JP2022544109A - β脱離リンカーにより架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌 - Google Patents
β脱離リンカーにより架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022544109A JP2022544109A JP2022507351A JP2022507351A JP2022544109A JP 2022544109 A JP2022544109 A JP 2022544109A JP 2022507351 A JP2022507351 A JP 2022507351A JP 2022507351 A JP2022507351 A JP 2022507351A JP 2022544109 A JP2022544109 A JP 2022544109A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- optionally substituted
- hydrogel
- alkyl
- heteroaryl
- heteroarylalkyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 108
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 38
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims description 33
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 28
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 27
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 claims description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 26
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 21
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 20
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004426 substituted alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004946 alkenylalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000005038 alkynylalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical group NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 3
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N Nitrogen dioxide Chemical compound O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 claims description 2
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 44
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 36
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 30
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- -1 N,N-dimethylaminosulfonyl Chemical group 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 21
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 125000004397 aminosulfonyl group Chemical group NS(=O)(=O)* 0.000 description 10
- ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N cyclooctyne Chemical compound C1CCCC#CCC1 ZPWOOKQUDFIEIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 5
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 3
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 3
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZCVHTMSUUPMAW-UHFFFAOYSA-N 2-azidopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(C(O)=O)N=[N+]=[N-] LZCVHTMSUUPMAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical group [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 125000006575 electron-withdrawing group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- XPJRQAIZZQMSCM-UHFFFAOYSA-N heptaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO XPJRQAIZZQMSCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQUHYEDEGRNAFO-QMMMGPOBSA-N (2s)-6-amino-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN DQUHYEDEGRNAFO-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 1H-indene Natural products C1=CC=C2CC=CC2=C1 YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQNHWIYLCRZRLR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-hydroxy-2,5-dioxooxolan-3-yl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1(O)CC(=O)OC1=O WQNHWIYLCRZRLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUIAKSQMOGTDQJ-UHFFFAOYSA-N 