽的水凝胶微球的无菌悬浮液。对所得微球的分析表明，肽的药物含量为4.2±0.2nmol/mg微球浆。

Claims (20)

1.一种对通过交联接头而连接的水凝胶进行灭菌的方法，该交联接头通过β-消除而降解，所述方法包括：调节含有所述水凝胶的介质的pH值，以将所述交联接头的降解减至最少，并加热至足够的温度和时间以实现灭菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述介质的pH值通过所述介质的非反应性缓冲液来确定。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述缓冲液为磷酸盐或乙酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的方法，其中，调节后的pH值为2～5。
5.如权利要求1所述的方法，其中，通过β消除而进行的降解的速率由交联接头中所含的一个或多个取代基来控制。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述水凝胶包含下式的交联接头：
Figure FDA0003620875200000011
式中
m为0或1；
X包含将所述交联接头连接到第一聚合物的官能团；
R1、R2和R5中的至少一个包含将所述交联接头连接到第二聚合物的官能团Z；
其中R1和R2中的一个且仅有一个可为H，或者可为烷基、芳烷基或杂芳烷基，每个均任选取代；
R1和R2中的至少一个或两个独立地为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；
其中R1和R2可连接形成3～8元环；以及
每个R5独立地为H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，(OCH2CH2)pO-烷基中p＝1～1000，每个均任选取代；
或
Figure FDA0003620875200000021
式中
m为0或1；
n为1～1000；
s为0～2；
t为2、4、8、16或32；
W为O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)S、
Figure FDA0003620875200000031
Figure FDA0003620875200000032
其中x和y＝0～4；
Q为价态＝t的核心基团；
其中R1、R2和R5中的至少一个包含能够连接到聚合物的官能团Z1，以及
至少R1和R2中的至少一个或两个独立地为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；
其中R1和R2可连接形成3～8元环；以及
每个R5独立地为H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，(OCH2CH2)pO-烷基中p＝1～1000，每个均任选取代。
7.如权利要求5所述的方法，其中，X为氨基甲酸酯，Z为三唑、甲酰胺或氨基甲酸酯。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述水凝胶包含下式的交联接头：
Figure FDA0003620875200000041
9.如权利要求8所述的方法，其中，R1为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代。
10.如权利要求8所述的方法，其中，R1为CN或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环。
11.如权利要求8所述的方法，其中，R1为CN；SO2Me；SO2NMe2；SO2N(CH2CH2)2X或SO2(Ph-R10)，其中X为不存在、O或CH-R10，R10为H、烷基、烷氧基、NO2或卤素。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述灭菌通过加热到121℃并保持20分钟来实现。
13.一种包含可通过β-消除机制而降解的交联接头的水凝胶，其已通过加热至足够的温度进行灭菌来实现灭菌。
14.如权利要求13所述的水凝胶，其中，所述水凝胶为微粒悬浮液。
15.如权利要求13所述的水凝胶，其中，可通过β消除机制而降解的交联接头具有下式：
Figure FDA0003620875200000061
式中
m为0或1；
X包含将所述交联接头连接到第一聚合物的官能团；
R1、R2和R5中的至少一个包含将所述交联接头连接到第二聚合物的官能团Z；
其中R1和R2中的一个且仅有一个可为H，或者可为烷基、芳烷基或杂芳烷基，每个均任选取代；
R1和R2中的至少一个或两个独立地为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；
其中R1和R2可连接形成3～8元环；以及
每个R5独立地为H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，(OCH2CH2)pO-烷基中p＝1～1000，每个均任选取代；
或
Figure FDA0003620875200000071
式中
m为0或1；
n为1～1000；
s为0～2；
t为2、4、8、16或32；
W为O(C＝O)O、O(C＝O)NH、O(C＝O)S、
Figure FDA0003620875200000072
Figure FDA0003620875200000073
其中x和y＝0～4；
Q为价态＝t的核心基团；
其中R1、R2和R5中的至少一个包含能够连接到聚合物的官能团Z1，以及
至少R1和R2中的至少一个或两个独立地为CN；NO2；
任选取代的芳基；
任选取代的杂芳基；
任选取代的烯基；
任选取代的炔基；
COR3或SOR3或SO2R3，其中
R3为H或任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；或
OR9或NR9 2，其中每个R独立地为H或任选取代的烷基，或两个R9基团都与它们所连接的氮一起形成杂环；
SR4，其中
R4为任选取代的烷基；
芳基或芳烷基，每个均任选取代；或
杂芳基或杂芳基烷基，每个均任选取代；
其中R1和R2可连接形成3～8元环；
其中R1和R2中的一个且仅有一个可为H，或者可为烷基、芳烷基或杂芳烷基，每个均任选取代；以及
每个R5独立地为H或烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，(OCH2CH2)pO-烷基中p＝1～1000，每个均任选取代。
16.如权利要求15所述的水凝胶，其中，m＝0，R2为H，一个R5为H且其余为C(Me)2(CH2)nZ，其中n＝0～6，并且W为
Figure FDA0003620875200000081
其中x和y＝0～4。
17.如权利要求15所述的水凝胶，其中，所述水凝胶包含下式的交联接头：
Figure FDA0003620875200000082
Figure FDA0003620875200000091
18.如权利要求13所述的方法，其中，所述灭菌通过将所述水凝胶在pH值为2～5的缓冲液中的悬浮液加热到121℃并保持20分钟来实现。
19.一种无菌水凝胶偶联物的制备方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过以合适的pH值、温度和时间进行高压灭菌来对水凝胶进行灭菌；
(b)任选地激活无菌水凝胶以进行偶联；以及
(c)在保持偶联物无菌的条件下，将药物或接头-药物连接到无菌水凝胶上。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述药物为肽、蛋白质或小分子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112022003649A2 (pt) * 2019-08-28 2022-07-19 Prolynx Llc Inibidores conjugados de resposta ao dano no dna

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140288190A1 (en) * 2011-09-07 2014-09-25 Prolynx Llc Hydrogels with biodegradable crosslinking
CN107073167A (zh) * 2014-08-01 2017-08-18 考麦德制药公司 灭菌的热凝胶组合物
KR20190038368A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 주식회사 엘지화학 히알루론산 기반 하이드로겔 약제학적 안정화 조성물 및 그 제조방법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2770498T3 (es) * 2012-08-28 2020-07-01 Univ Geneve Hidrogeles híbridos
CN109414469A (zh) * 2016-03-16 2019-03-01 普罗林科斯有限责任公司 艾塞那肽类似物的缓释偶联物
WO2019066505A1 (ko) * 2017-09-29 2019-04-04 주식회사 엘지화학 히알루론산 기반 하이드로겔 약제학적 안정화 조성물 및 그 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140288190A1 (en) * 2011-09-07 2014-09-25 Prolynx Llc Hydrogels with biodegradable crosslinking
CN107073167A (zh) * 2014-08-01 2017-08-18 考麦德制药公司 灭菌的热凝胶组合物
KR20190038368A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 주식회사 엘지화학 히알루론산 기반 하이드로겔 약제학적 안정화 조성물 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEFF HENISE等: "Autoclave sterilization of tetra-polyethylene glycol hydrogel biomaterials with β-eliminative crosslinks", 《ENGINEERING REPORTS》 *
XIANG MEI YAN等: "Improved synthesis of hyaluronic acid hydrogel and its effect on tissue augmentation", 《JOURNAL OF BIOMATERIALS APPLICATIONS》 *

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