CN107073167A - 灭菌的热凝胶组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物包括壳聚糖，所述壳聚糖具有N‑乙酰基葡萄糖胺单元、葡萄糖胺单元、以及不是N‑乙酰基葡萄糖胺单元的取代的葡萄糖胺单元，以取代基的摩尔数相对于全部单元的摩尔数来表示，所述取代的壳聚糖优选具有10％至50％的葡萄糖胺单元的取代度。本发明还涉及该组合物的生产以及其应用。

Description

灭菌的热凝胶组合物

技术领域

本发明涉及一种灭菌的热凝胶组合物。更具体地，本发明涉及蒸汽灭菌的组合物，并且涉及用于制备该组合物的灭菌方法，以及其应用，尤其是在医学领域中的应用或者用于注射至人体或动物体。

背景技术

推荐的是，对必须与人体或动物体接触的器具、样品或其它装置进行灭菌。为了在工业上实现这种灭菌，有利地是利用蒸汽来进行灭菌。

然而，在一定数目的特定情况下，蒸汽灭菌是不合适的。尤其存在以下情况：需要被灭菌的元件并不能承受温度的升高、蒸汽的存在，或进一步地，如果灭菌的元件在灭菌条件下发生变化，从而该元件不再适用于目标应用。

根据专利EP 2361640，已知的是，基于壳聚糖的热凝胶组合物不能用蒸汽进行灭菌，具体是由于此种灭菌影响水凝胶的结构和功能特性，进而影响组合物的凝胶化能力或返回其起始流体形式的能力。因此，并不推荐使用这种蒸汽灭菌来对壳聚糖及其衍生物的水凝胶进行灭菌。Jarry等人(Effects of steam sterilization on thermogellingchitosan-based gels.J Biomed Mater Res(Appl Biomater),2011,58,127-135)教导了对壳聚糖溶液进行初步灭菌，以及之后加入自身已被单独灭菌的水凝胶的其它化合物，诸如β甘油磷酸钠。该灭菌过程并不影响最终产品，但是必须无菌地进行溶液的混合，这从工业观点来看是不利的。因此，在专利US 6344488中并不推荐利用蒸汽来对壳聚糖的热凝胶组合物进行灭菌，因为凝胶是热敏感的。因此，在加入凝胶剂之前，用蒸汽对壳聚糖的溶液进行灭菌。Chengdong Ji等人描述了在甘油磷酸盐的存在下，对壳聚糖进行灭菌(Sterilization-free chitosan hydrogels for controlled drug release,MaterialsLetters,2012,72,110-112)，但是未研究机械性质。不能确定由此灭菌的壳聚糖凝胶是否可以用作药物载体之外的应用，尤其是需要特定流动性质和/或机械性质时。Jarry等人(Irradiating or autoclaving chitosan/polyol solutions:effect on thermogellingchitosan-β-glycerophosphate systems,Chem Pharm Bull,2002,50(10),1335-1340)也研究了用蒸汽进行灭菌对壳聚糖凝胶的影响。他们暗示了某些多元醇的潜在益处。这些热凝胶组合物的pH小于7.2。最后，专利US 6344488提出这些壳聚糖的热凝胶组合物(“热凝胶”)的溶胶-凝胶转变在高于6.9的pH下是不可逆的。这些溶胶-凝胶转变是不可逆的热凝胶具有的不足为：在实践中不能通过升高温度或利用蒸汽来灭菌，从而这些组合物在使用前不能进行凝胶化。因此这是一个主要的不足。

发明内容

本发明的目的是解决这些技术问题。

具体地，需要提供一种灭菌的热凝胶组合物，该灭菌的热凝胶组合物在人类或动物的生理温度下凝胶化，具有用于治疗性应用或美容美体应用的良好的物化性质。

本发明的目的特别是提供一种灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物易于注射，同时能够在人类的生理温度下凝胶化。这种灭菌的组合物应当具有尤其在生理温度37℃下用于治疗性应用或美容美体应用的良好的物化性质。更具体地，这种灭菌的组合物应当能够具有可根据目标应用进行调节的粘弹性质，从而尽可能地接近目标治疗性目的或美容美体目的所需的性质。

本发明的目的还在于提供一种灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物的pH对于目标治疗性应用或美容美体应用是可接受的。更具体地，这种灭菌的组合物应当能够具有可根据目标应用调节的pH，尤其从而能够尽可能地接近生理pH。

本发明的目的还在于提供一种灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物的同渗容摩与目标治疗性应用或美容美体应用的生理同渗容摩相近，所述热凝胶聚合物具有尤其是范围在100mosm/kg至700mosm/kg之间，且尤其是200mosm/kg至500mosm/kg(还被写作“mosmol/kg”)之间的渗透度(osmolality)。

根据替代方式，本发明的目的还在于提供一种灭菌的组合物，所述灭菌的组合物的溶胶-凝胶转变是可逆的，尤其为了在储存和/或运输条件下并不需要严格控制温度，和/或为了使所述组合物可利用蒸汽或甚至若干次蒸汽灭菌循环来进行灭菌。

本发明的目的进一步在于提供一种组合物，所述组合物可用作粘弹性补充剂，并且尤其能够被注射至滑液，或者与滑液混合。本发明的目的尤其在于提供一种重建的滑液，即，使接合处的性质恢复的组合物，尤其通过使该组合物具有在运动期间吸收冲击的能力且至少在静止时润滑的能力。

本发明的目的进一步在于提供一种组合物，所述组合物在与滑液的混合液中，且尤其在与人类的滑液的混合液中具有良好的性质。有利地，本发明的目的在于提供一种组合物，所述组合物在炎性环境下尤其对静止时弹性模量G’和粘性的保持方面具有良好耐降解性。

令人惊喜的是，本发明能够解决上述提及的一个或若干个问题。

令人惊喜的是，发现当组合物包括壳聚糖时可制备这种组合物，其中，所述壳聚糖具有N-乙酰基葡萄糖胺单元、葡萄糖胺单元、以及不是N-乙酰基葡萄糖胺单元的取代的葡萄糖胺单元，以取代基的摩尔数相对于全部单元的摩尔数来表示，所述取代的壳聚糖优选地具有范围在10％至50％之间的葡萄糖胺单元的取代度。

根据具体实施方式，所述葡萄糖胺单元为D-葡萄糖胺单元(D-葡萄糖胺单元、取代的D-葡萄糖胺单元、N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元以及可选地取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元)。

根据替代方式，所述壳聚糖具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元、D-葡萄糖胺单元，以及不是N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的D-葡萄糖胺单元，以及可选地，取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元。

“不是N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的取代的D-葡萄糖胺单元”是指在取代后该取代的D-葡萄糖胺单元并不形成N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元。

根据替代方式，取代的壳聚糖仅具有D-葡萄糖胺单元的取代。

根据另一替代方式，取代的壳聚糖同时具有D-葡萄糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的取代，并且其中，根据替代方式，所述取代基团仅共价结合至壳聚糖的氨基，或者根据另一替代方式，所述取代基团同时共价结合至壳聚糖的氨基和羟基。

根据实施方式，以D-葡萄糖胺单元的摩尔数相对于取代的壳聚糖的全部单元的摩尔数(取代的或未取代的D-葡萄糖胺和取代的或未取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元)来表示，D-葡萄糖胺单元的取代度范围在0.1％至0.5％。

根据特定替代方式，发现，可选地在凝胶剂的存在下，例如多元醇或糖盐，并且更具体地甘油磷酸盐的存在下，以葡萄糖胺单元(在该葡萄糖胺单元上，取代基团通过共价键连接)的摩尔数相对于取代的壳聚糖的葡萄糖胺和N-乙酰基-葡萄糖胺单元的总摩尔数表示的葡萄糖胺单元的取代度在0.1至0.5范围时能够有利地使取代的壳聚糖在尤其适用于目标应用的pH和温度的范围下溶解。更简单地，可通过起始试剂相对于壳聚糖的摩尔比或质量比来表示取代度，下文将对此进行阐述。

根据替代方式，取代的壳聚糖由于其取代度而在例如用磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲至pH 7的水溶液中是可溶的，该溶液包括相对于总溶液质量的1质量％取代的壳聚糖浓度，且pH在8℃下测量。

根据替代方式，尤其当取代的壳聚糖具有两性性质时，存在取代的壳聚糖不溶的窄pH范围。根据现有技术，通过加入凝胶剂，例如多元醇或糖盐，更具体地甘油磷酸盐来避免这种特殊情况，从而取代的壳聚糖在本发明所关注的相关pH下是可溶的。

通过取代壳聚糖，能够制备溶解于pH在宽范围内变化的水性溶液中的取代的壳聚糖的溶液，而未取代的壳聚糖仅在低于5.5至6.5的pH下可溶。取代的壳聚糖的水性溶液可通常具有范围在6.5至8.5之间的pH。根据本发明，该溶液是可凝胶化的。因此，溶胶-凝胶转变或凝胶化可在中性pH或在生理pH，诸如介于7和8.5之间的pH下实现，而壳聚糖在pH 7下是不溶的，氨基的pKa为约5.5(并且因此氨基在pH 7下不能质子化，从而不带电荷)。因此，在改变壳聚糖的溶解曲线的取代基的存在下，取代的壳聚糖具有在不同pH下溶解的能力。令人惊喜地，能够制备这样的热凝胶组合物：该热凝胶组合物具有取代的壳聚糖，并且尤其具有低浓度壳聚糖，尤其具有非常低浓度、低或平均分子量的壳聚糖，同时具有可逆的溶胶-凝胶转变，或者所得凝胶的性质适用于预期应用，尤其用作滑液的粘弹性补充剂。这种包括取代的壳聚糖的组合物当温度升高时具有溶胶-凝胶转变。因此，可根据取代度以非常有利的方式调控溶胶-凝胶转变，即，从流体状态的溶液转变为凝胶状态，从而尤其在所需的pH、渗透度和温度的条件下发生溶胶-凝胶转变。因此，根据替代方式，本发明有利地能够在低于使用温度下，尤其在低于生理温度(例如37℃)的温度下，制备流体热凝胶组合物，而该热凝胶组合物在使用温度，通常在生理温度(例如37℃)下，在中性pH(pH 7)或在生理pH，并且例如pH 7至8.5下为凝胶，且具有用于预计应用的合适的渗透度。这例如为生理渗透度。

根据另一替代方式，本发明涉及一种热凝胶组合物，所述热凝胶组合物在使用前，通常在室温条件下，并且例如在储存温度(例如4℃至8℃)下为凝胶，并且在使用温度下，通常在生理温度(例如37℃)下，在中性pH(pH 7)或在生理pH，并且例如pH 7至8.5下，具有用于预计应用的渗透度。这例如为生理渗透度。

“热凝胶组合物”或“热凝胶”是指这样的流体，尤其是这样的溶液：通过温度的变化，尤其是通过升高温度，并且进一步优选地通过将温度升高至人体或动物体的生理温度，而具有进行溶胶-凝胶转变的性质，从而在注射或植入后在生理温度下呈现为凝胶。本发明的热凝胶组合物可呈现为水凝胶，即，水性凝胶。

根据本发明，“凝胶”是指这样的组合物：该组合物在其自身重量下不流动，并且更具体地在没有将容纳有该组合物的容器上下倒置例如30秒的外部刺激的情况下，也不显示出任何的流动，并且特征在于弹性模量G’大于损耗模量G”，上述模量使用具有“库爱特(Couette)”几何结构的流变仪或具有平面几何结构的流变仪在低振幅振荡模式扫描下(例如，“Discovery Hybrid DHR-2”流变仪，TA仪器)通过流变学进行测量。凝胶的模量G’和模量G”之间的差别是凝胶的内聚力特性。

根据本发明，“流体”是指这样的组合物：在容纳有该组合物的容器上下倒置例如30秒时，其在自身重量下能够流动，并且特征在于弹性模量G’小于损耗模量G”，上述模量使用具有库爱特剪切(在两个同轴圆筒之间进行流体的剪切)的旋转流变仪通过流变学进行测量。