2-cyclooct-2-yn-1-yloxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1CCCCCC#C1 QUIAKSQMOGTDQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQYGQWZKMMQNFW-UHFFFAOYSA-N 2-cyclooct-2-yn-1-yloxyethanol Chemical compound OCCOC1CCCCCC#C1 AQYGQWZKMMQNFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTEMMDPWYMOUSO-UHFFFAOYSA-N 2-cyclooct-2-yn-1-yloxyethanol (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical compound OCCOC1CCCCCC#C1.OC(=O)Oc1ccc(cc1)[N+]([O-])=O FTEMMDPWYMOUSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(O)=O)C=C1 FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N Azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001662443 Phemeranthus parviflorus Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002178 anthracenyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012865 aseptic processing Methods 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- WBLIXGSTEMXDSM-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound Cl[CH2] WBLIXGSTEMXDSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000006165 cyclic alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- UXPUKMYHKDMQLC-UHFFFAOYSA-N cyclooct-2-yn-1-ol Chemical compound OC1CCCCCC#C1 UXPUKMYHKDMQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCQGZFVUFAFHSC-UHFFFAOYSA-N cyclooct-2-yn-1-yl (4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1C#CCCCCC1 ZCQGZFVUFAFHSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJAZRFGMPTUAMV-UHFFFAOYSA-N cyclooct-4-yn-1-ol Chemical compound OC1CCCC#CCC1 BJAZRFGMPTUAMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROEKJBHFGBVIJV-UHFFFAOYSA-N cyclooct-4-yn-1-yl (4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound [N+](=O)([O-])C1=CC=C(OC(=O)OC2CCC#CCCC2)C=C1 ROEKJBHFGBVIJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000058 cyclopentadienyl group Chemical group C1(=CC=CC1)* 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N endo-cyclopentadiene Natural products C1C=CC=C1 ZSWFCLXCOIISFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 235000021060 food property Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000003454 indenyl group Chemical group C1(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L malate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000006574 non-aromatic ring group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M potassium bisulfate Chemical compound [K+].OS([O-])(=O)=O CHKVPAROMQMJNQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- RUPAXCPQAAOIPB-UHFFFAOYSA-N tert-butyl formate Chemical compound CC(C)(C)OC=O RUPAXCPQAAOIPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 150000003738 xylenes Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
- A61L2/0023—Heat
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
- A61L2/04—Heat
- A61L2/06—Hot gas
- A61L2/07—Steam
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
- C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K5/00—Use of organic ingredients
- C08K5/16—Nitrogen-containing compounds
- C08K5/34—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring
- C08K5/3467—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring having more than two nitrogen atoms in the ring
- C08K5/3472—Five-membered rings
- C08K5/3475—Five-membered rings condensed with carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
