JP2024510908A - ペプチド抗原用の担体タンパク質 - Google Patents

Abstract

いくつかのペプチドエピトープが共有結合的にグラフトされている配列番号１からなるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物、このコンジュゲートペプチドを製造するための要素を含むキット、合成方法、およびワクチンとしての使用。

Description

本発明は、ペプチド抗原の担体タンパク質としてのタンパク質ＣＲＭ１９７（配列番号１）の使用に関する。

免疫学は、多数の因子が応答の誘発または制御に関与する、最も複雑な臨床、生物学、さらには生化学分野の１つである。

これに関連して、ワクチン接種は、所望の特異性を持たせて免疫系を調整するための独特のツールを表す。

種々のエピトープ、とりわけペプチドが開発されて、今もなお用いられている。これらのエピトープは、これらを有するポリペプチド、例えばタンパク質として注射されるか、または完全に合成されたペプチドエピトープが注射される。

選択されたエピトープが短い場合、これらは通常、免疫系によって認識されることを確実にするために、担体タンパク質（フランス語でｐｒｏｔｅｉｎｅ ｐｏｒｔｅｕｓｅ）にカップリングされる。

当該担体タンパク質（担体）は、数が少ない。

実際、潜在的なあらゆる組成物、したがって潜在的な新しいあらゆる担体タンパク質は、適切な動物モデルにおいて試験されなければならず、これは複雑かつ高価であり、そして加えて、倫理的な疑問を提起するので、この種の研究は、目的が単に担体タンパク質のスクリーニングであるが、単純ではない。最後に、研究は、齧歯類または他の動物に行われたかに応じて、多くの場合、矛盾する結果をもたらす。

したがって、新しい担体タンパク質が必要とされている。

考えられる候補は、タンパク質ＣＲＭ１９７を含む。このタンパク質は、齧歯類において、かつ／または当該タンパク質にグラフトされることとなるエピトープが糖もしくは糖脂質である場合に、使用法が知られているが、ペプチド、特に疎水性ペプチドによってコンジュゲートされるための当該タンパク質の使用は、これまで実施されておらず、またはいずれの場合にも、ヒト患者に投与されていない。

国際公開第２０１６／１８４９６３号パンフレットは、疾患に対して有効なワクチンを製造することを目指して、ＡＩＤＳウイルスの糖タンパク質ｇｐ４１に由来する短い親水性ヘキサペプチドをタンパク質ＣＲＭ－１９７またはＫＬＨ上にグラフトすることを記載している。架橋が、直接的に、またはヘテロ二官能性剤によって実行される。いくつかの理論上のペプチド／ＣＲＭ－１９７比が言及されているが、とりわけより複雑な、またはより親水性が低いペプチドについては、前記実施を記載している完全な例はない。

欧州特許出願公開第２６５９９０６号明細書は、アルファ－シヌクレインのエピトープを記載しており、そしてまた担体タンパク質ＣＲＭ－１９７またはＫＬＨを示唆しているが、ＣＲＭ－１９７上へのペプチドエピトープのカップリングについては記載していない。

国際公開第２０１６／１８４９６３号パンフレット 欧州特許出願公開第２６５９９０６号明細書

本発明の第１の態様は、好ましくは同一の、いくつかのペプチドエピトープが共有結合的にコンジュゲートされている配列番号１からなるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物である。

有利には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のペプチドエピトープが、配列番号１のペプチド上にグラフトされており（ペプチドエピトープモル：配列番号１モル）、かつ／または２０、１９、１８、１７、１６、１５個未満のペプチドエピトープが、配列番号１のペプチドにコンジュゲートされている（ペプチドエピトープモル：配列番号１モル）。

好ましくは、ペプチドエピトープは（それぞれ）、有利にはヘテロ二官能性架橋剤、好ましくはＳｕｌｆｏ－ＧＭＢＳを介して、配列番号１の－ＮＨ２残基のレベルにてコンジュゲートされている。

有利には、遊離－ＳＨ基が、天然のペプチドエピトープに、好ましくは、システインアミノ酸が、グラフトされることとなるペプチドエピトープのＮ末端またはＣ末端に加えられている。

この医薬組成物は、ヒト、イヌ、ウマ、またはラクダ科のメンバーからなる群から選択される患者のワクチン接種、好ましくは治療に用いられるのに有利である。患者は、好ましくはヒトである。

好ましくは、この医薬組成物はさらに、ワクチンアジュバント、好ましくはエマルジョン、または１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の関連する態様は、この医薬組成物、およびコンジュゲートされた配列番号１を含む溶液にとって所望のｐＨを確実にする（ｐＨ）バッファを含む、指定されたｐＨを有する水溶液である。