有利地，据发现，D-葡萄糖胺单元的取代度提供了调控溶胶-凝胶转变的可能性。特别地，发现D-葡萄糖胺单元的取代度能够使得在无任何凝胶剂(例如甘油盐)下形成热凝胶组合物。因此，本发明有利地给出了提供这样的热凝胶组合物的可能性：在所述热凝胶组合物中，选择壳聚糖的最小取代度使得取代的壳聚糖在所述热凝胶组合物中是可溶的。还能检测在不同缓冲液中的溶解度。“在水中可溶”是指取代的壳聚糖不具有肉眼可见的任何浊度。更特别地，通过紫外可见光谱仪在600nm波长下对包括水(可选地用相关pH的缓冲液进行缓冲，例如0.5M的乙酸钠)的样品进行测量，参比仅包括测量样品所使用的水性溶剂而不存在取代的壳聚糖的参比池，能够证实不存在浊度，光密度小于0.5且优选小于0.2。当壳聚糖未被充分取代时，组合物在室温下在令人满意的pH范围内，例如pH＝7至pH＝8.5的范围内是不溶的，并且因此也不能在温度升高时发生热凝胶化。

本发明给出了提供这样的热凝胶组合物的可能性：在所述热凝胶组合物中，选择壳聚糖的最大取代度，从而使得在低于使用温度，优选低于生理温度，例如低于37℃的温度下进行溶胶-凝胶转变。根据本发明所限定的方法，通过模量G’和模量G”的交叉(crossover)来确定溶胶-凝胶转变。

有利地，通过磁共振光谱仪，例如频率400MHz的布鲁克(Bruker)光谱仪，通过在水性介质中的溶液中的质子的核磁共振光谱(NMR)来确定取代度。通过以下方式来制备样品：将5mg至6mg的取代的壳聚糖溶解在1ml的氘化水中。将2μl浓度为12M的氘化盐酸加入到取代的壳聚糖的溶液中以得到用于分析的合适的pH范围。合适的pH范围取决于取代基的性质。在70℃的温度下，扫描次数在64至256范围内以及弛豫时间为1至8秒下记录光谱。所得到的光谱通过解卷积来处理以确定兴趣信号的面积的积分值，从而能够计算取代的壳聚糖的取代度。

由于制备样品的方法、记录NMR光谱的条件以及用于计算取代度的公式取决于取代基的性质和位置，所以上述方法、条件和公式应当适用于每种类型的取代的壳聚糖。

以下给出了对于取代有结合至D-葡萄糖胺单元的氨基的琥珀酰基的壳聚糖(壳聚糖琥珀酰胺，式1)的情况下，计算取代度(DS)的实例。缩写如下：I_H2等于D-葡萄糖胺单元2位上的质子信号的面积的积分；I_{CH2琥珀酰基}等于结合至D-葡萄糖胺单元的琥珀酰基取代基的两个-CH₂基团的质子信号的面积的积分(在氨基官能团的α位和β位的碳原子上)；I_CH3乙酰基等于N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的乙酰基的质子信号的面积的积分。

在图1中示出了壳聚糖琥珀酰胺的NMR光谱实例和壳聚糖琥珀酰胺的结构式。

式1-通过质子NMR计算取代有琥珀酰基的壳聚糖的取代度。

如果其它NMR方法能够以可行的方式更有利地估算取代度，则应当使用此种方法。本领域技术人员应该根据样品的制备以及待积分的信号，尤其取决于分辨率、鲁棒性以及待用于计算取代度的质子信号的位置来调整上式。

有利地，所述组合物具有热可逆的溶胶-凝胶转变。

有利地，本发明给出了提供具有低浓度的取代的壳聚糖的组合物的可能性。

有利地，基于组合物的总质量，壳聚糖的浓度小于4质量％，例如小于3质量％，或进一步例如小于2质量％(m/m)。

根据特定的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度小于1.9质量％(m/m)。有利地，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度介于0.5质量％和1.5质量％(m/m)之间。根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约1.2质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约2.5质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约2.0质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约1.5质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约1.3质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约1.1质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约1.0质量％(m/m)。

根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量，取代的壳聚糖的浓度为约0.9质量％(m/m)。

此外，D-葡萄糖胺单元的取代度有利地给出了不使用酸性pH(通常为5.0至5.5)的溶液来使壳聚糖溶解，并且无需加入糖或多元醇盐，如甘油磷酸盐来使pH增加至约7的可能性。另一方面，本发明有利地给出了直接制备具有中性pH或生理pH，诸如pH 6.2至8.5的溶液的可能性，在该溶液中，取代的壳聚糖是可溶的，并且因此有利地例如无需加入酸性溶液来使壳聚糖溶解。这具有如下优点：确保了对用于该热凝胶组合物的pH范围的更大的自由度，并且由此在中性pH或生理pH下制备热凝胶组合物。例如，能够使用缓冲剂(酸或碱)来调节pH。例如，可使用碱性缓冲液，并且随后可使用弱酸来调节热凝胶组合物的pH。

根据有利的替代方式，热凝胶组合物并不包括任何的凝胶剂。根据该替代方式，热凝胶组合物在仅存在取代的壳聚糖的情况下就具有凝胶化性质。具体地，根据该替代方式，组合物并不包括本发明中所限定的凝胶剂。具体地，根据优选的替代方式，本发明的热凝胶组合物并不包括任何的甘油盐，并且尤其不包括甘油磷酸盐(glycerol phosphate salt)(还被写为“甘油磷酸盐glycerophosphate”的形式)。该替代方式给出了避免甘油磷酸盐或任何其它等同凝胶剂存在的可能性，其对凝胶的技术效果仅在于机械性。根据该替代方式，优选地避免使用如凝胶剂的化合物，该化合物无任何治疗益处，而且与治疗受试者的身体也没有任何生物/化学性质的相互作用。

根据替代方式，组合物包括凝胶剂，优选地包括诱导组合物的溶胶-凝胶转变的凝胶剂，例如，甘油磷酸盐，例如为钠盐或钙盐形式，例如为其五水合物的形式；基于最终组合物的总质量，优选地所述凝胶剂在组合物中的浓度介于1质量％和20质量％之间，优选介于3质量％和9质量％(m/m)之间。

凝胶剂有利地为至少一种多元醇或糖盐，包括它们任意的混合物。

在多元醇或糖盐之中，特别可提及的是磷酸盐，并且更尤其是多元醇或糖的二碱单磷酸盐。还可提及的是硫酸盐，诸如例如多元醇或糖的单硫酸盐。在磷酸盐之中，特别可提及的是甘油二碱单磷酸盐，包括甘油-2-磷酸盐、sn-甘油-3-磷酸盐和1-甘油-3-磷酸盐。根据替代方式，此为β-甘油磷酸盐。在用于这些盐的多元醇和糖中，可提及下列多元醇和糖：组氨醇、丙酮醇、己烯雌酚、吲哚甘油、山梨醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤藓糖醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖醇、棕榈酰甘油、亚油酰甘油、油酰甘油、花生四烯酰甘油、果糖、半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、山梨糖、赤藓酮糖、脱氧核糖、酮糖、甘露糖、阿拉伯糖、墨角藻糖、吡喃果糖、酮葡萄糖、景天庚酮糖、海藻糖、塔格糖、蔗糖、阿洛糖、苏糖、木酮糖、己糖、甲硫基核糖或甲硫基-脱氧-核酮糖，或它们的任何混合物。

根据特定替代方式，多元醇或糖盐的浓度，且优选地甘油盐的浓度介于1％和10％之间。有利地，多元醇或糖盐的浓度，且优选地甘油盐的浓度介于1％和7％之间。有利地，多元醇或糖盐的浓度介于2％和5％之间。上述值基于组合物的总质量以质量来表示。

根据替代方式，甘油盐为甘油磷酸盐，并且更特别地为钠盐，诸如例如甘油磷酸二钠。

多元醇或糖盐，且优选地甘油磷酸盐用于使pH呈碱性pH，并且随后通过加入酸来调节组合物的pH，从而有利地提供了能够非常容易且准确地调整pH的热凝胶化合物。

当热凝胶组合物并不包括任何凝胶剂时，可通过酸，例如弱有机酸或强无机酸(盐酸)来调节pH。可用于调节组合物pH的弱有机酸例如为乙酸或谷氨酸。

因此，根据本发明的组合物所具有的pH大于或等于7，例如大于或等于7.1，例如具有7.2至8.5的pH。

pH是对溶液形式的最终热凝胶组合物，即，在溶胶-凝胶转变之前测量的。根据欧洲药典(EP 2.2.3)中所述的方法来确定pH。所使用的pH酸度计为设置有组合玻璃电极的Sartorius系列的pH计(PY-P11)。pH的测量在20℃和25℃之间进行。

有利地，能够在6.5至8.0的宽范围内调节pH。

根据替代方式，pH大于7.40。

根据特定替代方式，pH为7.50+/-0.05。

根据另一特定替代方式，pH为7.20+/-0.05。

根据另一特定替代方式，pH为7.00+/-0.05。

根据优选的替代方式，在30℃以上的温度下，优选在介于30℃和50℃之间的温度下，并且优选在32℃和45℃之间的温度下，且进一步优选在35℃和40℃之间的温度下，本发明的组合物具有溶胶-凝胶转变。

有利地，本发明的热凝胶组合物在室温下(即，在20℃和25℃之间的温度下)处于流体的形式。

根据优选的实施方式，在37℃以下的温度下，优选在35℃以下的温度下，且更优选在介于2℃至20℃之间的温度下，本发明的组合物为流体。根据替代方式，在储存温度下，例如在2℃至8℃的温度下，本发明的组合物为流体，或者在延伸的室温下，例如在15℃至30℃的温度下，本发明的组合物为流体。

根据替代方式，本发明的热凝胶组合物在0℃以上的温度下为流体，在大于或等于10℃的温度下为凝胶。根据另一替代方式，本发明的组合物在0℃以上的温度下为流体，在大于或等于5℃的温度下为凝胶。

根据实施方式，组合物具有100mosm/kg至700mosm/kg，优选200mosm/kg至650mosm/kg，例如200mosm/kg至600mosm/kg，或进一步例如200mosm/kg至550mosm/kg，优选200mosm/kg至500mosm/kg的渗透度。渗透度可用mosm/L来表示，但这种情况下被称为同渗容摩。当组合物为水性组合物时，密度约为1，则渗透度基本上等于同渗容摩，如本发明的组合物。

根据替代方式，根据本发明的热凝胶组合物是等渗的。

根据替代方式，当本发明的组合物用于注射至人类的血浆中时，优选地，渗透度介于250mosm/kg和400mosm/kg之间，并且更特别地介于280mosm/kg和350mosm/kg之间。

根据另一替代方式，当本发明的组合物用于注射至人类的滑液中时，优选地，渗透度介于300mosm/kg和490mosm/kg之间，并且更优选地介于360mosm/kg和470mosm/kg之间。

溶液的渗透度的确定通过自动微量渗透压计(Messtechnik品牌的15M型渗透压计(Osmometer Type 15M))来实现。预先用300mosm/kg的溶液来校正该件仪器。将样品放置在用于该目的的容器中，并且设定为标准测量温度。

有利地，本发明的热凝胶组合物在流体状态下，具有介于20mPa.s和800mPa.s之间，例如40mPa.s至500mPa.s之间的动态表观粘度。

动态表观粘度在8℃的温度下，由例如Brookfield品牌的具有转动子的粘度计，例如设置有S18型的转子，在5rpm的速度下测量。

根据替代方式，本发明的组合物所具有的表观粘度能够使得在填充该组合物期间在注射装置中，诸如注射器中容易地注射。根据替代方式，本发明的组合物所具有的表观粘度能够使得其通过细针，例如22号注射器在室温下容易地注射。“容易地”注射优选地是指为了使热凝胶组合物流过22号的针而施加在注射器上的力小于50牛顿，优选小于20牛顿。

根据本发明的热凝胶组合物可稀释例如在水中(可选地缓冲的水)。例如，能够将本发明的组合物稀释在能够将pH调节至生理pH的缓冲液中。更具体地，例如能够将本发明的组合物稀释在乙酸盐缓冲液中(例如，10mM的乙酸钠三水合物缓冲液)以将pH调节至约7.5。

对于凝胶，模量G’大于模量G”。对于溶液，模量G’小于模量G”。溶胶-凝胶转变的特征在于G’模量和G”模量的交叉。

当溶液具有“热凝胶化”的能力时，在超过特定温度时，并且尤其在低于生理温度的温度(即，注射或植入该产品的温度)时，或者在生理温度下植入或注射至身体后的一定时间后，模量G’变得大于模量G”。

当温度升高时，模量G’和模量G”交叉。

模量G’和模量G”例如通过具有对两个同心圆筒之间的流体施加剪切的库爱特剪切的转动流变仪，例如Rheometrics牌的流变仪ARES在例如1Hz的频率和5％的形变下进行测量。模量G’和模量G”的测量可在特定温度下进行。本文中给出的模量的测量始于在特定温度下，例如在4℃的产品储存温度下的产品。随后，使产品自然地达到特定温度，例如生理温度，例如37℃，而不控制温度升高的速率。