- C08L71/02—Polyalkylene oxides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2202/00—Aspects relating to methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects
- A61L2202/20—Targets to be treated
- A61L2202/21—Pharmaceuticals, e.g. medicaments, artificial body parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
- A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
- A61L2400/12—Nanosized materials, e.g. nanofibres, nanoparticles, nanowires, nanotubes; Nanostructured surfaces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2371/00—Characterised by the use of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Derivatives of such polymers
- C08J2371/02—Polyalkylene oxides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
有意な分解の欠点なくβ脱離リンカーで架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌の方法を提供する。
Description
（関連出願の相互参照）
本願は、2019年8月7日出願の米国仮出願第62/883,982号に基づく優先権を主張し、この内容は出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
本願は、2019年8月7日出願の米国仮出願第62/883,982号に基づく優先権を主張し、この内容は出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
分解性高分子生体材料の滅菌は、困難な課題を提示する。規制当局の承認を得て安全に臨床使用に進むためには、注射またはインプラントに使用されるあらゆる生体材料を無菌の形態で提供することが不可欠である。医療機器のインプラントによる感染症は、依然として医療における主要な懸念事項である。しかしながら、生体材料の固有の複雑さのために、滅菌方法の結果を予測し、それによって適切な滅菌を達成するための一般的な一連のガイドラインを開発することは事実上不可能である。ヒドロゲルの最新の滅菌方法のレビューが公開されている（Galante et al., "Sterilization of hydrogels for biomedical applications: a review," J. Biomedical Materials Res B: App Biomaterials (2018) 106B: 2472-92）。
ヒドロゲル滅菌の場合、分解を制御するポリマー主鎖または不安定な架橋のいずれかまたはその両方が、一般的に使用される滅菌方法によって悪影響を受ける。PCT公開番号WO2011/05140に開示されているように、保護溶媒の存在下で電離ガンマ線照射を用いてヒドロゲルを滅菌できる場合もあるが、相当な化学的分解は常に問題であり、再現性および毒物学的懸念が増加する。高温を使用すると、化学反応が加速し、例えばエステル結合の加水分解が加速することにより、ヒドロゲルの分解が生じ得る。
米国特許第9,649,385号は、β脱離リンカーを含む基によって架橋したヒドロゲルの製造を開示している。これらのゲルの分解は、媒体のpHによって制御され、リンカーに存在する1つ以上の電子吸引モジュレーター基の性質によって主に制御される（Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109: 6211-6）。しかしながら、そのようなヒドロゲルの滅菌は、例えば、2019年1月31日に出願されたPCT出願第PCT/US2019/016090号に開示されているように、通常、無菌製造技術を用いて行われている。しかしながら、多工程の製造プロセス中に無菌状態を維持することは困難であり、無菌プロセスに課せられる規制上の負担は極めて高く、かなりの費用がかかる。本発明はこれらの欠点を克服する。
本願で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
本発明は、有意な分解の欠点なしに、β脱離リンカーで架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌をするための方法に関する。これは、非反応性緩衝液中のヒドロゲルを提供し、ヒドロゲルを滅菌するのに十分な時間、緩衝化されたヒドロゲルを滅菌サイクルに曝露することによって達成される。最大の滅菌温度および時間での緩衝液のpH値を調節して、滅菌サイクル中の架橋切断を最小限する。
発明の実施モード
β脱離リンカーで架橋したドロゲルの蒸気滅菌は、非反応性緩衝液中のヒドロゲルを提供し、ヒドロゲルを滅菌するのに十分な時間、緩衝化されたヒドロゲルを滅菌サイクルに曝露することにより実用化できることを見出した。本発明者らは、最大の滅菌温度および時間での緩衝液のpH値を制御することにより、滅菌サイクル中の架橋切断が最小限にされることを見出した。
β脱離リンカーで架橋したドロゲルの蒸気滅菌は、非反応性緩衝液中のヒドロゲルを提供し、ヒドロゲルを滅菌するのに十分な時間、緩衝化されたヒドロゲルを滅菌サイクルに曝露することにより実用化できることを見出した。本発明者らは、最大の滅菌温度および時間での緩衝液のpH値を制御することにより、滅菌サイクル中の架橋切断が最小限にされることを見出した。
特定の実施態様において、最高滅菌温度での緩衝液のpHは、pH2～pH5（両端含む）、またはpH3～pH4である。特定の実施態様において、非反応性緩衝液は、クエン酸、リン酸または酢酸、好ましくはリン酸または酢酸である。特定の実施態様において、最高滅菌温度は121℃であり、最高温度での時間は1時間未満であるが、これらのパラメーターは、本発明の方法に従って満足のいく滅菌を達成するために必要に応じて調節され得る。特定の実施態様において、緩衝液は、pH3～4の酢酸またはリン酸である。
β脱離リンカーによって架橋され、その後の誘導体化のための反応性アミン基を含むPEGヒドロゲルの一般的な構造を以下に示す。ヒドロゲルは、以下に示すように、2つの「プレポリマー」の重合によって形成される。
式1または式2で示される化合物のいくつかの実施態様において、R1は、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
である。
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
である。
いくつかの実施態様において、R1は、CNまたはSO2R3であり、ここで、R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；またはOR9またはNR9