このバッファｐＨは、有利には、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５である。上記の値は、好ましくは目標値±０．２、さらにより好ましくは±０．１であり、または目標値にさらに近い。ゆえに、ｐＨ３．０は、好ましくは、２．９よりも大きく、かつ３．１未満のｐＨを意味する。好ましいバッファｐＨは、酢酸ｐＨ４．５、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸ｐＨ６．５、ビス－トリスｐＨ６．０、ＣＨＥＳ（２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタン酸）ｐＨ９．５、クエン酸ｐＨ３．２（または４．０もしくは５．５）、イミダゾールｐＨ８、グリシンｐＨ３．０、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．２、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）ｐＨ７．０、ＰＩＰＰＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）ｐＨ３．７、およびリン酸ｐＨ５．０からなる群から選択される。上記分子は、ｐＨに応じて塩であるときがあり、例えば、グリシンｐＨ３バッファは、グリシンがプロトン化形態、例えばグリシン－ＨＣｌであることを意味することが理解されるべきである。

本発明の別の関連する態様は、遊離－ＳＨ基を含む天然のタンパク質に由来するエピトープ、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤、好ましくはカップリング剤Ｓｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ、ならびに担体タンパク質、すなわち配列番号１を含むキットである。

好ましくは、このキットはさらに、ワクチンアジュバント、好ましくはエマルジョン、または１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドを含む。

本発明の別の関連する態様は、ペプチドエピトープを担体タンパク質にカップリングさせる方法であって、遊離－ＳＨ基を含むペプチドエピトープを特定するか、または遊離－ＳＨ基が加えられているペプチドエピトープを特定する工程と、配列番号１である担体タンパク質を生成する工程と、この担体タンパク質を、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤を介して活性化して、この配列番号１の複数の－ＮＨ２基を、この（ヘテロ）二官能性架橋剤と反応させる工程と、活性化された担体タンパク質を、組み込まれていない架橋剤から分離する工程と、活性化された担体タンパク質を、特定されたペプチドエピトープと接触させて、ペプチドエピトープのこの－ＳＨ基を、架橋剤によって活性化されたこの担体タンパク質と反応させる工程と、いくつかのペプチドエピトープにカップリングされた担体タンパク質を、未反応基質および反応副生成物から分離する工程とを含む、方法である。

この方法では、好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤は、活性化されることとなる配列番号１の－ＮＨ２残基の数と比較して、過剰である。

好ましくは、この方法はさらに、いくつかのエピトープにカップリングされた担体タンパク質（配列番号１）を、指定されたｐＨバッファを含む水溶液中に溶解させて、コンジュゲートされた配列番号１を含む溶液にとって所望のｐＨを確実にする工程を含む。

この指定されたｐＨは、有利には、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５である。上記の値は、好ましくは目標値±０．２、さらにより好ましくは±０．１であり、または目標値にさらに近い。ゆえに、ｐＨ３．０は、好ましくは、２．９よりも大きく、かつ３．１未満のｐＨを意味する。

好ましいバッファｐＨは、酢酸ｐＨ４．５、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸ｐＨ６．５、ビス－トリスｐＨ６．０、ＣＨＥＳ（２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタン酸）ｐＨ９．５、クエン酸ｐＨ３．２（または４．０もしくは５．５）、イミダゾールｐＨ８、グリシンｐＨ３．０、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．２、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）ｐＨ７．０、ＰＩＰＰＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）ｐＨ３．７、およびリン酸ｐＨ５．０からなる群から選択される。

溶解工程は、有利には、これ以外にもアセトニトリルを含む溶液中で、または上記のｐＨバッファと相乗的に実行されてもよく、例えば、好ましくは、前記水溶液は、アセトニトリルを、好ましくは１０％～５０％（アセトニトリル：水；ｖ：ｖ）、例えば４０（容量）％未満、例えば約３０：７０（アセトニトリル：水；ｖ：ｖ）、含む。これは、いくつかのペプチドエピトープにカップリングされた担体タンパク質の凍結乾燥の（最終）工程とつながれ得る。

本発明の別の関連する態様は、上記方法によって得ることができるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物である。好ましくは、この組成物はさらに、好ましくはエマルジョンから選択される、ワクチン接種アジュバント、および１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドを含む。

タンパク質ＣＲＭ１９７（配列番号１）は、その高い含量の－ＮＨ２残基、４０：３９リジン、すなわち配列のほぼ１０％、およびアミノ末端に起因して、ペプチドエピトープのカップリングに関して、二重に特殊である。

高いリジン含量に加えて、配列番号１は、タンパク質が天然に親水性であるように、他の多くの荷電アミノ酸または極性アミノ酸を含む。しかしながら、いくつかのペプチドエピトープにコンジュゲートされると、－ＮＨ２残基、とりわけより露出した－ＮＨ２残基が動員されて、親水性を根本的に覆す。この作用は、グラフトされることとなるエピトープが疎水性であるか、またはほんのわずかに親水性である場合に、さらに顕著である。

例えば適切な溶媒を選択することによって、物理化学的特性のそのような変化を克服することが、確かに可能である。しかしながら、当該条件は、医薬品の使用に適合したままでなければならない。ゆえに、（ｉ）毒性溶媒もしくは変性溶媒、または（ｉｉ）極端であるか、もしくはいくつかのペプチドにコンジュゲートされた配列番号１の溶解度の限界に近すぎる条件は、許容されない。さらに、ペプチド合成中に、凍結乾燥工程を使用して反応の生成物を濃縮すること、または最終生成物を、安定し、かつ輸送が容易な粉末の形態で得ることが好都合である。しかしながら、アセトニトリル等の特定の有機溶媒は、爆発の危険性を伴うため、これらの条件において、過度に高い濃度にて使用されることはできない。