有利地，储存模量G’介于0.001和1000之间，损耗模量G”介于0.001和1000之间，在生理温度下，例如37℃下，在凝胶化后，G’大于G”。

根据替代方式，有利地，储存模量G’介于0.001和1000之间，损耗模量G”介于0.001和1000之间，在储存温度和/或室温下，G’小于G”，在生理温度下，例如37℃下，在凝胶化后，G’大于G”。

有利地，当产品从冰箱的储存温度(例如2℃或4℃)或从室温(例如18℃至25℃)升温至生理温度(例如37℃)时，储存模量G’与损耗模量G”交叉，表明了溶胶-凝胶转变以及体系的热凝胶化性质，其中溶胶-凝胶转变持续时间适用于目标应用。

通过将壳聚糖溶液在足够的温度下维持足够的时间以使其凝胶化可实现凝胶化。该凝胶化例如在例如维持在40℃的烘箱中进行。根据替代方式，本发明的热凝胶组合物在15℃的温度下处于凝胶的形式。根据本发明，例如，在注射至人体或动物体(热血动物)后，凝胶化可在原位发生。凝胶化尤其给出了以局部方式定位凝胶的可能性。

更具体地，在从2℃或4℃的温度(储存温度)升温至37℃(生理温度)之后，即，例如在将该溶液注射至人体或动物体之后，原位发生溶胶-凝胶转变所需的时段通常介于1秒和48小时之间。

根据替代方式，从2℃或4℃的温度升温至37℃之后在持续5秒至24小时，优选持续小于4小时，进一步优选持续小于2小时之后，完成溶胶-凝胶转变。

根据另一替代方式，凝胶化瞬间发生(一旦温度升高(并且在测量之前)便发生凝胶化)。

根据替代方式，热凝胶组合物处于凝胶化的形式。例如，本发明的组合物以凝胶化的形式储存在注射器中。

根据替代方式，组合物在注射器中不应凝胶化，而是应当在所需位置原位发生凝胶化。由于根据本发明的组合物有利地具有可逆的溶胶-凝胶转变，因此能够进行若干次溶胶-凝胶转变循环。这有利地允许了通过升高温度，即通常利用高压灭菌锅来对根据本发明的组合物进行灭菌。这有利地给出了提供这样的热凝胶组合物的可能性：该热凝胶组合物提供了尤其在储存、运输或灭菌期间温度的改变不会影响发生凝胶化的可能性。

由于根据本发明的组合物尤其用于注射，故此其凝胶化性质适用于经由根据目标应用设置有可变尺寸(例如19号至30号，例如22号)的针的注射器来进行注射。通常，进行注射的人必须手动按压注射器的活塞。因此，未凝胶化流体的耐压缩性必须能够使注射尽可能地容易。一经注射，组合物应该凝胶化，从而具有所需的粘弹性性质。

根据替代方式，使流体组合物在22号针的孔口中流动所需的力介于1牛顿和20牛顿之间。优选地，该力介于2牛顿和15牛顿之间。根据替代方式，该力介于2牛顿和8牛顿之间。

根据替代方式，使流体组合物在25号针的孔口中流动所需的力介于2牛顿和15牛顿之间。根据替代方式，该力介于2牛顿和10牛顿之间。

根据替代方式，使流体组合物在27号针的孔口中流动所需的力介于1牛顿和20牛顿之间。优选地，该力介于2牛顿和15牛顿之间。根据替代方式，该力介于2牛顿和10牛顿之间。可注射性通过用于测量机械性能例如Instron Bluehill牌的测试台来测量，该测试台设置有500N的测压元件。注射系统特别设计用于测量通过推动注射器的活塞而实现溶液注射所需的力，其中，注射器设置有所需直径的针。该系统具有设置有4cm宽的垂直狭缝的15cm高的金属圆筒。该圆筒的顶部覆盖有边长为10cm的正方形金属板。该板在其中间设置有孔，该孔的半径为0.5cm。设置有22号直径的针的注射器设定为4℃的温度。向注射器的活塞施加每秒1mm的恒定向下速度。

根据替代方式，组合物包括缓冲液，例如乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

缓冲剂是本领域技术人员所知晓的。

优选地，组合物包括还原糖，例如甘露醇或山梨醇。

根据替代方式，本发明涉及一种热凝胶组合物，所述热凝胶组合物包括：0.1质量％至5质量％的取代的壳聚糖；并且优选1％至7％的多元醇或糖盐，例如甘油磷酸盐；以及可选地1％至10％的还原糖。有利地，本发明的组合物包括：基于该组合物的总质量，0.1质量％至1.9质量％的取代的壳聚糖；2质量％至6质量％的甘油，优选甘油磷酸盐；以及可选地0.1质量％至2.5质量％的还原糖。

根据替代方式，本发明涉及一种热凝胶组合物，所述热凝胶组合物包括：0.1质量％至5质量％，且优选0.5质量％至2.5质量％的取代的壳聚糖；可选地0.1％至10％的还原糖；以及可选地0.1％至5％且优选0.5％至2.5％的透明质酸。有利地，本发明的组合物包括：基于该组合物的总质量，0.1质量％至2.5质量％的取代的壳聚糖；可选地0.1质量％至2.5质量％的还原糖；以及可选地0.1％至5％且优选0.5％至2.5％的透明质酸，所述组合物优选地不具有任何的甘油或甘油盐。

有利的是，在本发明的组合物中使用至少一种多元醇(除了如果存在的例如甘油磷酸盐的多元醇盐之外)。

这样的多元醇可例如选自由以下项所组成的组：异丙醇；山梨醇；甘露醇；亚烷基二醇，如丙二醇；聚(烷基二醇)，例如聚(乙二醇)；果糖；半乳糖；核糖；葡萄糖；木糖；鼠李糖；山梨糖；赤藓酮糖；脱氧核糖；酮糖；甘露糖；阿拉伯糖；墨角藻糖；吡喃果糖；酮葡萄糖；景天庚酮糖；海藻糖；塔格糖；蔗糖；阿洛糖；苏糖；木酮糖；己糖；甲硫基核糖；甲硫基-脱氧-核酮糖及它们的任何混合物。

根据特定替代方式，能够进行取代的试剂是琥珀酸酐。根据该特定替代方案，取代的壳聚糖是壳聚糖琥珀酰亚胺，即，壳聚糖和琥珀酰基共价结合至D-葡萄糖胺单元的氨基的氮原子上。

根据涉及壳聚糖和取代试剂的反应来对壳聚糖进行修饰，其中，壳聚糖与取代试剂进行反应以得到在D-葡萄糖胺基团上取代的壳聚糖。

本发明还涉及用于制备取代的壳聚糖的方法。

该方法特别包括：

优选地通过将pH调节至壳聚糖是可溶的酸性pH，使壳聚糖溶解在水性溶液，尤其是溶解在水中的步骤；

使壳聚糖与取代试剂发生取代反应的步骤；

用于停止取代反应的步骤，优选地以取代基的摩尔数相对于全部单元的摩尔数来表示，壳聚糖的取代度在10％至50％的范围内时，例如，通过调整反应介质的pH，或者通过使壳聚糖沉淀在“非溶剂”中来停止取代反应，其中，在该非溶剂中，取代的壳聚糖是不溶的；

纯化取代的壳聚糖。

“非溶剂”是指在其中取代的壳聚糖是不溶的，即，肉眼能够观察到浊度。这样的溶剂例如是极性溶剂，例如乙醇、甲醇、丙酮等。

使壳聚糖溶解在水性溶液中的步骤可通过将合适的酸加入到水中来实现。

在反应步骤中，取代试剂的量可根据取代的壳聚糖的所需取代度来进行调整。在反应步骤中，反应时间可根据取代的壳聚糖的所需取代度来进行调整。有利地，根据取代的壳聚糖的所需取代度来停止反应以终止壳聚糖的取代反应。

已知的是，存在不同的反应来用于壳聚糖的取代。例如可参见申请WO 2010/142507，尤其涉及壳聚糖衍生物的制备。

取代的壳聚糖可包括D-葡萄糖胺和N-乙酰基-葡萄糖胺单元，其中，至少一些单元接枝(或连接)至相同或不同的一个或若干个官能团。

根据替代方式，取代的壳聚糖包括葡萄糖胺单元和N-乙酰基-葡萄糖胺单元，所述单元包括一个或若干个官能团。化学修饰可例如通过与N-乙酰基-葡萄糖胺单元的一个或若干个官能团，即，羟基官能团和/或氨基官能团，和/或葡萄糖胺单元的一个或若干个官能团，即，羟基官能团和/或氨基官能团结合来进行。

根据具体的实施方式，存在于取代的壳聚糖上的官能团选自包括但不限于疏水性官能团、亲水性官能团、离子官能团以及它们的任何组合的组。根据具体的替代方式，疏水性官能团选自由烷基、烯基、芳烷基、烷芳基和它们的任何组合所组成的组。这些基团通常包括1至100个碳原子，并且更通常包括1至50个碳原子，例如1至25个碳原子，或进一步1至10个碳原子；一个或多个碳原子可例如被杂原子替代和/或选自硼、氮、氧、硫、硅、锗、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯官能团或它们的任何组合所替代，并且其中，一个或多个氢原子可例如被杂原子替代和/或选自由卤素原子、烷氧基、酰胺基和它们的任何组合所组成的组的原子所替代。

根据另一实施方式，疏水性官能团选自由羧酸、有机磺酸、聚醚、胺聚醚、聚酯、固醇、卟啉及它们的任何组合所组成的组。

根据另一替代方式，亲水性官能团选自由二胺、多胺、二醇、多元醇、二酸、多元酸、冠醚、甘醇二甲醚、聚烯烃醚、聚烯烃胺、聚烯烃醚胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇及它们的任何组合所组成的组。

根据另一具体替代方式，离子官能团选自由金属盐、铵盐、鏻盐、硫酸盐、羧酸盐、磷酸盐、羧二酸、多元羧酸、用于与壳聚糖形成共价键的羧酸官能团、二胺、多胺、用于与壳聚糖形成共价键的胺官能团，以及它们的任何组合所组成的组。

根据具体替代方式，取代壳聚糖的官能团为氨基烷基。例如，取代壳聚糖的官能团为氨基乙基。

根据替代方式，取代的壳聚糖为：

氨基-烷基壳聚糖，诸如氨基-乙基壳聚糖等，以及它们的等同物；

疏水化的N-烷基壳聚糖或O-烷基壳聚糖，诸如例如，乙酰基壳聚糖、丙酰基壳聚糖、丁酰基壳聚糖、戊酰基壳聚糖、己酰基壳聚糖、庚酰基壳聚糖、辛酰基壳聚糖、壬酰基壳聚糖、癸酰基壳聚糖或十二烷酰壳聚糖，以及它们的等同物；

带正电荷的壳聚糖，诸如例如三烷基铵壳聚糖(例如，三甲基-壳聚糖或TMC)以及它们的等同物；

N-(2-羟基)丙基-3-三甲基铵壳聚糖和其反离子，诸如氯离子，以及它们的等同物；

带负电荷的壳聚糖，诸如例如壳聚糖琥珀酰亚胺(琥珀酰壳聚糖)、N,O-羧基烷基壳聚糖、N,O-磺烷基壳聚糖以及它们的等同物；

中性壳聚糖，诸如例如N,O-乙酰壳聚糖、N,O-烷基壳聚糖、乙酰基壳聚糖、丙酰基壳聚糖、丁酰基壳聚糖、戊酰基壳聚糖、己酰基壳聚糖、庚酰基壳聚糖、辛酰基壳聚糖、壬酰基壳聚糖、癸酰基壳聚糖、十二烷酰壳聚糖，及它们的等同物；

两性壳聚糖，诸如例如包括疏水性聚合物的壳聚糖，诸如例如脂肪族聚酯，诸如乳酸的均聚物和共聚物、乙醇酸的均聚物和共聚物、ε-己内酯的均聚物和共聚物，脂肪族和/或芳香族聚酯的对二氧杂环己酮的均聚物和共聚物；脂肪族聚酰胺；乙烯聚合物和它们的共聚物；聚合物和丙烯聚合物和共聚物；聚碳酸酯；聚丙烯酸酯；以及它们的等同物。