2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する。いくつかの実施態様において、R1は、CN；SO2Me；SO2NMe2；SO2N(CH2CH2)2XまたはSO2(Ph-R10)であり、ここで、Xが、存在しないか、OまたはCH-R10であり、R10が、H、アルキル、アルコキシ、NO2またはハロゲンである。
用語「アルキル」は、1～20、1～12、1～8、1～6または1～4個の炭素原子の直鎖、分岐鎖または環状飽和炭化水素を含むと理解される。いくつかの実施態様において、アルキルは、直鎖または分岐鎖である。直鎖または分岐鎖アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシルなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、アルキルは、環状である。環状アルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシルなど含むが、これらに限定されない。
用語「アルコキシ」は、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、シクロプロポキシ、シクロブトキシなどを含む、酸素に結合したアルキル基を含むことが理解される。
用語「アルケニル」は、炭素-炭素二重結合および2～20、2～12、2～8、2～6または2～4個の炭素原子を有する非芳香族不飽和炭化水素を含むことが理解される。
用語「アルキニル」は、炭素-炭素三重結合および2～20、2～12、2～8、2～6または2～4個の炭素原子を有する非芳香族不飽和炭化水素を含むことが理解される。
用語「アリール」は、6～18個の炭素、好ましくは6～10個の炭素の芳香族炭化水素基を含み、例えばフェニル、ナフチルおよびアントラセニルなどの基を含むことが理解される。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも1つのN、OまたはS原子を含む3～15個の炭素、好ましくは少なくとも1個のN、OまたはS原子を含む3～7個の炭素を含む、芳香環を含み、例えばピロリル、ピリジル、ピリミジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、インドリル、インデニルなどを含む。
いくつかの例において、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール部分は、アルキル結合を介して分子の残りの部分と結合し得る。これらの状況下で、置換基は、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルと称され、アルキレン部分が、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリール部分と、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロアリールが結合している分子との間にあることを示す。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、ブロモ、フルオロ、クロロおよびヨードを含むことが理解される。
用語「複素環」または「ヘテロシクリル」は、少なくとも1つのN、OまたはS原子を含む3～15員の芳香族または非芳香族環を指すことが理解される。例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、ピロリシン、およびテトラヒドロフラニル、ならびに上記用語「ヘテロアリール」に提供される例示的な基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、複素環またはヘテロシクリルは、非芳香族である。いくつかの実施態様において、複素環またはヘテロシクリルは、芳香族である。
「置換されていてもよい」は、他に明記されない限り、非置換であってもよく、あるいは同じかまたは異なり得る置換基の1つ以上(例えば、1、2、3、4または5)で置換されていてもよい基を意味することが理解される。置換基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、-CN、-ORaa、-SRaa、-NRaaRbb、-NO2、-C=NH(ORaa)、-C(O)Raa、
-OC(O)Raa、-C(O)ORaa、-C(O)NRaaRbb、-OC(O)NRaaRbb、-NRaaC(O)Rbb、-NRaaC(O)ORbb、-S(O)Raa、-S(O)2Raa、-NRaaS(O)Rbb、-C(O)NRaaS(O)Rbb、-NRaaS(O)2Rbb、-C(O)NRaaS(O)2Rbb、
-S(O)NRaaRbb、-S(O)2NRaaRbb、-P(O)(ORaa)(ORbb)、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリール（ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、およびアリールは、各々独立して、Rccで置換されてもよく、
RaaおよびRbbは、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはアリールであるか、または
RaaおよびRbbは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシまたは-CNで置換されてもよいヘテロシクリルを形成し、そして
各Rccは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、-CNまたは-NO2である）
が挙げられるが、これらに限定されない。
-OC(O)Raa、-C(O)ORaa、-C(O)NRaaRbb、-OC(O)NRaaRbb、-NRaaC(O)Rbb、-NRaaC(O)ORbb、-S(O)Raa、-S(O)2Raa、-NRaaS(O)Rbb、-C(O)NRaaS(O)Rbb、-NRaaS(O)2Rbb、-C(O)NRaaS(O)2Rbb、
-S(O)NRaaRbb、-S(O)2NRaaRbb、-P(O)(ORaa)(ORbb)、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリール（ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、およびアリールは、各々独立して、Rccで置換されてもよく、
RaaおよびRbbは、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたはアリールであるか、または
RaaおよびRbbは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシまたは-CNで置換されてもよいヘテロシクリルを形成し、そして
各Rccは、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アリール、-CNまたは-NO2である）
が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる場合、他に明確に断らない限り、用語「ある（a）」、「ある（an）」の使用は、1つまたは複数を指す。