したがって、本発明の第１の態様は、いくつかのペプチドエピトープが共有結合的にグラフトされている配列番号１からなるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物である。当該組成物は、好ましくは医薬用途（ワクチン接種）用である。

本発明の文脈において、用語「ワクチン」または「ワクチン接種」は、好ましくは、それらの最も広い意味で理解され、免疫系の特異的応答を誘発することを目的とした、患者内へのペプチドエピトープのあらゆる注射を意味する。ゆえに、用語「ワクチン」または「ワクチン接種」は、本発明の文脈において、患者のあらゆる免疫化を有利に含む。所望の目的は、予防的であっても治療的であってもよい。免疫（ワクチン接種）は、感染性疾患に限定されないが、炎症性疾患、自己免疫性疾患、および変性疾患も含む（癌を含む）。応答は、体液性もしくは細胞性、またはそれらの双方であり得る。応答は、免疫系の（特異的）活性化であっても免疫系の（特異的）抑制であってもよい。標的とされる免疫系の細胞の種類は限定されず、抗原提示細胞の性質も限定されない。

好ましくは、配列番号１の分子上にグラフトされることとなるペプチドエピトープは同一であるが、いくつかの異なるエピトープのグラフト化が、配列番号１の１つの分子上に非常に良好に実行されることができる。

有利には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のペプチドエピトープ、好ましくは２０、１９、１８、１７、１６、１５個未満のペプチドエピトープが、配列番号１のペプチド上にグラフトされる（ペプチドエピトープモル：配列番号１モル）。

配列番号１あたりのペプチドエピトープの数を正確かつ／または予測可能にすることで、グラフト化タンパク質の精製がより良好に実行されることが可能となる。

配列番号１あたりで多数のペプチドエピトープを得ることは、とりわけ疎水性ペプチドについて困難であるが、より容易な分離、および患者へのペプチドエピトープのより大きな投与を可能にし、これは、治療的ワクチン接種において、特に有利である。

有利には、ペプチドエピトープは、用いられるカップリング剤（例えばＳｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ）に応じて、時には「スペーサ」を、例えばカップリング剤の残りの部分を介して、配列番号１の－ＮＨ２残基のレベルにてグラフトされる。

グラフト化（コンジュゲーション）が、非常に親水性であり、かつ露出している荷電残基を、とりわけいくつかのエピトープがグラフトされている場合に、結果として生じる複合体の疎水性を大幅に増大させる疎水性複合体に変換するとしても、本発明者らは、グラフトされることとなるペプチドエピトープが、ほんのわずかに親水性であり得るか、または疎水性ですらある条件を特定するのに成功した。

本発明の文脈において、「ペプチドエピトープ」は、天然アミノ酸で構成された天然のペプチド等の、アミド結合によって本質的に形成されたあらゆる分子を意味する。しかしながら、ペプチドエピトープは、修飾アミノ酸：特定の病理学的もしくは生理学的状況で（例えば、プロリン、セリン、アスパラギン、リジン、アルギニン、またはトリプトファンのレベルにて）生じる修飾、またはアルキル残基によるアミノ酸のカップリング等の化学的タイプの他の修飾のいずれかを含み得る。

好ましくは、本発明の文脈において、ペプチドエピトープは、ペプチド結合によって連結された７つのアミノ酸、好ましくは少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、かつ／または好ましくは４０個未満のアミノ酸、３５個未満のアミノ酸、３０個未満のアミノ酸、もしくはさらに２０個未満のアミノ酸の少なくとも１つの鎖を含む。

したがって、これらのペプチドエピトープは、配列番号１に共有結合的にグラフトされる。実際には、いくつかのペプチドエピトープが配列番号１にグラフトされる。また、これらのペプチドエピトープは、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤を含むキットに組み込まれており、対応するカップリングプロセスに用いられるので、本方法によって得られる医薬組成物に組み込まれる。

本発明の文脈において、「ほんのわずかに親水性であるか、または疎水性であるペプチド」は、アルギニン、リジン（および／またはオルニチン、シトルリン）、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸を５０％未満、好ましくは４０％未満、３５％未満、もしくはさらに３０％未満、もしくはさらに２６％未満、かつ／またはバリン、ロイシン、イソロイシン（および／またはノルロイシン）、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を２０％、３０％、３５％、もしくはさらに４０％超含むペプチドを意味する。好ましくは、疎水性ペプチドは、本発明の文脈において、バリン、ロイシン、イソロイシン（および／またはノルロイシン）、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも３５％、ならびにアルギニン、リジン（および／またはオルニチン、シトルリン）、ヒスチジン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸を３５％未満含む。より一般的には、本発明の文脈において、好ましくは、疎水性ペプチドは、アルギニン、リジン（および／またはオルニチン、シトルリン）、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、および潜在的にはセリンからなる群から選択されるアミノ酸よりも、バリン、ロイシン、イソロイシン（および／またはノルロイシン）、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれ以上）含む。また、アミノ酸の側鎖の天然修飾または人工修飾を含む他の非天然アミノ酸は、親水性または疎水性を有する。ペプチドエピトープ内での考えられる組換えから生じるペプチドの疎水性に関する結果は、例えば上記の数値を適合させることによって、見出されることとなる。