根据具体的实施方式，在本发明的范围内也可使用其它衍生物，并且其它衍生物包括O-取代的壳聚糖，对于O-取代的壳聚糖，其取代可在葡萄糖胺和/或N-乙酰基葡萄糖胺单元的羟基上来实现。

根据替代方式，壳聚糖具有作为取代基的疏水性聚合物，该疏水性聚合物优选地选自由脂肪族聚酯和脂肪族聚酰胺；烯烃均聚物或共聚物，例如乙烯或丙烯的聚合物；聚碳酸酯；聚丙烯酸酯，和它们的任何组合所组成的组。

根据替代方式，壳聚糖具有作为取代基的脂肪族聚酯，并且尤其是聚丙交酯。

对于用于壳聚糖的取代方法，可提及的是在美国专利US 7838643中所述的反应，以及由该方法所得到的壳聚糖。

也可提及专利US 3953608。

根据替代方式，以下物质能够用作取代试剂：例如N-烷基化剂或烷基酸酐，可选地包括一个或多个不饱和键，可选地包括一个或多个杂原子和/或官能团(诸如例如，醚、硫醚、羧基、酯、酰胺等)，可选地包括一个或多个取代基(如烷基、氨基、羟基、羧基、羧酸基等)。

根据替代方式，可提及的实例为琥珀酸酐、谷氨酸酐、乙酰氧基琥珀酸酐、甲基琥珀酸酐、二乙酰酒石酸酐、二甘醇酸酐、马来酸酐、衣康酸酐、柠康酸酐和它们的任何混合物。

理论上，能够在中性pH或生理pH下在最终组合物中提供可溶的壳聚糖可能性的任何取代试剂均是合适的。

当通过沉淀来实现停止反应的步骤时，纯化可为分离不溶的取代的壳聚糖和非溶剂。

在纯化之后，本发明的方法可包括：干燥取代的壳聚糖的步骤，以及随后可选地，研磨取代的壳聚糖以获得粉末。

根据特定的替代方式，取代试剂为琥珀酸酐。取代的壳聚糖为壳聚糖琥珀酰亚胺。

壳聚糖琥珀酰亚胺可通过以下方式来获得：

使壳聚糖溶解在pH小于6.5的水性溶液中；

使溶液维持在介于0℃和100℃之间，优选介于20℃和50℃且进一步优选介于25℃和35℃之间的温度；

在壳聚糖溶解之后，将例如粉末形式的琥珀酸酐加入到壳聚糖溶液中。琥珀酸酐的量和琥珀酸酐的加入次数根据取代的壳聚糖的所需取代度来调整；

在足够得到最小的取代度的时间后，例如在最少持续15分钟后，停止反应。反应可例如通过改变反应介质的pH或通过在非溶剂(诸如乙醇、甲醇、丙酮……)中的沉淀步骤来停止；

随后，有利地，例如通过透析技术，或通过在非溶剂中进行沉淀/溶解循环，或通过切向过滤技术对取代的壳聚糖进行纯化。

随后，优选对纯化的产品进行干燥。该产品可例如通过喷雾干燥(雾化)或在烘箱中(在真空或在大气压下)，或进一步通过冷冻干燥来进行干燥。

壳聚糖的水性溶液的pH可通过弱酸，诸如乙酸、乳酸等的溶液来调节，以使壳聚糖溶解。

以取代基的摩尔数相对于全部单元的摩尔数来表示，壳聚糖的取代度可有利地在10％至30％，优选15％至30％，且进一步优选15％至25％之间变动。具体地，本发明涉及一种热凝胶组合物，该热凝胶组合物包括取代的壳聚糖，该取代的壳聚糖具有10％至30％，优选15％至30％，且进一步优选15％至25％的取代度，所述组合物不包括任何甘油磷酸盐。

壳聚糖琥珀酰亚胺的取代度与反应开始时试剂相对于壳聚糖的质量比相关。根据替代方式，在壳聚糖琥珀酰亚胺的情况下，使用大于0.13的试剂质量比是优选的。根据替代方式，在壳聚糖琥珀酰亚胺的情况下，使用小于0.2的试剂质量比是优选的。

根据特定替代方式，取代试剂为使D-葡萄糖胺单元的氨基烷基化的试剂。取代的壳聚糖有利地在D-葡萄糖胺单元上烷基化的壳聚糖。作为烷基化试剂，可提及的是卤代烷基，如卤代甲基，如甲基碘、甲基溴、酰基氯，例如带有一个或几个羧基甲基、氨基乙基和/或三甲基等的那些烷基化试剂。

根据该替代方式，取代的壳聚糖为N-烷基壳聚糖。根据特定的替代方式，取代的壳聚糖为带有三甲基取代基的壳聚糖(N,N,N-三甲基壳聚糖，缩写为TMC)。

根据替代方式，烷基化的壳聚糖，优选TMC，利用范围在0.1至0.35，且优选0.15至0.30的试剂摩尔比来得到，该摩尔比表示为烷基化试剂的摩尔数相对于壳聚糖中最初存在的氨基的摩尔数。

壳聚糖例如参考编号CAS 9012-76-4。

用于本发明的壳聚糖有利地是真菌来源的，并且优选源自于子囊菌Ascomycetes类真菌的菌丝体，并且具体是黑曲霉Aspergillus niger；和/或担子菌类Basidiomycetes真菌的菌丝体，并且具体是香菇Lentinula edodes(香菇(shiitake))和/或双孢蘑菇Agaricus bisporus(蘑菇)。优选地，壳聚糖来自双孢蘑菇Agaricus bisporus。壳聚糖优选是非常纯的，即含有很少来自其真菌来源的杂质，并且具有与其作为植入物或药物组合物的用途相容的微生物学品级。用于制备壳聚糖的方法是在专利WO 03/068824(EP 1 483299；US 7,556,946)中所述的方法。

所制备的壳聚糖可具有各种分子量，通常范围在10000至300000。

根据替代方式，平均分子量介于20000和60000之间。

根据另一替代方式，平均分子量介于60000和100000之间。

根据另一替代方式，平均分子量介于100000和120000之间。

根据另一替代方式，平均分子量介于120000和150000之间。

根据另一替代方式，平均分子量介于150000和220000之间。

能够水解壳聚糖以降低其分子量。

在本文中，优选的是，平均分子量是粘度平均分子量(Mv)，根据Mark-Houwink方程由特性粘度来计算。该特性粘度根据欧洲药典专刊EP2.2.9的方法，利用Ubbelohde型的毛细管粘度计来测量。通过自动粘度计Lauda Visc来测量溶液流经合适的毛细管(Lauda，例如直径0.53mm的Ubbelohde 510 01毛细管)的时间，例如根据EP2.2.9方法的规范，首先在起始壳聚糖浓度下测量，并且随后在几次稀释下进行测量。根据每个浓度来推断出降低的特性粘度。对该降低的粘度相对于温度作图，并且外推出浓度为0时的值以由此推断出特性粘度。例如，根据式5，i稀释液(g/ml)的降低的粘度(以ml/g表示的η_降低)相对于i稀释液的浓度C作图。

式2：[η_降低]＝(t₁-t₀)-(1-C)

为了计算平均粘度质量，使用Mark-Houwink方程，其中，根据Rinaudo等人建议使用常数k和α(Int.J.Biol.Macromol,1993,15,281-285)，根据壳聚糖的DA选择下列三个式子之一：

式3：Mv＝([η]/0.082)^(1/0.76)，对于2％的DA；

式4：Mv＝([η]/0.076)^(1/0.76)，对于10％的DA(例如11.5％)；

式5：Mv＝([η]/0.074)^(1/0.76)，对于20％的DA(例如21％)。

对于中间DA值，进行线性内插以计算平均粘度质量(Mv)。

优选地，所使用的壳聚糖的平均分子量介于120,000和150,000之间，并且进一步介于150,000和220,000之间。

根据特定替代方式，取代的壳聚糖优选地具有150,000至220,000的平均分子量，以及10％至50％范围内的取代度，分子量优选地表示取代前的分子量。

根据另一特定替代方式，取代的壳聚糖具有120,000至150,000的平均分子量，以及12％至40％、优选12％至30％或甚至20％至30％范围内的取代度，分子量优选地表示取代前的分子量。

有利地，壳聚糖所具有的乙酰化程度(DA)介于5％和50％之间。乙酰化程度表示为N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的数量相对于存在的N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺单元的总数。根据替代方式，乙酰化程度介于20％和45％之间。

根据替代方式，乙酰化程度介于5％和20％之间。

根据替代方式，乙酰化程度介于15％和25％之间。

根据替代方式，乙酰化程度介于20％和30％之间。

根据替代方式，乙酰化程度介于25％和40％之间。

乙酰化程度通过电势测定法来确定。使壳聚糖溶解在盐酸溶液中。通过氢氧化钠溶液的滴定来确定未与壳聚糖的氨基官能团反应的过量盐酸。由此推断出壳聚糖中存在的D-葡萄糖胺单元的摩尔数，以及通过相减得到乙酰化程度。

有利地，壳聚糖具有受控的乙酰化程度。术语“具有受控乙酰化程度的壳聚糖”是指可以以受控的方式来调节乙酰化程度，即，N-乙酰基-葡萄糖胺单元的比例的产品。

有利地，本发明的组合物还可包括不是取代的壳聚糖的生物聚合物。根据有利的替代方式，该生物聚合物是多糖，例如，透明质酸或透明质酸钠。

透明质酸可具有至多4MDa的分子量。透明质酸的分子量可通过其特性粘度来反映。透明质酸可具有范围在1m³/kg至4m³/kg范围内的特性粘度，并且例如可表征为低(例如约1m³/kg至2m³/kg)分子量或高(例如约2m³/kg至4m³/kg)分子量。

有利地，基于组合物的总质量，透明质酸的浓度小于4质量％，例如小于3质量％，或进一步例如小于2质量％(m/m)。

根据特定的替代方式，基于最终组合物的质量来表示，透明质酸的浓度小于1.9质量％(m/m)。有利地，基于最终组合物的质量来表示，透明质酸的浓度介于0.5质量％和1.5质量％(m/m)之间。根据具体的替代方式，基于最终组合物的质量来表示，透明质酸的浓度为约0.9质量％、1.0质量％、1.1质量％、1.2质量％、1.3质量％、1.5质量％(m/m)。

壳聚糖与透明质酸之间的比可分别为例如5％至95％，例如10％至90％，且进一步例如30％至70％的取代的壳聚糖，以及5％至95％，例如10％至90％，且进一步例如30％至70％的透明质酸，百分比基于取代的壳聚糖的干重/透明质酸的干重来表示。根据替代方式，壳聚糖与透明质酸之间的比为1/1(即，50％的壳聚糖和50％的透明质酸)。根据另一替代方式，壳聚糖与透明质酸之间的比为1.5/0.5(即，75％的壳聚糖和25％的透明质酸)。

有利地，在透明质酸的存在下，基于取代的壳聚糖的热凝胶组合物形成凝胶。有利地，根据该替代方式，热凝胶组合物的流动性质可通过浓度、壳聚糖与透明质酸之间的比例以及透明质酸的分子量来调节。

有利地，在透明质酸的存在下，保持凝胶的性质。

包括可选地混合有透明质酸的取代的壳聚糖的凝胶有利地给出了具有良好内聚力和在低振荡频率(例如近似于行走期间对膝盖的滑液施加的频率下(由0.6Hz下G’模量的值来表示))对凝胶的冲击的良好吸收能力以及使接合处润滑的良好能力(在静止时通过粘度来表示)的可能性。

本发明还涉及一种用于制备根据本发明的热凝胶组合物的方法。

根据替代方式，该方法通常包括：

使取代的壳聚糖溶解在水性溶液，优选水中，可选地，所述水性溶液优选在6.2和8.5的pH之间缓冲，并且优选在6.5和7.5的pH之间缓冲；

可选地，例如通过加入缓冲剂将pH调节至生理pH；

可选地，调节组合物的渗透度；

可选地，调节组合物的粘度。

根据替代方式，该方法通常包括：

使取代的壳聚糖溶解在水性溶液，优选水中，可选地，所述水性溶液优选在6.2和8.5的pH之间缓冲，并且优选在6.5和7.5的pH之间缓冲；

可选地，将pH调节至生理pH；

与糖或多元醇盐溶液，诸如例如甘油磷酸盐的溶液进行混合；

可选地，例如通过加入缓冲剂将pH调节至生理pH；

可选地，调节组合物的渗透度；

可选地，调节组合物的粘度。

如果需要的话，该方法可包括向组合物中加入其它组分。

根据替代方式，在包括还原糖，诸如甘露醇的水中，进行壳聚糖的溶解。

根据替代方式，缓冲剂为乙酸盐缓冲液。

根据替代方式，缓冲剂为磷酸盐缓冲液。

有利地，该方法还包括用根据本发明的组合物填充注射装置，诸如例如注射器的后续步骤。有利地，注射装置，诸如例如注射器可随后利用蒸汽进行灭菌。然后，该装置，例如注射器优选地以无菌的方式进行包装。