生分解性β脱離リンカーを含むヒドロゲルの製造は、例えば、米国特許第9,649,385号に以前に開示されており、リシンスペーサーの使用によって導入された官能化可能アミン基をさらに含むものは、例えば、2019年1月31日に出願されたPCT出願第PCT/US2019/016090号および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号に開示されている。β脱離リンカーでの架橋切断の速度は、主に、米国特許第8,680,315号に開示されているように基R1の構造によって決定されるが、リンカーが結合しているアミン基の塩基性は、リシンのαアミンを介して結合した架橋が、同じ反応条件下で、特定のR1に対してεアミンを介して結合した架橋よりも迅速に切断するような追加の役割を果たす。これらの要因の相互作用により、予測可能で制御可能な反応速度に従って生分解するヒドロゲルの製造が可能になる；例えば、Henise et al., Internat. J. Polymer Sci., Vol 2019, article ID 9483127参照。
ヒドロゲルの様々な特性は、架橋の程度、それ故に滅菌プロセス中に架橋が切断される程度に依存する。そのような特性の1つは、特定のpHと温度に置かれたときにヒドロゲルが溶解する時間であり、逆ゲル化時間（trg）として知られている。架橋とtrgの関係は、Reid et al., Macromolecules 2015, 48: 7359-69に式(1)
として記載されており、ここで、t1/2,L2は、個々の架橋の切断の半減期であり、fは、ヒドロゲルの品質係数であり、ヒドロゲルに最初に存在するランダムに分布した切断された架橋の最初の割合に等しい。したがって、架橋が滅菌プロセス中に切断されると、最初の滅菌されていないヒドロゲルと比較してtrgが減少する。以下の実施例3に示すように、滅菌中の架橋切断が許容され得る程度は、ヒドロゲルの初期品質およびtrgが変化し得る許容範囲に依存する。滅菌後のヒドロゲルのtrgの変化は、滅菌前のヒドロゲルのtrgの20％以内、好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内である。
ヒドロゲルのさらに重要な特性は、滅菌後の反応性官能基の力価の維持である。そのような反応性官能基は、例えば、米国特許第9,649,385号、2019年1月31に出願されたPCT出願第PCT/US2019/016090号および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号に開示されているように、薬物または放出可能なリンカー-薬物などのペイロードのその後の化学的誘導体化および結合を可能にするために存在し得る。このような官能基は、ヒドロゲルまたは滅菌緩衝液中の成分の他の部分に対して望ましくない反応性を示し得る。そのような官能基のアッセイのための方法は当技術分野で知られており、そのような反応性基がアミンである場合のアッセイの例が以下の実施例で提供されている。
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定するものではない。
製造A リンカーの安定性に関するPEG-リンカー-リシンの試験プローブ（R1＝N,N-ジメチルスルホニルまたはモルホリノスルホニル）
N(a)-(2,4-ジニトロフェニル)-N(e)-[(4-アジド-3,3-ジメチル-1-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-2-ブトキシカルボニル)-L-リシン。Santi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109: 6211-6の一般的な手順に従って製造した。4-アジド-3,3-ジメチル-1-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-2-ブチルスクシンイミジルカーボネート（40mg、100μmol）の2mLのMeCN中の溶液を、N(a)-(2,4-ジニトロフェニル)-L-リシントリフルオロ酢酸塩（50mg、120μmol）、0.2mLの1N NaOH、0.4mLの1M NaHCO3および1.4mLの水の混合物に加えた。10分後、混合物をHClで酸性化し、EtOAcで抽出した。抽出物を水および食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、ろ過し、蒸発させて、生成物（59mg、100μmol、100％）を黄色のガラスとして得た。HPLCは単一のピークを得て；LC-MSは [M+H]+ m/z 589.1（C21H33N8O10S+の計算値m/z 589.2）を示した。
N(a)-(2,4-ジニトロフェニル)-N(e)-[(4-アジド-3,3-ジメチル-1-(N,N-ジメチルアミノ-スルホニル)-2-ブトキシカルボニル)-L-リシンのPEG10kDa-テトラシクロオクチンへのコンジュゲート。工程1の生成物（11.2mg、19unmol）の0.2mLのMeCN中の溶液を、10kDaの4アームPEG-テトラシクロオクチン［10kDaのPEG-テトラアミンおよび5-シクロオクタ-4-イニルスクシンイミジルカーボネートから製造］（シクロオクチン0.265mL中56.6mM、15μmolシクロオクチン）の20mM酢酸緩衝液（pH5.0）中の溶液に加え、50℃で12時間保持した。溶液をメタノールに対して透析して（SpectraPor2膜、12～14kDaカットオフ）、未コンジュゲートの材料を除去し、その後濃縮乾固して、コンジュゲート（43mg、90％）を得て、これを1mLの水に溶解させて、ストック溶液を得た。HPLCは0.1％未満の遊離DNP-リシンを示した。
R1＝モルホリノスルホニルを有する対応するコンジュゲートを、4-アジド-3,3-ジメチル-1-(モルホリノスルホニル)-2-ブチルスクシンイミジルカーボネートから開始する同じ手順によって製造した。
製造B アミノ-ヒドロゲルマイクロスフェアの製造（R1＝N,N-ジメチルスルホニルまたはモルホリノスルホニル）
アミノ-ヒドロゲルマイクロスフェアを、2019年1月31日に出願されたPCT出願第US2019/016090号（実施例4を参照）および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号（実施例14を参照）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるように製造し、参照により本明細書に組み込まれる。
アミノ-ヒドロゲルマイクロスフェアを、2019年1月31日に出願されたPCT出願第US2019/016090号（実施例4を参照）および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号（実施例14を参照）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるように製造し、参照により本明細書に組み込まれる。
簡単には、マイクロスフェアは、示されるようにプレポリマーから形成される。
基CとC'は反応して、接続する官能基C*を形成する。CまたはC'の1つへのプレポリマー接続は、ヒドロゲルの各架橋に切断可能なリンカーを導入するために、式(3)のような分子との反応によって導入される切断可能なリンカーをさらに含む：
式中、n＝0～6、R1およびR2は、独立して、電子吸引基、アルキルまたはHであり、ここで、R1およびR2の少なくとも1つは、電子吸引基であり；各R4は、独立して、C1-C3アルキルであるか、または一緒になって3～6員環を形成し得て；Xは、ハロゲン、活性エステル、例えばN-スクシンイミジルオキシ、ニトロフェノキシ、またはペンタハロフェノキシ、またはイミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、またはN(R6)CH2Clであり、ここでR6は、置換されていてもよいC1-C6アルキル、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；そして、Zは、高分子担体にリンカーを接続するための官能基である］。いくつかの実施態様において、nは、1～6である。より一般的には、本発明における使用に適したヒドロゲルは、式(4)