これ以外にも、用語「ほんのわずかに親水性であるペプチド」は、例えばｐＨ７にて、水または水溶液（界面活性剤を含まない）中での溶解度が低いペプチドに関する。溶解度は、水（ｐＨ７；２５℃）－オクタノール系における分布から決定され得る：ほんのわずかに親水性であるペプチドは、主に、有機相（例えばオクタノール）内で見出される（例えば、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超）。

したがって、本発明は、有利には、ＣＲＭ－１９７上に、疎水性ペプチドであっても、ペプチド（ペプチドエピトープ）を大量にグラフトすることを可能にする。したがって、疎水性（またはほんのわずかに親水性）ペプチドのグラフト化が可能であり、有利ですらある。

好ましくは、エピトープは、好ましくは－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性の、ヘテロ二官能性架橋剤、さらにより好ましくはＳｕｌｆｏ－ＧＭＢＳを介してグラフトされる。

－ＳＨ基に対して反応性である架橋剤が用いられる場合、（アクセス可能な）－ＳＨ基が有利には、これを天然に欠く（または－ＳＨ基がアクセス不能である）ペプチドエピトープに加えられる。好ましい様式は、エピトープのカルボキシ末端またはアミノ末端）へのシステイン残基のカップリング（グラフト化）である。場合によっては加えられるこのシステインは、好ましくは、グラフトされることとなるペプチドの疎水性を推定するための上記計算に組み込まれる。

カップリング（グラフト）されることとなるペプチドエピトープが天然にシステインを含有する場合、好ましくは、カップリング（グラフト）工程は、このシステインがカップリング（グラフト化）に利用可能であるか、そして有利には、このシステイン上でのカップリング（グラフト化）がペプチドエピトープの免疫原性を変化させるかを判定するための予備工程を含む。ゆえに、好ましくは、ペプチドエピトープが天然にシステインを含有する場合（アクセス可能であるか否か；結合に使用される場合に問題があるか否か）、このシステインは保護され得、そして別のシステイン残基が、ペプチドエピトープの末端の一方に加えられ得る。

この医薬組成物は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）、およびラクダ科のメンバー（ラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ）属種）からなる群から選択される患者のワクチン接種に用いられるのに有利である。好ましくは、患者はヒトである。実際、配列番号１にカップリングされた多数のペプチドは、患者へのエピトープの大量投与を可能にし、これは、治療的ワクチン接種において特に有利である。

この治療的ワクチン接種は、感染性疾患（とりわけ感染体が細胞内にある場合）、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、および癌の処置に有用である。

有利には、医薬組成物は、エマルジョン（水中油型および油中水型）、ＣｐＧ単位を有するオリゴヌクレオチド、またはアルミニウム塩等の（ワクチン接種および／または免疫化）アジュバントの存在下で用いられるか、またはそれらと組み合わせて用いられる。好ましいアジュバントは、エマルジョン（水中油型および油中水型）、およびＣｐＧ単位を有するオリゴヌクレオチドである。

好ましくは、医薬組成物は、患者へのその投与を考慮して、バッファ中の水溶液であるか、またはそのような水溶液になり、バッファは、コンジュゲートされた配列番号１を含む溶液にとって所望のｐＨを確実にするものである。このバッファｐＨは、有利には、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５である。上記の値は、好ましくは目標値±０．２、さらにより好ましくは±０．１であり、または目標値にさらに近い。ゆえに、ｐＨ３．０は、好ましくは、２．９よりも大きく、かつ３．１未満のｐＨを意味する。

好ましいバッファｐＨは、酢酸ｐＨ４．５、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸ｐＨ６．５、ビス－トリスｐＨ６．０、ＣＨＥＳ（２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタン酸）ｐＨ９．５、クエン酸ｐＨ３．２（または４．０もしくは５．５）、イミダゾールｐＨ８、グリシンｐＨ３．０（すなわちグリシン－ＨＣｌ）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．２、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）ｐＨ７．０、ＰＩＰＰＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）ｐＨ３．７、およびリン酸ｐＨ５．０からなる群から選択される。好ましくは、これらのｐＨバッファは、５～５０ｍＭ、好ましくは２０～５０ｍＭの濃度にて用いられる。ｐＨ値は、好ましくは±０．２の範囲内である。ゆえに、「ｐＨ５．０」は、厳密に５．０のｐＨが好ましいとしても、４．８～５．２を意味する（本実施例ではｐＨ範囲を説明する）。有利には、好ましくはアルギニンおよびグルタミン（それぞれ５０ｍＭ）、トリメチルアミンＮ－オキシド（５００ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１％；ｗ：ｖ）、トレハロース（５００ｍＭ）、およびグリセロール（２０％；ｖ：ｖ）から選択される添加剤が、ｐＨバッファと組み合わされる。