有利地，使用对于预期应用具有足够纯度的壳聚糖。

更具体地，本发明涉及一种可注射的组合物，该可注射的组合物包括根据本发明的热凝胶组合物或由根据本发明的热凝胶组合物组成。

根据替代方式，根据本发明的组合物用作可注射的药用组合物，或者用作可注射的医学装置或可植入的医学装置。

更具体地，本发明涉及根据本发明的组合物在治疗性治疗中的应用，例如包括通过皮下途径、皮内途径、眼内途径或关节内途径来注射所述组合物以例如用于修复或填充需要修复或填充的至少一个身体组织。

根据替代方式，上述身体组织选自属于声带、肌肉、韧带、肌腱、软骨、性器官、骨、接合处、眼、真皮、表皮、皮肤的一层或多层、中胚层，或它们的任何组合的组织，并且更具体地，选自属于关节接合处的组织。

本发明更具体地涉及根据本发明的组合物例如通过将所述组合物注射到滑液中，或在与血液混合后，植入到软骨中来治疗关节病，或修复软骨缺损。

本发明更具体地涉及一种医学装置，例如医学植入物，特征在于，该医学装置包括根据本发明的组合物或由根据本发明的组合物组成。

本发明还可包括能够调节其性质的一种或多种添加剂或赋形剂。根据特定替代方式，本发明的组合物包括颗粒(例如固体颗粒)的悬浮液或凝胶的悬浮液。

本发明还涉及根据本发明的组合物通过真皮填充在美容美体护理或治疗方法中的应用。这尤其例如是通过皮下途径或皮内途径来注射根据本发明的组合物。

本发明还涉及根据本发明的组合物经由皮内途径通过多次注射在皮肤表面处理方法中的应用。这种组合物可典型地用在皮肤医学中，如用于美容美体目的的治疗中。这种方法具有例如使皮肤再膨胀的目的，从而不再呈现其皱缩的外观(皱纹和/或细纹的处理)。这种处理可在想要使他/她的皮肤恢复活力的人上进行。

本发明还涉及根据本发明的组合物在美容美体护理或治疗方法中的应用，其中，所述组合物为粘弹性补充剂。例如，在此的目的是在关节内水平上注射本发明的组合物以尤其用于限制位于接合处任一侧的滑膜的摩擦。

本发明还涉及根据本发明的组合物用作一种或多种细胞类型的细胞载体，和/或一种或多种活性剂。从药学或生物学观点来看，这些可以是活性剂。本发明的组合物可实际上与细胞，优选活细胞的存在相容。在感兴趣的活细胞中，可提及的例如为：软骨细胞(关节软骨)、纤维软骨细胞(半月板)、韧带成纤维细胞(韧带)、皮肤成纤维细胞(皮肤)、肌腱细胞(肌腱)、肌成纤维细胞(肌肉)、间充质干细胞、红细胞(血液)和角质形成细胞(皮肤)。本发明的组合物也可旨在用作至少一种治疗剂的靶向递送和/或受控释放的治疗载体。

根据替代方式，血液或血浆或血小板溶解物，或者富含血小板的血浆或任意生物流体与本发明的组合物一起加入，从而例如提高产品的性能。

根据替代方式，根据本发明的组合物配制成固体形式(例如，膜或多孔泡沫)，其一旦植入便可溶解。

根据替代方式，组合物配制为可雾化的组合物(喷雾)。

本发明还涉及根据本发明的组合物在受到过高温度影响，例如在烧伤情况下的一个或多个组织或器官的治疗或美容美体护理中的应用。

本发明还涉及作为人造滑液的组合物，包括根据本发明的组合物或由根据本发明的组合物组成。

根据本发明的组合物通过尽力提高其吸收冲击的性质(通过弹性模量G’来辨别)，同时能够容易地注射来填充例如注射器或能够注射至人体或动物体而给出了仿制健康滑液的可能性或改善健康或有缺陷滑液的可能性。作为指示，健康滑液的弹性模量G’介于40Pa和100Pa之间，其损耗模量G”介于1Pa和10Pa之间。

根据替代方式，热凝胶组合物以流体形式注射并且随后原位发生凝胶化。

根据替代方式，热凝胶组合物以凝胶的形式注射。有利地，根据该替代方式，凝胶能够容易地通过细针来注射。

通常，在生物医学应用中，渗透度和pH值的要求范围接近于以下值：

渗透度：

与血浆等渗：285mosm/kg至295mosm/kg；

与滑液等渗：404+/-57mosml/kg，根据“Clin Orthop Relat Res,1988,235,289-95”和“Biochem Biophys Res Comm,2012,422,455-461”；

pH：

生理pH通常在6.8以上，尤其在7.0以上，并且尤其为7.4(如血浆或滑液)。

血浆的pH通常为7.4。根据“J Bone Joint Surg Br,1959,41-B(2),388-400”，滑液的pH通常为7.768+/-0.044；或根据“Acta Orthop Scand,1969,40,634-641”或进一步根据“Clin Rheumatol 2006,25,886-888”，滑液的pH通常为7.3。

通常认为，在骨关节炎的情况下，滑液的pH通常低于健康滑液的pH。

相当令人惊奇的是，发现根据本发明的热凝胶组合物在与滑液混合时，尤其是与来自患有骨关节炎的人类的膝盖的滑液混合时，具有非常良好的性质。

与现有技术中基于透明质酸的组合物所观察到的效果(在透明质酸被患有骨关节炎的患者的滑液稀释时，粘弹补充性质下降)不同，本发明的热凝胶组合物与滑液混合时，甚至在滑液中稀释之后，仍保持其凝胶性质。进一步更令人惊奇的是，根据本发明的热凝胶组合物通过与滑液混合，尤其是与患有骨关节炎的人类的膝盖的滑液混合时，具有增强的流变性质。

这可涉及本发明的热凝胶组合物和滑液之间的协同效果。

因此，本发明涉及滑液与根据本发明所限定的热凝胶组合物的混合物，例如，根据热凝胶组合物/滑液的体积比范围为20/80至80/20(v/v)，并且例如为50/50(v/v)。

有利地，根据本发明的组合物是无菌的。非常有利地，根据本发明的组合物通过升高温度，尤其是在高压灭菌锅里来进行灭菌。

根据替代方式，本发明的组合物是透明的或半透明的。

“半透明的”是指当将组合物放置在观察者的眼睛和物体之间时，可识别出该物体。“透明的”是指当组合物放置在观察者的眼睛和观察的字母数字符号之间时，能够识别出该字母数字符号。通常，该评估利用约1cm厚的组合物来进行。

根据替代方式，本发明的组合物是无色的，即，具体地，肉眼观察者并不认为组合物具有任何特定颜色。

本发明尤其涉及一种优选是无菌的物件或包装品，包括一种或多种预填充有根据本发明的热凝胶组合物的注射装置。这些通常是预填充的注射器。

根据本发明的组合物可有利地被灭菌。根据替代方式，本发明的组合物利用蒸汽进行灭菌，例如通过将温度升高至100℃以上的温度，并且优选120℃的温度，例如121℃和138℃的温度，在高压灭菌锅中持续足够长的时间例如通常15分钟至20分钟来进行灭菌。

本发明尤其涵盖灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物包括取代的壳聚糖，所述取代的壳聚糖具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元、D-葡萄糖胺单元、取代的D-葡萄糖胺单元和N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元，以及可选地，取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元。

有利地，所述灭菌的热凝胶组合物具有可逆的溶胶-凝胶转变。

根据替代方式，该组合物用蒸汽灭菌。

根据替代方式，该组合物通过升高温度优选地在高压灭菌锅中进行灭菌。

有利地，根据替代方式，所述灭菌的热凝胶组合物在灭菌后未凝胶化。

有利地，根据替代方式，在灭菌前和灭菌后，所述灭菌的热凝胶组合物在10℃或15℃以上的温度下凝胶化。

根据替代方式，溶液由根据本发明的热凝胶组合物组成或包括根据本发明的热凝胶组合物。

根据一个替代方式，优选在密闭腔室中将温度升高至100℃以上的温度来利用蒸汽对组合物进行灭菌。有利地，通过将高压灭菌锅中的温度升高至120℃以上的温度来进行灭菌。

根据另一个方面，本发明涉及一种对这种组合物进行灭菌的方法。

更具体地，本发明涉及一种用于对热凝胶组合物进行灭菌的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

将热凝胶组合物放置在高压灭菌锅的腔室内，所述热凝胶组合物包括取代的壳聚糖，所述取代的壳聚糖具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元、D-葡萄糖胺单元以及不是N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的取代的D-葡萄糖胺单元；

使所述高压灭菌锅的腔室的温度升高至灭菌温度，并且在所述灭菌温度下维持灭菌时段，所述温度和所述灭菌时段足以使所述热凝胶组合物灭菌；

降低所述高压灭菌锅的腔室的温度；

从所述高压灭菌锅的腔室中取出灭菌的热凝胶组合物。

根据替代方式，使所述腔室的温度维持在60℃以上、优选100℃以上、优选120℃以上的温度。

根据替代方式，灭菌温度的范围为120℃至140℃。有利地，灭菌时段为至少3分钟、优选至少10分钟、优选至少15分钟并且进一步优选至少20分钟。

灭菌时段通常取决于处理的样品体积。

作为指示，根据替代方式，灭菌时段为15分钟或20分钟。

更具体地，通常推荐的是，根据ISO17665标准，在121℃至138℃的温度下维持3分钟至30分钟的时段来进行灭菌。

根据替代方式，灭菌温度在121℃至138℃的温度下维持约20分钟。

高压灭菌锅的腔室中的超压等于在密闭腔室中蒸汽的压力。通常，在灭菌时段中，该超压大于或等于2巴。进一步更特定地，推荐的是：在高于大气压100kPa的压力下，在高压灭菌锅中灭菌15分钟或等效时间(值F0)。

更特定地，用蒸汽进行灭菌的目的是去除所有的细菌和/或污染物。

有利地，冷却步骤包括冷却至室温(20℃至25℃)。有利地，该步骤还包括将压力降低至大气压。

根据替代方式，灭菌方法包括一次或数次蒸汽灭菌循环。

可使用任何类型的高压灭菌锅，只要该高压灭菌锅适用于对用于施加或注射至人体或动物体的产品进行灭菌。这种高压灭菌锅是本领域技术人员所已知的。

根据替代方式，所使用的高压灭菌锅是用于对生物产品和/或治疗性产品灭菌的高压灭菌锅。

有利地，本发明的组合物在容器中进行灭菌，并且更具体地，在允许其注射至人体或动物体的装置中进行灭菌。

有利地，为了填充能够注射的装置(更具体地，注射器)，在填充孔口的相对端施加反压力，以确保将凝胶维持在装置内，而不会溢出。

根据替代方式，将容纳有本发明的组合物的注射器放置在高压灭菌锅的腔室中以进行灭菌。

由此得到预填充的灭菌的注射器，该预填充的灭菌的注射器含有本发明的灭菌的组合物。

本发明尤其涉及一种热凝胶组合物，该热凝胶组合物不能通过过滤来进行灭菌，尤其由于它们的粘度不适于通过过滤来进行灭菌(对于0.22μm的过滤器)。

根据替代方式，本发明的热凝胶组合物具有大于200mPa.s的粘度。

本发明进一步涵盖本发明的冷冻干燥的组合物。冷冻干燥可以发生在灭菌之前和/或之后。

本发明进一步涵盖处于干燥形式，特别是冷冻干燥形式的本发明的组合物。

在使用前，尤其能够对该冷冻干燥的组合物进行分散或再分散。

本发明还涵盖治疗性治疗方法，包括注射根据本发明的组合物。

本发明还涵盖根据本发明的组合物在制备药物组合物中的应用，尤其是治疗性治疗中的应用，例如本发明更特定地限定。

本发明还涵盖美容美体护理方法，换句话说，非治疗性，包括：使用或注射根据本发明的组合物。例如在事故或外科手术之后，出于美丽的目的而进行的填充例如皱纹或一个或多个损伤的可见组织区域。