［式中、
mが、0または1であり；
Xが、クロスリンカーを第1ポリマーに接続する官能基を含み；
ここで、R1、R2およびR5の少なくとも1つが、クロスリンカーを第2ポリマーに接続する官能基Zを含み；
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］
で示されるβ脱離リンカーを含む、架橋を含む。Xは、典型的にはカルバメートO-(C=O)-NHであり；Zは、典型的にはトリアゾール（アルキンまたはシクロオクチンへのアジドの付加環化から生じる）またはカルボキサミドまたはカルバメートであり；しかしながら、2019年1月31日に出願されたPCT出願第US2019/016090号（実施例4を参照）および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号（実施例14を参照）に開示される他のオプションもまた適する。
mが、0または1であり；
Xが、クロスリンカーを第1ポリマーに接続する官能基を含み；
ここで、R1、R2およびR5の少なくとも1つが、クロスリンカーを第2ポリマーに接続する官能基Zを含み；
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］
で示されるβ脱離リンカーを含む、架橋を含む。Xは、典型的にはカルバメートO-(C=O)-NHであり；Zは、典型的にはトリアゾール（アルキンまたはシクロオクチンへのアジドの付加環化から生じる）またはカルボキサミドまたはカルバメートであり；しかしながら、2019年1月31日に出願されたPCT出願第US2019/016090号（実施例4を参照）および2019年4月5日に出願された米国仮特許出願第62/830,280号（実施例14を参照）に開示される他のオプションもまた適する。
この例示において、第1のプレポリマーは、4アームのPEGを含み、各アームは、2つの相互に非反応性（「直交」）の官能基BおよびCを有するアダプターユニットで終端されている。BおよびCは、その後の工程での選択的化学を可能にするために、最初は保護された形で存在し得る。アダプター単位は、アミノ酸の誘導体、特にリシン、システイン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり得て、αアミン基がアジドに変換された誘導体、例えば2-アジドグルタル酸のモノエステルを含む。アダプターユニットは、各プレポリマーアーム上の官能基Aとアダプターユニット上の同族の官能基A'との縮合によって形成される接続官能基A*を介して各第1プレポリマーアームに接続される。第2プレポリマーは、4アームのPEGを含み、各アームは、第1のプレポリマーの基Cと相互に反応性を有する官能基C'で終端され、CとC'が反応してC*を形成するときに2つのプレポリマー間の架橋が起こる。
実例として、H-Lys(Boc)-OHを、式(3)（式中、Z＝アジド）のリンカーでアシル化して、アダプターユニットを得た。これを20kDaの4アームPEG-テトラアミンに結合させ、Boc基を除去して、第1プレポリマーを提供し、ここで、A*＝アミド、B＝NH2、C＝アジドであり、式(3)の切断可能なリンカーが各アームと第1プレポリマーの基Cの間の結合に組み込まれている。対応する第2プレポリマーは、20kDaの4アームPEG-テトラアミンを5-シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネートでアシル化して、C'＝シクロオクチンである第2プレポリマーを得ることによって製造した。第1プレポリマーと第2プレポリマーを混合すると、C＝アジド基とC'＝シクロオクチン基の反応により、対応するトリアゾール基が形成され、これにより2つのプレポリマーが3次元ネットワークに架橋され、ここで、各架橋は、式(3)の化合物の組み込みにより生じる切断リンカーを含み、第1プレポリマーの組み込みにより生じる各ノードは、更なるリンカー、薬物、フルオロフォア、金属キレート剤などの結合のために誘導体化できる残りの官能基B＝NH2を含む。このタイプのヒドロゲルは、様々なサイズ、例えば5、10、20および40kDaのPEGを用いて製造されている。これらのヒドロゲルのマイクロスフェア懸濁液は、典型的には、直径20～100μmの粒子を含むが、他のサイズおよび物理的形状のヒドロゲルを製造することもできる。蒸気滅菌下でのヒドロゲルの安定性は、主にβ脱離によるクロスリンカーの切断速度によって制御され；これはリンカーの特性ならびに媒体のpHおよび温度に依存するが、PEGまたはヒドロゲルのサイズおよび形状には依存しないので、ヒドロゲル構造のそのようなすべての変異型は、本発明での使用に適している。
実施例1 PEG-リンカー-リシン試験プローブの安定性
A.切断速度の温度異存
R1＝モルホリノスルホニルである製造Aの試験プローブを、25℃でpH＝7.4を有する0.1Mリン酸緩衝液（リン酸緩衝液のpHは、広い温度範囲にわたって本質的に一定である。Reinecke et al., Int. J. Food Properties (2011) 14:4, 870-881参照）に、HPLCオートサンプラーバイアル内で溶解させ、その後、設定温度でインキュベートした。アリコートを定期的に取り出し、1/10量の1N HClを加えてクエンチし、その後、放出されたDNP-リシンについてHPLCで分析し、10μLをC18カラム（Phenomenex Jupiter、300A、5μm、4.6×150mm）に注入し、0～100％MeCN/水/0.1％TFAの直線グラジエントで10分間溶解し、350nmにて分析した。遊離DNP-リシンの形成は、％反応＝(AUC DNP－リシン)/[(AUC DNP－リシン)＋(AUCコンジュゲート)]×100（ここで、AUCは曲線下面積である）として定量した。その後、反応速度定数（h-1）を、時間単位の時間に対するln（％反応）の傾きから計算した。
A.切断速度の温度異存
R1＝モルホリノスルホニルである製造Aの試験プローブを、25℃でpH＝7.4を有する0.1Mリン酸緩衝液（リン酸緩衝液のpHは、広い温度範囲にわたって本質的に一定である。Reinecke et al., Int. J. Food Properties (2011) 14:4, 870-881参照）に、HPLCオートサンプラーバイアル内で溶解させ、その後、設定温度でインキュベートした。アリコートを定期的に取り出し、1/10量の1N HClを加えてクエンチし、その後、放出されたDNP-リシンについてHPLCで分析し、10μLをC18カラム（Phenomenex Jupiter、300A、5μm、4.6×150mm）に注入し、0～100％MeCN/水/0.1％TFAの直線グラジエントで10分間溶解し、350nmにて分析した。遊離DNP-リシンの形成は、％反応＝(AUC DNP－リシン)/[(AUC DNP－リシン)＋(AUCコンジュゲート)]×100（ここで、AUCは曲線下面積である）として定量した。その後、反応速度定数（h-1）を、時間単位の時間に対するln（％反応）の傾きから計算した。
速度を37、60および80℃にて決定し、その後、ln(k)対1/T（ここで、Tは°Kでの反応温度である）をプロットすることにより、アレニウスに従って分析した。これにより、ln(k)＝39.047－14077/Tの線形関係が得られ、図5に示すように、A＝9.07×1016h-1およびEa＝117kJ/molが得られた。