本発明の関連する態様は、遊離－ＳＨ基を含む天然のタンパク質に由来する１つ以上のエピトープ、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤、好ましくはカップリング剤Ｓｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ、ならびに配列番号１を含むキットである。当該キットは、１つ以上のエピトープを配列番号１にカップリングするための必須要素を含有する。

有利には、当該キットはまた、上記のアジュバントおよび／または上記のｐＨバッファを含む。

本発明の別の関連する態様は、ペプチドエピトープを担体タンパク質にカップリングさせる方法であって、
－遊離－ＳＨ基を含むペプチドエピトープを特定するか、または遊離－ＳＨ基が（例えば、システインがアミノ末端に）加えられているペプチドエピトープを特定する工程と、
－配列番号１である担体タンパク質を得る工程と、
－－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤によって担体タンパク質を活性化して、（この配列番号１の）複数の－ＮＨ２基を、二官能性架橋剤と反応させる工程と、
－活性化された担体タンパク質を、組み込まれていない架橋剤から分離する工程と、
－活性化された担体タンパク質を、特定されたペプチドエピトープと接触させて、ペプチドエピトープの－ＳＨ基を、架橋剤によって活性化された担体タンパク質と反応させる工程と、
－場合によっては、過剰のシステインを加えて、（過剰に）加えられたエピトープと反応しなかった－ＳＨ基の反応性残基を中和する工程と、
－未反応基質および反応副生成物のいくつかのペプチドエピトープにカップリングされた担体タンパク質を分離する工程と、
－場合によっては、いくつかのペプチドエピトープにカップリングされた担体タンパク質を、指定されたｐＨバッファを含む水溶液中に入れて、コンジュゲートされた配列番号１を含む溶液にとって所望のｐＨを確実にする工程と、
－場合によっては、いくつかのペプチドエピトープにカップリングされた担体タンパク質を凍結乾燥する工程と、
－場合によっては、担体タンパク質を、上記のｐＨバッファを含む水溶液中に再溶解させる工程と
を含む、方法である。

好ましくは、本発明の他の態様と同様に、これらのｐＨバッファは、５～５０ｍＭ、好ましくは２０～５０ｍＭの濃度にて用いられる。このバッファｐＨは、有利には、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、または８．５である。上記の値は、好ましくは目標値±０．２、さらにより好ましくは±０．１であり、または目標値にさらに近い。ゆえに、ｐＨ３．０は、好ましくは、２．９よりも大きく、かつ３．１未満のｐＨを意味する。好ましいバッファｐＨは、酢酸ｐＨ４．５、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸ｐＨ６．５、ビス－トリスｐＨ６．０、ＣＨＥＳ（２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタン酸）ｐＨ９．５、クエン酸ｐＨ３．２（または４．０もしくは５．５）、イミダゾールｐＨ８、グリシンｐＨ３．０（グリシン－ＨＣｌ）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ７．５、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．２、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）ｐＨ７．０、ＰＩＰＰＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（３－プロパンスルホン酸）ｐＨ３．７、およびリン酸ｐＨ５．０からなる群から選択される。ｐＨ値は、好ましくは±０．２の範囲内である。ゆえに、「ｐＨ５．０」は、厳密に５．０のｐＨが好ましいとしても、４．８～５．２を意味する（本実施例ではｐＨ範囲を説明する）。有利には、好ましくはアルギニンおよびグルタミン（それぞれ５０ｍＭ）、トリメチルアミンＮ－オキシド（５００ｍＭ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１％；ｗ：ｖ）、トレハロース（５００ｍＭ）、およびグリセロール（２０％；ｖ：ｖ）から選択される添加剤が、ｐＨバッファと組み合わされる。

本発明者らは、配列番号１の－ＮＨ２基の活性化、続くエピトープのグラフト化（例えば、遊離および／またはアクセス可能な－ＳＨ残基を介する）によって、より大きく、かつより再現性のある電荷を許容することに気付いた。配列番号１の分子上の（平均）１２～１３個のグラフトされたエピトープの「価数」が、それらの疎水性（非常に疎水性のエピトープおよび中程度に疎水性のエピトープ）にも拘わらず、少なくとも２つの異なるエピトープについて、再現性よく得られた。

本発明者らは、いくつか（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはさらには１３個）の疎水性エピトープが配列番号１の分子上にグラフトされた場合でも、水：アセトニトリル混合液７０：３０（ｖ：ｖ）が、グラフトされた配列番号１が溶解するのを可能にすることに気付いた。さらに、水溶液中に上記のｐＨバッファを組み込むことにより、コンジュゲートされた担体タンパク質の良好な溶解性が確実になる。好ましくは、この方法では、ヘテロ二官能性架橋剤は、活性化されることとなる配列番号１の－ＮＨ２残基の数と比較して、過剰であり、これにより、露出した－ＮＨ２基の最大活性化が可能となる。

また、好ましくは、エピトープは、配列番号１の－ＮＨ２残基の数と比較して（わずかに、例えば３倍未満）過剰である。ここでも、これにより、最大の一定グラフト化を確実にすることが可能となる。