组织是来自同一来源的相似细胞的集合，这些相似细胞聚集成功能性集合，即，行使相同的功能。在组织中，可提及的是：上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织。

“根据本发明的组合物”或等同术语是指如本发明所限定的组合物，包括根据替代方式、具体或特定实施方式中独立地或根据它们的任意组合的任意组合物，以及包括根据优选特征的组合物。

附图说明

在附图中：

图1示出了本发明的壳聚糖琥珀酰亚胺的质子核磁共振谱图。

具体实施方式

参照仅以说明目标而并非限制本发明范围的方式给出的实施例阅读示例性的描述后，本领域技术人员将清楚地了解本发明的其它目的、特征和优点。

实施例是本发明的组成部分，并且将说明书(包括实施例)作为一个整体来看，相对于任何现有技术表现为新颖的任何特征就其功能和整体性而言是本发明的组成部分。

因此，每个实施例具有一般范围。

另一方面，在实施例中，除非另有说明，否则所有的百分比均以质量表示，并且除非另有说明，否则温度均以摄氏度表示；并且除非另有说明，否则压力均以大气压来表示。

实施例

根据本发明的取代的壳聚糖的前体壳聚糖具有在表1所示范围内的粘度平均分子量(Mv，通过毛细管粘度计来确定)和乙酰化程度(DA，通过电位滴定来确定N-乙酰基-葡萄糖胺单元的比例)。壳聚糖的分子量可限定为1％(m/m)壳聚糖浓度溶液在浓度为1％(v/v)乙酸中的动态粘度，其通过具有转动子的粘度计来测量，例如如前文所示出的Brookfield粘度计。

实施例1–取代的壳聚糖(壳聚糖琥珀酰亚胺，CSS)的制备

为了得到表2的编号CSS5的壳聚糖琥珀酰亚胺，将已知分子量和DA的10g壳聚糖溶解在266ml的1％(v/v)乙酸的水性溶液中。使溶液维持在30℃的温度下。加入6.75g的琥珀酸酐(SA)，这对应于琥珀酸酐与壳聚糖的质量比(SA/壳聚糖)为0/675，并且琥珀酸酐与壳聚糖的NH₂基的摩尔比(SA/NH₂)为1/7。在15分钟之后，可选地，可通过加入30％的苏打将反应介质的pH调节至7.5。随后，从2.5升的乙醇中沉淀该溶液。回收沉淀物，并且将其溶解在水中。使取代的壳聚糖从乙醇中进行这些沉淀步骤并且随后溶解在水中3次。在最后一次沉淀时，回收沉淀物，挤压，并且在大气压下在60℃的烘箱中进行干燥。壳聚糖琥珀酰亚胺一经干燥，则对其进行研磨以得到粉末。根据前文所述的方法，通过质子NMR来确定壳聚糖的取代度。图1中示出了NMR谱图。

根据表2中的参数，以相同的方式制备在实施例中使用的多批壳聚糖琥珀酰亚胺。

备注：β-甘油磷酸钠(65％，Salfic-Alcan，缩写为GP)的加入提供了使CSS在水中的溶解度超过溶解极限的可能性。CSS具有两性性质。这并不是问题，由于能够加入低浓度的GP以再次发现CSS的可溶性质。

实施例2–取代的壳聚糖(三甲基壳聚糖，TMC)的制备

在体积为800ml的水中制备50g的壳聚糖的悬浮液。将悬浮液加热至95℃。将体积为26.27ml的3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵试剂(缩写为CHTAC)逐滴加入到介质中，即，CHTAC/壳聚糖的质量比和摩尔比分别为0.31和0.5。在反应4小时后，用400ml的水稀释反应介质，随后由8.4升的乙醇进行沉淀。回收沉淀物，并且将沉淀物再次溶解到水中。利用乙醇，对取代的壳聚糖进行3次溶解/沉淀步骤。在最后一次沉淀时，回收沉淀物，并且对沉淀物进行挤压，且在大气压下在60℃的烘箱中进行干燥。三甲基壳聚糖一经干燥，则对其进行研磨以得到粉末。

根据表3中的参数，以相同的方式制备在实施例中使用的三甲基壳聚糖。

备注：所有的这些三甲基壳聚糖优选地在DS范围为16％至75％时在水中是可溶的。

实施例3–热凝胶组合物的制备例

根据实施例1获得的壳聚糖琥珀酰亚胺(CSS2)以以下比例溶解在水中：0.195g的壳聚糖琥珀酰亚胺CSS2溶解在含0.5％(m/m)甘露醇的14.809g的水中。制备39.7％(m/m)的β-甘油磷酸钠(65％，Salfic-Alcan，缩写为GP)的溶液。在磁力搅拌或机械搅拌下，将1.49ml的GP溶液加入到壳聚糖琥珀酰亚胺溶液中，将0.325ml的0.5M乙酸盐缓冲液(pH 3)加入到壳聚糖琥珀酰亚胺/GP溶液中，直至得到给定的pH，例如在表4的编号为2的溶液的情况下，为7.5。测量最终溶液的渗透度。

实施例4–壳聚糖琥珀酰亚胺溶液在1.14％(m/m)的最终浓度下的凝胶化能力

根据实施例3所述的方法来制备表4的溶液。

热凝胶溶液的凝胶化能力尤其取决于取代度。取代度与壳聚糖上存在的氨基官能团与在取代反应期间所使用的琥珀酸酐的量之间的摩尔比直接相关。如果取代度过高，则不能发生凝胶化(溶液编号5的情况)。如果取代度过低(溶液编号1的情况)，则不能发生凝胶化。

表4表明对于壳聚糖琥珀酰亚胺，产生热凝胶化能力的最佳AS/壳聚糖质量比在0.12和0.26之间，这表示10％至45％范围内的DS。

此外，从不同批次的壳聚糖琥珀酰亚胺出发，制备表5的热凝胶溶液，以证实制备质量比为0.13的水凝胶的再现性，这种质量比为0.13的水凝胶给出了得到14mol％和18mol％之间DS的可能性。可以看出，发现最终溶液的渗透度在363mosm/kg和447mosm/kg之间，并且所有的溶液易于注射和热凝胶化。甘露醇(对于热凝胶化效果是可选的)的存在提高了渗透度。

实施例5–取代的壳聚糖TMC在最终浓度为0.9％(m/m)时的凝胶化能力

在具有中等分子量的三甲基壳聚糖的情况下，发现例如，在0.9％(m/m)的低浓度下热凝胶化凝胶制剂的最佳取代度在10％和36％之间(表6)。

实施例6–壳聚糖琥珀酰亚胺溶液在低浓度、渗透度和生理pH值下的凝胶化能力

将基于未取代的壳聚糖(CS)的溶液的溶解度、注射能力和热凝胶化性质与基于根据实施例2的方法制备的取代的壳聚糖(壳聚糖琥珀酰亚胺，CSS)的溶液的溶解度、注射能力和热凝胶化性质进行比较(表7)。

对于现有技术中未取代的壳聚糖，不能同时观察到所需的性能规范：pH、水中的溶解度、在37℃下的注射能力和凝胶化。

对于被琥珀酰基取代的壳聚糖，能够甚至在较低浓度的GP(具有相同的聚合物浓度)下得到溶解度、注射能力和溶胶-凝胶性质，这是由于初始聚合物是在水中可溶的取代的壳聚糖，且能够调节GP浓度以得到所需的凝胶化特性、渗透度和pH。

实施例7–在宽pH范围内，最终浓度为0.88％的壳聚糖琥珀酰亚胺溶液的凝胶化能力

在该实施例中，通过加入浓缩的乙酸(96％m/v)来调节溶液的pH以最小限度地稀释水凝胶。所有的溶液是可溶的且易于注射。

对于给定的分子量和取代度，例如，以“中等”分子量且质量比为0.133的CSS作为起始原料，能够在宽pH范围，例如7.2至8.0内获得凝胶化性质。

实施例8–降低取代的壳聚糖(CSS)的浓度同时保留溶液的凝胶化能力的能力

在某些应用中，有时有利的是，形成低浓度(例如低于1％，例如0.85％)的取代的壳聚糖的最终溶液，同时保持在生理温度，例如7.5下产生凝胶的能力。

实施例9–商购产品以及取代的壳聚糖和GP的溶液在室温下的可注射性

该实施例旨在验证该产品可通过装配有小直径针，如用于经由皮内或关节内途径注射所用的针的注射器来容易地注射。具体地，重要的是，能够容易地将该产品注射至小接合处(如手的接合处)中。

根据本文中所述的方法来估算在室温下，经由22号针在溶液注射期间注射该溶液所需的力。在注射器的活塞移动约15mm后，测量注射所需的力，从而能够容易地对不同产品进行比较。测试商购的用于关节内注射的三种透明质酸溶液，并且将其与中等分子量且可变浓度的壳聚糖琥珀酰亚胺的溶液进行比较。

可以看出，与透明质酸(A)的商购溶液相比，壳聚糖琥珀酰亚胺溶液能够容易地通过22号针来注射；并且与透明质酸(C)的商购溶液相比，能够更容易地注射。

实施例10–基于透明质酸的商购产品的流动性以及基于壳聚糖琥珀酰亚胺的热凝胶溶液的流动性

根据前文所述的方法，通过ARES流变仪，在4℃至37℃范围的温度下，随着时间测量基于透明质酸的商购产品的模量G’和模量G”。在60分钟时，确定模量G’和模量G”的值(表11)。

对于根据本发明的组合物，例如对于基于壳聚糖琥珀酰亚胺和GP且pH＝7.5的组合物，在几秒后，模量G’与模量G”交叉，并且在交叉发生后，G’大于G”，表明了产品从4℃升温至37℃时快速的溶胶-凝胶转变。

所测试的基于透明质酸的商购组合物并不发生热凝胶化。

实施例11–在前韧带横断之后在兔子中进行关节内注射壳聚糖琥珀酰亚胺溶液的效果

该实施例的溶液是灭菌的溶液，其中，该灭菌的溶液包括1.2％(m/m)的取代度为15％且具有中等分子量的壳聚糖琥珀酰亚胺(表2的编号CSS16)，3.5％(m/m)的GP，0.4％(m/m)的D-甘露醇以及11mmol/l的乙酸钠三水合物。该溶液在高压灭菌锅中用蒸汽进行灭菌，以1.33的因子通过稀释来调节浓度，并且随后在注射器中调节(condition)该溶液。在灭菌和稀释之后，在9℃下，pH等于7.5，渗透度等于380mosm/kg，以及表观动态粘度等于126mPa.s。

前韧带的横断被称为“前交叉韧带断裂ACLT”，在兔子中一贯且以良好记录的方式引起骨关节病(OA)的症状改变，即，软骨裂缝、滑膜的显著损伤和炎症，而就关节的整个高度而言不会产生任何软骨的损失。该模型尤其用于研究新型疗法，如关节内注射粘弹性补充剂对软骨结构的影响，初始损伤可为高度可变的来源和性质(参见Laverty etal.Osteoarthr Cartil,2010；Edouard et al.Phys Ther Sport,2013；Mainil-Varlet etal.Cartilage,2013；Oprenyeszk et al.Osteoarthr Cartil,2013)。

在该模型中，在外科手术4周后，出现软骨的侵蚀，其中，这些外科手术包括对右膝盖的前韧带的横切。推荐的是，在该外科手术后8周，进行研究，从而给出在至少40％的股骨踝中得到软骨侵蚀的可能性。在出现骨关节炎的第一迹象之后，即，对患有横断的膝盖进行手术1周后，进行待测试产品的关节内注射。测试组的10只动物的右膝盖接受注射600μl的待测试的热凝胶溶液。“对照”组的9只动物的右膝盖接受注射600μl的0.9％的盐水溶液。产品经由具有22号针的注射器被注入到兔子的膝盖的接合处。

根据OARSI(Laverty et al.Osteoarthr Cartil 2010)推荐的分数，通过检查若干宏观指标、组织学指标和放射学指标来表示产品减慢或停止手术诱导的关节病的进展的能力。基于骨赘和关节间隙的存在，根据Kellgren&Lawrence量表评估关节的放射学结果。

该研究是双盲研究，即，无论进行手术以及注射待测试产品的外科医生，还是在动物生命期间和在动物安乐死时刻进行宏观观察的人，还是分析宏观结果或组织学结构且建立统计学计算的人都不知道动物数量和每个测试产品的组之间的对应关系。仅在由独立的人完成且拟出计算后，才给出该对应关系。上述结果记载于表11至表13中。