B.pHの影響
緩衝液中のPEG-リンカー-リシン試験プローブの溶液をオートクレーブサイクルに供し、その後HPLCで分析し、放出されたDNP-リシンの決定によりリンカー切断の程度を測定した。試験プローブストック（0.1mL）を、2mLスクリューキャップオートサンプラバイアル中で1.0mLの緩衝液で希釈した。使用した緩衝液（および25℃でのpH）は：
0.125M HEPES（pH7.6）、
0.1Mクエン酸（pH5.0および4.0）、
0.1Mグリシン（pH2.0）
であった。
緩衝液中のPEG-リンカー-リシン試験プローブの溶液をオートクレーブサイクルに供し、その後HPLCで分析し、放出されたDNP-リシンの決定によりリンカー切断の程度を測定した。試験プローブストック（0.1mL）を、2mLスクリューキャップオートサンプラバイアル中で1.0mLの緩衝液で希釈した。使用した緩衝液（および25℃でのpH）は：
0.125M HEPES（pH7.6）、
0.1Mクエン酸（pH5.0および4.0）、
0.1Mグリシン（pH2.0）
であった。
バイアルを密閉し、(a)5.80psiaまで減圧；(b)保持時間20分で121℃に加熱；(c)約1.5時間かけて97℃に冷却し、その後周囲温度に冷却して分析からなる標準的なオートクレーブサイクルを繰り返した。オートクレーブの温度は、100mLのガラス製GL45培地ボトル内の50mLの水にプローブを浸してモニターした。使用したオートクレーブは、Sterivapモデル669オートクレーブ（BMT Medical Technology）であった。試料はHPLCで分析し、10μLをC18カラム（Phenomenex Jupiter、300A、5μm、4.6×150mm）に注入し、0～100％MeCN/水/0.1％TFAの直線グラジェントで10分間溶解し、350nmにて分析した。
遊離DNP-リシンの形成は、％反応＝(AUC DNP－リシン)/[(AUC DNP－リシン)＋(AUCコンジュゲート)]×100として定量した。表1は、R1＝(N,N-ジメチルアミノ)スルホニルの場合の第1のオートクレーブサイクル後のリンカー切断の測定量と推定量を示している。
8回の連続オートクレーブサイクルについてのこれらの累積結果を図1に示す。pH4.0では、リンカーは1サイクルあたり0.11％切断され、8回の連続サイクル後に99％超がインタクトあった。pH5.0では、リンカーは1サイクルあたり0.77％切断された。
実施例2 アミノ-ヒドロゲルマイクロスフェアのオートクレーブ滅菌の試験
製造Bのアミノ-ヒドロゲルマイクロスフェア（ここで、R1は(N,N-ジメチルアミノ)スルホニルである）約1.5mLの滅菌を、2mLオートサンプラーバイアル中で実施例1に記載されているように行い、その後、物理的パラメーターの変化について顕微鏡により、化学的構造についてゲル化を逆転させるまでの時間および遊離アミン含有量により分析した。
製造Bのアミノ-ヒドロゲルマイクロスフェア（ここで、R1は(N,N-ジメチルアミノ)スルホニルである）約1.5mLの滅菌を、2mLオートサンプラーバイアル中で実施例1に記載されているように行い、その後、物理的パラメーターの変化について顕微鏡により、化学的構造についてゲル化を逆転させるまでの時間および遊離アミン含有量により分析した。
光学顕微鏡による目視検査は、マイクロスフェアの形態に有意な変化を示さなかった。マイクロスフェアスラリーの100mg試料を、0.700mLの50％DMF/H2O v/vで希釈した。
混合物の0.200mL試料を顕微鏡スライド（VWR、48300-026）に置き、5倍の対物レンズ（Nikon E4/0.10、160/-NA）および単色CCDカメラ（Unibrain、Fire-I580b）を備えた白色光学顕微鏡（Nikon TMS、SN：51436）を用いて画像を収集した。3つの画像から、画像解析ソフトウェア（Image J v 1.52a）を用いて粒子の直径（N＝150以上）を測定した。ソフトウェアは、顕微鏡ステージマイクロメーター（Electron Microscopy Sciences、60210-3PG）の画像を測定することにより、ピクセルをμm（1.98μmピクセル-1）に変換するためにキャリブレーションした。観察されたマイクロスフェアの描写を図2に示す。
混合物の0.200mL試料を顕微鏡スライド（VWR、48300-026）に置き、5倍の対物レンズ（Nikon E4/0.10、160/-NA）および単色CCDカメラ（Unibrain、Fire-I580b）を備えた白色光学顕微鏡（Nikon TMS、SN：51436）を用いて画像を収集した。3つの画像から、画像解析ソフトウェア（Image J v 1.52a）を用いて粒子の直径（N＝150以上）を測定した。ソフトウェアは、顕微鏡ステージマイクロメーター（Electron Microscopy Sciences、60210-3PG）の画像を測定することにより、ピクセルをμm（1.98μmピクセル-1）に変換するためにキャリブレーションした。観察されたマイクロスフェアの描写を図2に示す。
結果を表2に示す。
アミンおよびPEGの含有量を決定するために、100mgアリコートのマイクロスフェアスラリーを0.900mLの50mM NaOHに溶解させた。溶解MSの0.060mL試料のアミン含有量は、Schneider et al., Bioconj Chem (2016) 27: 1210に記載されているとおり、TNBS（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸溶液）を用いて測定した。PEGアッセイでは、0.020mLアリコートの上記の溶解マイクロスフェア溶液を0.980mLのH2Oで希釈し、1.00mLの1.00mLの0.5M HClO4で酸性化した。0.200mLアリコートを96ウェルマイクロタイタープレートに移した後、それぞれをBaCl2の5％w/v混合物0.050mLとLugol溶液0.025mL（0.18％w/wのI2および0.35％w/wのKI）で処理した。5分後、プレートリーダーを用いてA535を測定した。PEG含有量は、DMF標準を用いたNMRによって事前にキャリブレーションされた、1.25～10μg/mLの8000MW線形PEG標準から作成したA535対[PEG]の標準曲線から決定した（Alvares et al., Anal. Chem. (2016) 88: 3730）。アミノMSのnmolアミン/mgPEGの比率を、同じ溶液からの遊離アミンおよびPEGの測定値を用いて計算した。
逆ゲル化までの時間を決定するために、1.5mLマイクロ遠心チューブ内のマイクロスフェアスラリーの0.5mL試料を、21,000gで5分間ペレット化することにより3×1mLの100mM HEPES（pH7.6）で洗浄した。ペレットを、DMSO中の0.020mLの10mM 5-カルボキシフルオレセインHSEで30分間処理した。MSを3×1mLの水および3×1mLの100mM NaOAcで洗浄した。マイクロスフェアの溶解曲線を、報告されているように、37℃にて2.5mLの100mMホウ酸緩衝液（pH9.4）中の0.1mL試料について決定した（Schneider et al., Bioconj Chem (2016) 27: 1210）。溶解が50％から95％の間の領域で線形回帰を実施した。100％溶解時の時間は、tRG＝100－Y切片/勾配の式から計算した。溶解曲線を図3A～3Cに示す。ゲル化を逆転させる時間は、平均の7％標準偏差内で一定であることが観察され、これは、同一試料の4回繰り返しで得られた誤差（8％）と同様である。