好ましくは、コンジュゲートされた配列番号１は、アセトニトリルの存在下で、４０％（ｖ：ｖ）未満、理想的には約３０％（ｖ：ｖ）の含量にて溶液中に維持される。これ以外にも、水溶液中に上記のｐＨバッファを組み込むことにより、コンジュゲートされた担体タンパク質（配列番号１）の良好な溶解性が確実になる。これにより、コンジュゲートされた生成物の凍結乾燥の最終工程を実行することが可能となる。

凍結乾燥工程は、有機溶媒（例えばアセトニトリル）が、凍結乾燥を可能にする濃度にて使用されている場合に、特に有利である。

これ以外にも、コンジュゲートされた配列番号１は、有機溶媒の不在下で、例えば上記のバッファ混合液を用いて、可溶化され得る。この場合、凍結乾燥工程は好ましくないが、任意選択である。

これらの種々の仕上げ工程は、配列番号１にコンジュゲートされたこのペプチドを含む医薬組成物に有用である。この（凍結乾燥）組成物は、安定であり、容易に輸送可能であり、かつ長期保存が可能である。

もちろん、本発明は、上記した実施形態に何ら限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載した範囲内のままで、多くの変更が可能である。

実施例１：配列番号１および配列番号２～４のペプチドの合成
配列番号１が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の特定の株の発酵によって得られた。例えば、２０２１年２月２６日出願のベルギー特許出願第２０２１／５１３７号明細書に記載される方法によって、タンパク質（成熟体、配列番号１）が周辺質腔内に分泌されるように配列が修飾された。タンパク質は、濾過およびクロマトグラフィによって、例えば２０２１年２月２６日出願のベルギー特許出願第２０２１／５１３８号明細書に記載される方法によって回収かつ精製される。用いた試薬はいずれも動物起源ではなく、残留エンドトキシンの含量は、臨床用途に適合する。

配列番号２、３、４、および５のペプチドが、固相合成によって得られた。しかしながら、他の合成方法、または発酵方法でも可能である。実際には、ペプチドのＣ末端がポリマー支持体に固定されて、ペプチド鎖が構築されてから、カップリングサイクルを繰り返すことによってＮ末端まで伸長される。組み込まれることとなるアミノ酸のカルボキシ末端は、活性化されてから、樹脂に固定されたペプチドのアミノ末端にカップリングされる。アミノ基は、Ｆｍｏｃ基によって保護され、そして他の潜在的に反応性の官能基は、他の基によって保護される。伸長されることとなるペプチド上にアミノ酸がグラフトされる際には、過剰なアミノ酸を除去して洗浄工程を経た後に、ピペリジンを加えることによってＦｍｏｃ基が切断される。樹脂の切断、およびアミノ酸の側鎖の官能基の脱保護が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによって実行される。

特定の場合において、配列番号２または配列番号４のトリプトファン残基は、アミド－ＴｍｏｂをＴＦＡに加えることによって、インドール基上でアルキル化される。さらに、他の修飾も可能である。

樹脂の切断、脱保護、精製（例えば逆相ＨＰＬＣ）、および濾過（０．４５μｍ）後、ペプチドが、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）およびＨＰＬＣによって分析された。ＨＰＬＣにおける工程は、水（０．１％ＴＦＡ）の、アセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ）との混合、およびＵＶ（２１５および２８０ｎｍ）による検出によって毎回実行される。純度は、９０％超、さらには９５％でなければならない。実際に、本発明者らは、純度９７％のペプチドを得た。

実施例２：グルタルアルデヒドに対するＥＤＣによるカップリング。
本発明者らは、最初に、欧州特許第２００４２１７号明細書に記載される方法を用いてカップリングを実行しようとしたが、ＫＬＨの代わりに配列番号１上にカップリングされることとなる配列番号２および配列番号４のペプチドに使用した。

この種のカップリングは機能するが、実際には満足できるものではない。実際、本発明者らは、得られた分子を濾過によって精製または滅菌するのが困難であり、バッチごとに均一性が欠如していることを観察した。本発明者らが進めた説明の１つは、ペプチドが複数回グラフトされると未修飾タンパク質の親水性が過剰に変換されて、担体タンパク質が下流の処理に使用できなくなるというものである。ゆえに、配列番号１のタンパク質は担体として有用であるが、この有用性は、ペプチドエピトープ、特に疎水性ペプチドエピトープのグラフト化の状況でははっきりしない。

しかしながら、本発明者らは、それにもかかわらず、別のカップリング剤、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（例えばＰｉｅｒｃｅから入手可能）を選択することによってこの困難を克服しようと試みた。これは、カルボキシル基を第一級アミンにカップリングさせる薬剤である。ＥＤＣは、カルボキシル基と反応して、反応性中間体Ｏ－アシルイソ尿素を形成する。この中間体は、アミンと反応しないが、加水分解を受けて、カルボキシル基を再生する。

この目的のために、本発明者らは、カップリングの１工程法およびカップリングの２工程法を開発して、比較した。

１工程法では、グルタルアルデヒドに基づく方法と同様に、担体タンパク質（配列番号１）、ＥＤＣ、および配列番号２または配列番号４のエピトープが、磁気撹拌しながら同じ容器内で一緒にされてから、沈殿物が回収されて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０により精製されてから、凍結乾燥する。