通过与注射盐水溶液相比，热凝胶溶液HG的注射给出了在8周时以统计学显著的方式降低骨关节病的所有指标的可能性，如在放射性检查中观察到的关节间隙和骨赘存在的降低(表12，根据Kellgren&Lawrence量表)、关节侧面出现的软骨损失的严重性和尺寸的降低(表13)，以及滑膜炎性浸润的减少(表14)来证实。相对于对照组，未检测到热凝胶溶液的不良副作用，表明了在所研究的条件下对产品的良好耐受性。

实施例12至实施例24

在实施例12至实施例24中，使用以下的方法和步骤：

流动性质

通过装配有珀耳帖板(Peltier Plate)和溶剂阱的流变仪“Discovery HybridDHR-2”(TA仪器；例如参见：http://www.tainstruments.com)来测量流动性质。所使用的几何形状为直径为25mm的钢制珀耳帖板，且板和珀耳帖之间的距离设定为0.7mm。除了实施例12中所述的温度扫描实验之外，上述测量在37℃下进行。上述测量根据以下过程来进行：

通过形变扫描来确定粘弹性线性区域

首先进行形变扫描测试以确定在37℃下每种产品的粘弹性线性区域(LVER)。

在低振荡模式下进行频率扫描

在37℃下，在每个产品(0.9％的形变)的“LVER”区域中利用低振幅振荡模式(小振幅振荡剪切，SAOS)进行0.01rad/s和100rad/s之间的频率扫描。相对于扫描频率，测量以下特性：弹性模量(G’)、损耗模量(G”)、模量G’和模量G”的交叉频率以及复合粘度(η*)。具体地，弹性模量G’的值在0.6Hz的频率下确定，这对应了在行走期间施加到膝盖的滑液上的频率。

流动扫描

通过流体扫描模式来确定静止时的粘度。在37℃下，使产品平衡1分钟。施加0.001s^-1至10s^-1的剪切速率以相对于剪切速率来测量粘度。根据在该剪切速率范围内所得到的曲线，通过在零剪切下的粘度值的外推来确定静止时的粘度。在相关系数小于0.98的情况下，记录在较低剪切速率(0.001s^-1)下的粘度。

取代度(NMR测量)

在该实施例中，通过以下方法确定取代度：通过磁共振光谱仪，例如频率400MHz的Bruker光谱仪，在水性介质的溶液中进行质子核磁共振(NMR)。通过以下的方法来制备样品：将5mg至6mg的取代的壳聚糖溶解在1ml的氘化水中。2μl的氘化盐酸或硼酸钠加入到取代的壳聚糖的溶液中以使pH适用于分析。合适的pH范围取决于取代基的性质，并且例如对于硼酸钠可例如为8.5，对于12M的HCl则在3和4之间。在70℃的温度下，64至256的扫描次数，且弛豫时间在1秒至8秒的范围内，记录光谱。对所得到的光谱进行解卷积以确定兴趣信号的面积的积分值，从而能够计算取代的壳聚糖的取代度。

根据前文所述的方法来制备和表征在实施例12至实施例24中使用的取代的壳聚糖(表15)。通过在浓度为1％(v/v)乙酸中的浓度为1％(m/m)的壳聚糖溶液的粘度来限定壳聚糖的分子量。

表15–取代的壳聚糖以及这些取代的壳聚糖的前体壳聚糖的特征

*在取代反应期间基于目标值估算的取代度；**根据前文所述的方法通过质子NMR测量的取代度

在下文的实施例中，根据以下过程制备取代的壳聚糖制剂：

使取代的壳聚糖粉末溶解至目标浓度，含所需浓度的山梨醇或甘露醇；

加入磷酸盐缓冲液的母液(100mM)以得到介于280mosm/kg和400mosm/kg之间的渗透度；

加入冰乙酸，直至得到7.2和8.5之间的pH。

除非提及了“在高压灭菌锅灭菌之前”，所有以下的实施例涉及根据以下过程经高压灭菌锅灭菌的制剂：

将该溶液放入合适的容器中，并且用高压灭菌锅在121℃下灭菌20分钟。

表16包括基于实施例12至实施例22所述的取代的壳聚糖的制剂的列表。

表16–基于取代的壳聚糖的制剂

实施例12–基于壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂的热凝胶化性质

通过装配有珀耳帖元件且平行钢制板的几何形状为25mm的流变仪“DiscoveryHybrid DHR-2”(TA仪器)以0.7mm的距离进行温度的扫描以描绘基于壳聚糖琥珀酰亚胺的不同制剂的弹性模量(G’)和损耗模量(G”)依据温度的时间依赖性变化(表17)。在将样品放置在流变仪上期间，利用预剪切来进行温度的升高以对样品之间的差异进行标准化。根据每个测试的样品来调整形变、升温速率以及频率(表17)。

表17–不同温度下，基于壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂的弹性模量(G’)和损耗模量(G”)。

从该实施例应当理解的是，对于基于壳聚糖琥珀酰亚胺的所有测试试剂来说，弹性模量G’从一定温度开始变得大于损耗模量G”，这表明了制剂的热凝凝胶化性质。G’与G”交叉的温度随制剂的组成以及壳聚糖琥珀酰亚胺的分子特性变化。

实施例13–通过非常细的针(29号和30号)来注射低浓度取代的壳聚糖的制剂

根据前文所述的方法，在距离为50μm且角度为0.04弧度下，在37℃，以10Hz的频率，在3％的形变下，由具有“锥板”珀耳帖几何形状的ARES流变仪来测量基于取代的壳聚糖(琥珀酰亚胺和三甲基)的制剂的弹性模量(G’)和损耗模量(G”)(表18a)。如前文所述，利用具有转动子的粘度计(Brookfield)来测量动态粘度(表18a)。如前文所述，对通过29号和30号针注射制剂所需的力进行测量(表18b)。

表18a–流动性质和粘度

表18b–以牛顿表示的可注射性(注射所需的力)

证实了：得到了通过极细的针能够容易注射的制剂，例如，该制剂适用于皮下注射、皮内注射，或进一步用于在真皮上实施的微注射，尤其用于皮肤的复原，或进一步用于眼科的眼内(intra-camerular)注射，同时保持具有良好弹性和粘度的凝胶性质。

实施例14–商购粘弹性补充剂的流动性质

根据前文所述的方法，通过流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)在37℃以振荡模式来测量用作粘弹性补充剂的基于未交联的透明质酸的商购产品(VS1和VS2)的流动性质或基于经共价键交联的透明质酸的商购产品(VS3)的流动性质。确定模量G’和G”之间的交叉频率，在对应于行走时的频率的0.6Hz下的G’值。根据前文所述的方法，在流动扫描模式下确定静止时的粘度。

表19–商购粘弹性补充剂的流动性质

编号	交联的类型	HA浓度	交叉频率(Hz)	0.6Hz下的G’(Pa)	静止时的粘度(Pa.s)
						VS1	未交联	2％	5.2Hz	114	212
VS2	未交联	1％	无交叉	0.05	7
						VS3	共价交联	0.8％	无交叉	114	835

从该实施例知晓的是，基于透明质酸的粘弹性补充剂的流动行为取决于它们的组成以及透明质酸的分子特性，尤其取决于通过共价键交联的结构或无共价交联的结构。

实施例15–不同甘油磷酸盐浓度的壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂

根据前文所述的方法，在37℃下通过流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)测量基于2％浓度的中等分子量的壳聚糖琥珀酰亚胺(编号CSS25)和可变浓度的甘油酸磷酸盐(GP)的制剂的流动性质(表20)。

表20–基于2％(m/m)的壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂相对于GP浓度的流动性质

从该实施例证实了：

具有20％取代度和中等类型分子量的壳聚糖琥珀酰亚胺的溶液在未加入GP的情况下，可形成凝胶；

凝胶的内聚力可通过加入增加浓度的GP而增加；

当增加GP比例时，达到最大的润滑能力(静止时的粘度)。

实施例16–基于可变取代度和浓度的壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂

如前文所述，从具有不同取代度(DS)(编号CSS26、CSS27、CSS28)且具有相同分子量(“中等”)的壳聚糖琥珀酰亚胺作为起始原料，但不加入GP来制备具有可变浓度的壳聚糖琥珀酰亚胺的溶液。根据前述所述的方法，利用流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)在37℃下测量上述制剂的流动性质(表21)。

表21–基于壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂相对于DS的流动性质

*如前文所述估算的DS

证实了：

从具有20％、25％和30％的DS的CSS出发制备的所有的制剂均得到了凝胶；

对于相同的分子量(中等)，通过改变DS和CSS浓度调节静止时的内聚力和粘度。

实施例17–基于壳聚糖琥珀酰亚胺和透明质酸的制剂

如前文所述，制备2％(m/m)壳聚糖琥珀酰亚胺(编号CSS25)的溶液。通过使HA和甘露醇溶解在磷酸盐缓冲液中来制备2％(m/m)透明质酸(HA)的溶液，以得到同渗容摩在280mosm/kg和400mosm/kg之间且pH在7.2和8.5之间。使用高分子量的HA(编号H34，特性粘度为3m³/kg，由供应商提供)或使用低分子量的HA(编号H22，特性粘度为1.55m³/kg)。随后，将溶液以不同的质量比例混合。如前文所述，用高压灭菌锅对它们进行灭菌。根据前文所述的方法，利用流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)在37℃下测量制剂的流动性质(表22)。

表22–基于壳聚糖琥珀酰亚胺和透明质酸的制剂的流动性质

从上述结果知晓的是，通过CSS和HA的混合物所形成的凝胶的流动性质可通过浓度、CSS和HA之间的比例以及HA的特性粘度来调节。高粘度的HA给出了在操作频率(0.6Hz)下得到具有最高G’和动态粘度的凝胶的可能性。此外，在一定条件下，模量G’和模量G”之间没有交叉，表明了凝胶的形成与剪切频率无关。

实施例18–与关节炎患者的滑液的协同作用

经患者同意，在植入假体之前，对受关节炎影响的四个自愿成人患者的膝盖的滑液(SF)进行取样(SF1至SF4)。将其与基于壳聚糖琥珀酰亚胺的不同溶液或与不同商购粘弹性补充剂以1/1的质量比进行混合，并且随后根据前文所述的方法，在37℃下通过流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)来测量混合物的流动性质(表23)。

表23–受关节炎影响的四个患者膝盖的滑液以及壳聚糖琥珀酰亚胺制剂或商购粘弹性补充剂在以体积比50/50(v/v)与滑液混合前后的流动性质。

由该实施例证实了：

受关节炎影响的患者的膝盖处的滑液是具有低流动性质的凝胶；基于壳聚糖琥珀酰亚胺的粘弹性补充剂和制剂具有优越的性质；

基于HA的粘弹性补充剂在与SF进行稀释时，流动性质下降；

基于CSS的制剂在滑液中稀释之后，保持它们的凝胶性质；

与基于交联或未交联的HA的商购粘弹性补充剂不同，基于CSS的制剂通过与受关节炎影响的自愿成人的滑液混合而具有增强的流动性质。这很有可能是由于与滑液的成分，例如透明质酸或聚集蛋白聚糖之间的相互作用。

实施例19–由若干批次的壳聚糖琥珀酰亚胺作为起始原料，制备基于壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂的再现性。

如前文所述，以具有相似取代度19％至28％且相似分子量(中等)的不同批次的CSS(编号，CSS22、CSS24、CSS25、CSS29和CSS30)作为起始原料，来制备具有可变浓度的壳聚糖琥珀酰亚胺溶液，不含GP。根据前文所述的方法，在高压灭菌之前或之后，在37℃下通过流变仪“Discovery Hybrid DHR-2”(TA仪器)来测量它们的流动性质(表24a和表24b)。

表24a–在高压灭菌之前

表24b–在高压灭菌之后

从该实施例观察到：

高压灭菌处理保持了凝胶的性质、弹性模量以及制剂在静止时的粘度；

从若干批次的不同CSS为起始原料，能够以再现的方法制备流动性质和可注射性质相似的制剂，其中，这些CSS源自于不同批次的具有“中等”分子量范围的壳聚糖。

实施例20–壳聚糖琥珀酰亚胺制剂和商购粘弹性补充剂的可注射性

根据前文所述的方法来测量用于通过用于注射不同类型且适用于关节内注射的针来注射基于琥珀酰亚胺壳聚糖的不同制剂和基于商购粘弹性补充剂的不同制剂所需的力(表25)。实施例23中限定了不同类型针的尺寸。