２工程法では、最初にＥＤＣと接触させることによって配列番号１が活性化されてから、配列番号２のエピトープまたは配列番号４のエピトープが加えられて、分離、精製、および凍結乾燥を続ける。

グルタルアルデヒドに関して、反応生成物は、まだ使用不能な凝集体（収率損失と同義）が存在しても使用可能であり、そして配列番号１のかなりの部分が溶液中に残っている（未反応の（または不十分に反応した）タンパク質、すなわち第２の収率損失と同義）。さらに、カップリングの有効性は、バッチごとにかなり異なり、コンジュゲートの溶解度は並程度、または不十分ですらあり、濾過による滅菌をさらに複雑にしている。

１工程法の場合、収率は並程度であった（配列番号２のグラフト化については１２％、配列番号４のグラフト化については３０％）。しかしながら、この収率は、カップリングプロセスが２工程（配列番号４を有する配列番号１）で実行される場合、例えば６０％増大する。モル分布比、配列番号１対配列番号２または配列番号４は、カップリングの１工程法については２未満であり、カップリングの２工程法については２超である。

実施例３：ＧＭＢＳによるペプチドとのタンパク質ＣＲＭ１９７のカップリング。
本発明者らは、２５ｍｇの担体タンパク質ＣＲＭ１９７（配列番号１）を２．５ｍｌの水溶液中に溶解させた。担体タンパク質は、臨床用途に適合するバッチ由来のものであり、エンドトキシン含量は検出限界未満であった。

本発明者らは、１９ｍｇのＳｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ；リファレンス２２３２４；Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスルホスクシンイミドエステル）を秤量してから、２．５ｍｌのコンジュゲーション培地（１００ｍＭの「リン酸緩衝生理食塩水」、ＰＢＳ、および１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、ＥＤＴＡ）および２．５ｍｌの配列番号１の溶液を加えた。この混合液はマグネチックスターラーで４℃にて１時間撹拌される。

本発明者らは、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０カラムでの通過によって、活性化された配列番号１を精製して、２８０ｎｍでの配列番号１の回収をモニターした。

本発明者らは、２８０ｎｍにて吸収ピークを有する画分（タンパク質ＣＲＭ－ＧＭＢＳ）を、配列番号３（２５ｍｇ、ＤＭＳＯ中に溶解）を含有するボトルに移し、これは次にマグネチックスターラーで４℃にて２時間撹拌された。配列番号１と配列番号３との間で形成されるコンジュゲートが沈殿する。遠心分離後、ペレットはアセトニトリル中に溶解される。

本発明者らは、１ｍｌの１Ｍシステインを加えて、３０分間撹拌した。

本発明者らは、反応混合液を５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）チューブに移した。これは遠心分離されて、ペレットは分離されて、水：アセトニトリル混合液（７０：３０ ｗ：ｗ）中に入れられる。

本発明者らは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ５０カラムで精製を実行して、ここでも２８０ｎｍでの吸収をモニターした。

本発明者らは、精製されたコンジュゲートを凍結乾燥した。

上記の工程は全て、後の臨床用途に適合する条件で実行された。次いで、臨床用途を目的とした安定性の研究が実行された。－２０℃および＋５℃の温度にて貯蔵された粉末は、数ヶ月間安定なままである。これは、促進老化（２５℃でのストレス）に少なくとも１４日間耐える（化学的残留物または二次構造のあらゆる分解を評価するための非修飾ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、キャピラリー電気泳動、および赤外線（ＦＴＩＲ）による測定）。

分析は、配列番号１が、配列番号３のペプチドと非常に支配的に反応したことを明らかにする。収率６４％が得られた。良好な収率に加えて、配列番号１対配列番号３のモル比は８よりも大きい。１３の値すら見出され、このカップリング収率について、再現可能に得られた。さらに高い比率も得られたが、カップリング収率を犠牲にし、より低くなる（例えば３６および４７％）。

実際には、ヘテロ二官能性剤とカップリングさせる方法は、とりわけ２工程で実行される場合、１００μｇの配列番号１に対して５０μｇを超えるペプチドのカップリングレベルすら可能にする。

配列番号３または５のいくつかのペプチドを組み込んだ配列番号１（下記参照）は、（例えば電気泳動によって）容易に分化される。というのも、１０個のペプチドが配列番号１の１分子上にグラフトされているならば、その分子量は５８ｋＤａから約７８ｋＤａまで変化するか、またはより多くのペプチドが配列番号１の１分子上にグラフトされている、例えば１分子上に１３もしくは１４個のペプチドがグラフトされているならば、約９０ｋＤａですらあるからである。

実施例４：
同じプロトコルが、配列番号５のペプチドに使用される。配列番号１にカップリングされたペプチドの数と同様に、カップリング収率も優れている。

実施例５：
実施例３のペプチド（１８２μｇ、配列番号３の６０μｇに相当）が、実施例４のペプチド（１８２μｇ、配列番号５の６０μｇに相当）と組み合わされる。アジュバントが、この混合物またはプラセボに加えられる。有効成分またはプラセボは、重症筋無力症（ＭＧ）を患うヒト患者のコホートに二重盲検状態で注射される。実際には、３回の連続注射が実行される（１、５、および１３週目）。次いで、同じプロトコルが、患者の第２のコホートのために設計されるが、さらに多くの活性成分を有する。最後に、処置の長期忍容性および有効性を評価するために、この研究が「オープンラベル」研究として継続される。各注射時に、患者は、いかなる副作用についても綿密に監視され、最初は病院で、次いで自宅で綿密に監視される。免疫原性アッセイ用の血液試料が採取される。

生成されたデータは、良好な忍容性（有効成分は、プラセボよりも多くの副作用を引き起こさない）および処置の有効性があると結論付けることができる。

ゆえに、驚くべきことに、本発明者らは、治療的用途を目的として、配列番号１がペプチドエピトープをカップリングするための良好な担体タンパク質であることを実証した。

Claims (21)

1. いくつかのペプチドエピトープが共有結合的にグラフトされている配列番号１からなるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物であって、前記ペプチドエピトープは、ペプチド結合によって連結された少なくとも７つのアミノ酸の鎖を含む、医薬組成物。
2. 前記いくつかのペプチドエピトープは同一であり、好ましくは、前記ペプチドエピトープは疎水性である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０個のペプチドエピトープが、配列番号１のペプチド上にグラフトされている（ペプチドエピトープモル：配列番号１モル）、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. ２０、１９、１８、１７、１６、１５個未満のペプチドエピトープが、配列番号１のペプチド上にグラフトされている（ペプチドエピトープモル：配列番号１モル）、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記ペプチドエピトープはそれぞれ、配列番号１の－ＮＨ２残基上のレベルにてグラフトされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記ペプチドエピトープは、ヘテロ二官能性架橋剤を介してグラフトされている、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 前記ヘテロ二官能性架橋剤は、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であり、好ましくはスルホ－Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｐｈｏ－ＧＭＢＳ）である、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記ペプチドエピトープは遊離－ＳＨ基を含むか、または遊離－ＳＨ基が天然のペプチドエピトープに加えられている、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記ペプチドエピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端にシステイン残基がグラフトされている、請求項８に記載の医薬組成物。
10. ヒト、イヌ、ウマ、またはラクダ科のメンバーからなる群から選択される患者の免疫化用であり、好ましくは、前記患者はヒトである、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 免疫化が治療目的のためのものであり、好ましくは感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、変性疾患、および癌を処置するためのものである、請求項１０に記載の免疫化用の医薬組成物。
12. ワクチンアジュバント、好ましくはエマルジョン、または１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む水溶液であって、前記水溶液の指定されたｐＨを確実にするようにバッファを含む、水溶液。
14. －遊離－ＳＨ基を含む天然のタンパク質に由来するエピトープと、
    －－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤、好ましくはカップリング剤Ｓｕｌｆｏ－ＧＭＢＳと、
    －配列番号１と
    を含むキットであって、
    天然のタンパク質に由来する前記エピトープは、ペプチド結合によって連結された少なくとも７つのアミノ酸の鎖を含む、
    キット。
15. ワクチンアジュバント、好ましくはエマルジョン、または１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
16. ペプチドエピトープを担体タンパク質にカップリングさせる方法であって、
    －遊離－ＳＨ基を含むペプチドエピトープを特定し、かつ／または遊離－ＳＨ基が加えられているペプチドエピトープを特定する工程と、
    －配列番号１である前記担体タンパク質を得る工程と、
    －前記担体タンパク質を、－ＮＨ２基および－ＳＨ基に対して反応性であるヘテロ二官能性架橋剤によって活性化して、前記配列番号１の複数の－ＮＨ２基を、前記ヘテロ二官能性架橋剤と反応させる工程と、
    －活性化された前記担体タンパク質を、組み込まれていない前記架橋剤から分離する工程と、
    －活性化された前記担体タンパク質を、特定された前記ペプチドエピトープと接触させて、前記ペプチドエピトープの前記－ＳＨ基を、前記架橋剤によって活性化された前記担体タンパク質と反応させる工程と、
    －未反応基質および反応副生成物の前記ペプチドエピトープのいくつかにカップリングされた前記担体タンパク質を分離する工程と
    を含み、
    －前記ペプチドエピトープは、ペプチド結合によって連結された少なくとも７つのアミノ酸の鎖を含む、
    方法。
17. 前記ヘテロ二官能性架橋剤は、活性化されることとなる配列番号１の－ＮＨ２残基の数と比較して、過剰である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記エピトープのいくつかにカップリングされた前記担体タンパク質を、バッファを含む水溶液中に溶解させて、前記水溶液の指定されたｐＨを確実にする工程をさらに含み、好ましくは、前記水溶液は、アセトニトリルを、好ましくは１０％～５０％（アセトニトリル：水；ｖ：ｖ）、例えば４０（容量）％未満、例えば約３０：７０（アセトニトリル：水；ｖ：ｖ）、含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. いくつかのペプチドエピトープにカップリングされた前記担体タンパク質を凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるコンジュゲートペプチドを含む医薬組成物。
21. 好ましくはエマルジョンから選択されるワクチンアジュバント、および１つ以上のＣｐＧ単位を含むオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。