表25–通过各种尺寸用于注射的针注射制剂所需的力(牛顿)

*存在凝胶块

从该实施例知晓的是：基于壳聚糖琥珀酰亚胺的凝胶制剂在室温下通过细针能够容易地注射，同时在37℃的生理温度下具有高流动特性。

实施例21–在氧化应激条件下，在体外对降解的敏感性

在该实施例中，根据由Mendoza等人的出版物(Carb Res 342,96,2007)所改编的过程，将基于壳聚糖琥珀酰亚胺的制剂和基于商购粘弹性补充剂的制剂置于用于模拟炎性环境的体外氧化应激条件下。该过程为：通过铜离子和过氧化氢之间的Femton反应产生游离羟基自由基，以及将凝胶在37℃下放置24小时。对该凝胶取样，并且测量凝胶的弹性模量G’和动态粘度，以表征孵育的影响。

简而言之，将800μg的基于壳聚糖琥珀酰亚胺的凝胶制剂或基于商购粘弹性补充剂的制剂置于试管中。加入100μg的浓度为220μM的EDTA溶液和70μg的浓度为1mM的硫酸铜溶液。使混合物均质化并且将该混合物在37℃孵育24小时。加入30μg的0.03M的过氧化氢溶液，随后以不同的时间间隔对溶液取样，并且根据前文所述的方法，利用流变仪DiscoveryHR-2(TA)在37℃下测量流动性质。

根据式1和式2分别计算相对弹性模量(G’_R)和相对动态粘度(η_R)：

式1：G’_R＝在时间t时的G’/在时间为零时的G’×100(表26a)

式2：η_R＝在时间t时的η/在时间为零时的η×100(表26b)

表26a–在0.6Hz(3.98rad/s)频率下，凝胶的相对弹性模量(G’_R)相对于在氧化性介质中的孵育时间

制剂(编号)	类型	0hr	2hr	4hr	24hr
						017-008	凝胶CSS(2％)	100％	127％	125％	92％
014-084	凝胶CSS(1％)/HA(1％)	100％	99％	42％	51％
						VS1	基于未交联的HA的粘弹性补充剂	100％	45％	9％	14％
VS3	基于交联的HA的粘弹性补充剂	100％	78％	11％	10％

表26b–凝胶的相对动态粘度(η_R)相对于在氧化性介质中的孵育时间

相对于基于交联的透明质酸的商购制剂(VS2)或基于未交联的透明质酸的商购制剂(VS1)，该实施例的基于CSS的凝胶制剂显著地更加耐受氧化性介质中的降解，并且它们保持了吸收冲击的能力(G’)以及长时间、至少24小时的润滑能力(η)。

实施例22–β-甘油磷酸钠的水性溶液的渗透度

使10g的β-甘油磷酸钠溶解在100ml的渗透水中。搅拌该溶液直至全部溶解，并且随后通过加入水来稀释至不同的浓度。根据前文所述的方法测量溶液的渗透度(表27)。

表27–β-甘油磷酸钠溶液(GP)在水中的渗透度

GP浓度(g/100ml)	渗透度(mosmol/kg)
		2％	155
4％	296
		6％	438
7％	512
		8％	590
9％	658
		10％	745

因此，应当注意的是，在这种组合物中，渗透度随着甘油磷酸盐浓度的增加而增加。因此，包括大于10％的甘油磷酸盐的组合物具有的渗透度超过用于本发明的预期应用所需的渗透度。

具体地，在YUHUA Chang等人的出版物(“Preparation and properties of anovel thermosensitive N-trimethyl chitosan hydrogel,Polymer Bulletin”,Springer,Berlin,DE,63,531)和WU J.等人的出版物(A thermo-and pH-sensitivehydrogel composed of quaternized chitosan/glycerophosphate,InternationalJournal of Phamarmaceutics,Elsevier,BV,NL,315,No1-2,pages 1-11)中描述了包括超过10质量％的甘油磷酸盐的组合物。因此，这些组合物的渗透度大于700mosmol/kg，并且远远超过500mosmol/kg。

可特别提及涉及产品的健康安全性的文献(SavientPharmaceuticals,Inc.；渗透度为258-381mosm/kg)以及Negoro等人(Effect ofosmolarity on glycosaminoglycan production and cell metabolism of articularchondrocyte under three-dimensional culture system,Clinical and ExperimentalRheumatology 2008,26,534-541)描述渗透度范围的重要性的文献。约400mosm/kg的渗透度是治疗性优异的值，因为其对于细胞(诸如软骨细胞、骨细胞和纤维母细胞)的增殖具有强烈的影响。

实施例23–用于注射的针的直径

ISO9262:1991和修订ISO9262:1991/Amd.1:2001(E)限定了用于注射的针的尺寸。外径固定为公差值(最小-最大范围)，而针的内径取决于壁的厚度，壁的厚度根据针的类型和应用分为正常厚度(“正常壁”)、薄厚度(“薄壁”)或超薄(超薄壁)。表28重复示出了可商购的针类型的外壁(最小/最大)和最小内径。

表28–根据ISO9262:1991/Amd.1:2001(E)标准，用于注射的不同厚度的针的范围以及内径和外径的公差

*供参考

实施例24–用于注射的针的类型的推荐

表29列举了在注射用于修复、治疗或填充的不同商购产品的情况下，所推荐的针的类型，例如关节内途径注射不同商购粘弹性补充剂产品中推荐使用的针的类型，经由皮内或皮下途径注射用于填充真皮的商购产品中推荐使用的针的类型，经由表面真皮内途径注射商购产品以用于使皮肤再生中推荐使用的针的类型或进一步地经由眼内途径在眼科注射中推荐使用的针的类型。这些类型针的内径和外径示出在实施例23中。

表29–根据注射部位和类型以及相关的产品，通过注射给药所推荐的针的类型

产品	注射的类型和部位	推荐的针的尺寸
			关节内粘弹性补充剂(VS1)	关节内注射/膝盖	19号至21号
关节内粘弹性补充剂(VS2)	关节内注射/膝盖	20号
			关节内粘弹性补充剂(VS3)	关节内注射/膝盖	18号至21号
关节内粘弹性补充剂(VS4)	关节内注射/手指	19号至25号
			通过关节镜检查修复软骨*	关节镜检查/膝盖、臀部	18号
基于交联透明质酸的皱纹填充	皮内注射/面部	25号至27号
			基于生物可吸收微粒的皱纹填充	皮内注射/面部	26号
基于未交联透明质酸的恢复活力	皮下或皮内注射/面部、手、颈部	30号至32号**
			抗生素(Anti bioprophylaxy)	眼内注射/眼睛的眼前房	30号

*参见:Stanish等人.2006；**例如BD销售的“笔针”型Micro-Fine^TM Ultra 4mm(32号)的针。

实施例25–利用蒸汽的灭菌测试

该实施例的溶液为包括如下的溶液：1.2％(m/m)的取代度为15％、具有中等分子量的壳聚糖琥珀酰亚胺(表2中的编号CSS16)，3.5％(m/m)的β-甘油磷酸钠，0.4％(m/m)的D-甘露醇和11mmol/l的乙酸钠三水合物(参见实施例11)。根据以下过程对该溶液进行灭菌：

根据ISO17665标准中推荐的常规灭菌操作，将400ml的水凝胶放置到肖特(Schott)瓶中，随后将样品放置在高压灭菌锅中(Systec DX-23型号)，在121℃下使液体循环20分钟。

在灭菌后，根据本发明的水凝胶具有非常适用于人类或动物的pH、粘度和渗透度，特别用作可通过针注射的组合物。渗透度的测量如前文所述来进行。

实施例26–溶胶-凝胶转变循环

使样品进行如实施例25中所述的灭菌循环。将数个由此灭菌的样品置于4℃的初始温度下。这些样品是流体：当管上下倒置时，视觉上看到在管内的溶液是流体。然后将样品在37℃的烘箱中放置1小时，以使其进行凝胶化循环。样品发生凝胶化。通过使管上下倒置来视觉上确定凝胶的存在：凝胶不流动。

使同一样品进行冷却，并将其在至少4℃下维持1小时。这样的样品是流体：当管上下倒置时，视觉上确定在管内的溶液是流体。

因此，样品可进行数次溶胶-凝胶转变，且因此具有可逆的溶胶-凝胶转变。

使样品进行3次凝胶化-去凝胶化循环。

实施例27–灭菌后的凝胶化测试

如前文所述，测量可注射性。

该溶液实际上在37℃下显示为凝胶。

实施例28–微生物污染测试

将本发明的热凝胶组合物引入到医学一次性使用的塑料注射器中，并且随后根据前文所述的灭菌方法来利用蒸汽进行灭菌。接下来，进行微生物生长测试：

将包括热凝胶组合物的灭菌的注射器在需氧条件下，在35℃下，在5％的CO₂的条件下放置在具有5％的绵羊血的哥伦比亚琼脂糖(琼脂糖COS)和巧克力琼脂糖PolyViteX(琼脂糖PVX)上，或者在35℃下放置在巯基乙酸盐(THIO)管中在哥伦比亚琼脂糖中继代培养。

未检测到微生物污染：生长试验均为阴性。

因此，灭菌循环适用于对例如人类或动物注射用途的根据本发明的热凝胶化组合物进行灭菌。

Claims (15)

1.一种灭菌的热凝胶组合物，所述灭菌的热凝胶组合物包括取代的壳聚糖，所述取代的壳聚糖具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元、D-葡萄糖胺单元，和不是N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的取代的D-葡萄糖胺单元，以及可选地，取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元。

2.根据权利要求1所述的灭菌的热凝胶组合物，其特征在于，溶胶-凝胶转变是可逆的。

3.根据权利要求1或2所述的灭菌的热凝胶组合物，其特征在于，所述灭菌的热凝胶组合物用蒸汽灭菌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，在灭菌之后，所述组合物未凝胶化。

5.一种灭菌的溶液，所述溶液由根据权利要求1至4中任一项所述的热凝胶组合物组成，或者包括根据权利要求1至4中任一项所述的热凝胶组合物。

6.一种用于对热凝胶组合物进行灭菌的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

将热凝胶组合物放置在高压灭菌锅的腔室内，所述热凝胶组合物包括取代的壳聚糖，所述取代的壳聚糖具有N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元、D-葡萄糖胺单元以及不是N-乙酰基-D-葡萄糖胺单元的取代的D-葡萄糖胺单元；

使所述高压灭菌锅的腔室的温度升高至灭菌温度，并且在所述灭菌温度下维持灭菌时段，所述温度和所述灭菌时段足以使所述热凝胶组合物灭菌；

降低所述高压灭菌锅的腔室的温度；

从所述高压灭菌锅的腔室中取出灭菌的热凝胶组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使所述腔室的温度维持在60℃以上、优选100℃以上、优选120℃以上的温度。

8.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述灭菌时段为至少3分钟、优选至少10分钟、优选至少15分钟并且进一步优选至少20分钟。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括一次或数次蒸汽-灭菌循环。

10.一种可注射的组合物，其特征在于，所述可注射的组合物包括根据权利要求1至6中任一项所述的热凝胶组合物或由权利要求7至9中任一项所述的方法获得的热凝胶组合物，或者由根据权利要求1至6中任一项所述的热凝胶组合物或由权利要求7至9中任一项所述的方法获得的热凝胶组合物组成。

11.根据权利要求10所述的可注射的组合物，其特征在于，所述可注射的组合物用作可注射的药物组合物，或者用作可注射的医学装置或可植入的医学装置。

12.根据权利要求11所述的组合物，用于治疗性治疗方法，或者用于修复或填充需要修复或填充的至少一个身体组织，所述治疗性治疗方法包括经由皮下途径、皮内途径、眼内途径或关节内途径注射所述组合物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述身体组织选自属于声带、肌肉、韧带、肌腱、软骨、性器官、骨、接合处、眼、真皮或它们的任何组合的组织，并且更优选地，选自属于关节接合处的组织。

14.根据权利要求12或13所述的组合物，用于治疗关节病的方法，或用于修复软骨缺损的方法，例如通过注射到滑液中，或在与血液混合后植入到软骨中来进行。

15.一种医学装置，例如，一种医学植入物，其特征在于，所述医学装置包括根据权利要求10至14中任一项所限定的组合物，或者由根据权利要求10至14中任一项所限定的组合物组成。