アミン基とPEGの比率は、リン酸または酢酸緩衝液中でオートクレーブしたアミノ-ヒドロゲルマイクロスフェアでは安定していたが、クエン酸緩衝液ではアミン基の損失（1サイクルあたり約7％）が観察された（図4）。これは、オートクレーブサイクル中にクエン酸無水物が形成され、続いてアミンがクエン酸化されるためであると仮定される（Chumsae et al., Anal.Chem. (2014) 86: 8932）。
最終的なアミノヒドロゲルマイクロスフェアの無菌性を、USP71ガイドラインに従って示した。オートクレーブされたヒドロゲルは、検出可能な微生物の増殖を示さなかった。
実施例3 高温へのヒドロゲル曝露による架橋損失の計算
オートクレーブ滅菌中のβ脱離リンカーを含むヒドロゲルの分解の1つのメカニズムは、高温でのリンカー切断による架橋の加速された損失である。他のメカニズム、例えば、より高温でのアミンなどの官能基の反応性の向上も適用し得る。
オートクレーブ滅菌中のβ脱離リンカーを含むヒドロゲルの分解の1つのメカニズムは、高温でのリンカー切断による架橋の加速された損失である。他のメカニズム、例えば、より高温でのアミンなどの官能基の反応性の向上も適用し得る。
特定の温度とpHでの個々の架橋の切断速度は、製造Aで記載したPEG-リンカー-リシンプローブの試験によって推定でき、これは、ヒドロゲルの個々の架橋ユニットを表し、HPLCなどの標準的な分析によって切断を容易に分析できる。β脱離切断反応は水酸化物中で一次であることが示されており、それ故に、切断速度が、式2に従ってpH単位の変化ごとに10倍変化する（Santi et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2011, 109(16): 6211-6）：
反応の温度依存性は、アレニウスの式（式3）
で表され、式中、kは、速度定数（＝ln(2)/t1/2、L2）であり、Tは、°Kでの温度であり、Aは、前指数因子であり、Eaは、活性化エネルギーであり、Rは、一般気体定数である。AおよびEaは、温度の関数としての反応速度の変化の試験によって実験的に決定され、その後、様々な温度での反応速度を予測するのに使用できる。37～80℃の実験データに基づいた、式2のR1がモルホリノスルホニルであり、リシンがεアミンに結合しているPEG-リンカー-リシンの切断についてのアレニウスプロットの例を図5に示す。データにより、活性化エネルギーEa＝117kJ/molが推定される。Me2N-SO2および4-(CF3)-フェニル-SO2としてR1についての比較データを表3に示す。
ヒドロゲルにおける架橋の切断速度は温度とともに指数関数的に増加するが、pHが低下すると切断速度は指数関数的に減少する。式(2)および(3)を組み合わせることにより、T1からT2（ケルビン度）への温度変化によるリンカー切断速度を平衡させるのに必要なpHの変化は、式(4)で計算できる：
したがって、β脱離リンカーを含むヒドロゲルの安定性が一連の温度およびpH条件T1およびpH1で知られているとき、切断反応の活性化エネルギーEaが知られているならば、そのヒドロゲルが温度T2で等しく安定するpH値pH2を計算することが可能である。例として、上記のようにEa＝117kJ/molであるβ脱離リンカーによって架橋したヒドロゲルについて、そのようなヒドロゲルがpH7.4および37℃（310.14°K）にて1時間に一定量の架橋切断を受けるならば、121℃（394.14°K）にて1時間に同じ量の架橋切断がpH2＝3.2（ΔpH＝4.2）で観察される。
この関係を用いて、β脱離リンカーを含むヒドロゲルのオートクレーブ滅菌に適した条件を推定できる。クロスリンカーの切断速度、したがってそのプロセスの活性化エネルギーは、R1および上記のスペーサー接続の性質によって決定される。クロスリンカー切断の許容レベルを定義することにより、例えば、滅菌プロセス中の脱ゲル化時間trgの変動に制限を設定し、Eaを知ることにより、適切な滅菌pH値を推定できる。式(1)から、t1/2,L2の個々の切断半減期を有するリンカーに含まれるヒドロゲルにおいてf1からf2へ架橋の程度を変更することによるtRGへの影響は式(5)で得られる：
Δtrgの分数変化率として表されるならば（式6）：
したがって、100％の初期架橋（すなわち、f1＝0）で構成される完全なヒドロゲルのならば、滅菌中にそれらの架橋の10％が切断されると（すなわち、f2＝0.1）、滅菌プロセス中にヒドロゲルに発生する可能性のあるその他の構造変化を無視して、trgが11％減少するはずである。最初に不完全なヒドロゲルのならば、このような架橋の損失のtrgへの影響は大きくなる：例えば、f1＝0.2のとき、f2＝0.28まで架橋を10％損失すると、trgが15％変化し、例えば、f1＝0.3のとき、f2＝0.37まで架橋を10％損失すると、trgが18％変化する。trgを内に維持することが望まれる場合。
反対に、trgをX＝Δtrg/trgの係数内に維持することが望まれるならば、f2の値を式(7)のように維持する必要がある。
式(7)から、表3は、Δtrg/trgを所定の許容範囲内に維持する架橋の最大許容損失Δf＝f2－f1を示す。この表から、trgについて5％の許容範囲を維持するには、損失が、完全なヒドロゲル（f1＝0）から4.6％未満の架橋、および最初に理論上の架橋数の80％を有するヒドロゲル（f1＝0.2）から2.8％未満の架橋であることが必要であることがわかる。
滅菌中の架橋切断の最大許容範囲がわかれば、オートクレーブに必要な緩衝液pHは、式(3)のアレニウスの関係を用いて、温度および時間の滅菌条件下での個々のリンカーの切断速度に基づいて推定できる。例えば、R1＝モルホリノスルホニル（pH7.4、37℃で切断t1/2＝400時間）であり、図1に示すアレニウスの関係を有するクロスリンカーは、pH7.4、121℃にて切断t1/2＝0.025時間（k＝28時間-1）を有すると予測される。架橋切断は一次反応であるため、時間Tにわたって切断された架橋の割合は1-exp（-kT）として得られる。したがって、121℃、pH7.4で20分間滅菌すると、ヒドロゲルが本質的に完全に分解されてモノマー単位になる（99.99％の架橋切断）。しかしながら、pH5では反応が251倍遅くなり、そのため架橋の3.6％のみが切断され、pH4では0.4％のみが切断される。表3から、pH5では、初期品質をf1＝0.3まで下げたヒドロゲルについてtrgを10％以内に保持するという点で満足のいく結果が得られるのに対し、pH4では、trgが5％の許容範囲内ですべてのヒドロゲルについて満足のいく結果が得られると予想されることがわかる。実際には、ゆっくりとした冷却期間が必要なため、ヒドロゲルは高温により長時間曝露され、ヒドロゲルを滅菌温度（121℃）で1時間保持するという控えめな推定では、同様にtrgを5％の許容範囲に維持するのに適するpH4で1.1％の切断となると推定される。
実施例5 分解性PEG-ヒドロゲルの製造
本発明のヒドロゲルは、反応して接続官能基C*を形成する基CおよびC'を含む2つのプレポリマーの重合によって製造される。CまたはC'の1つへのプレポリマー接続は、ヒドロゲルの各架橋に切断可能なリンカーを導入するために、式(3)で示される分子との反応によって導入される切断可能なリンカーをさらに含む。
一実施態様において、第1のプレポリマーは、4アームのPEGを含み、各アームは、2つの相互に非反応性（「直交」）の官能基BおよびCを有するアダプターユニットで終端されている。BおよびCは、その後の工程での選択的化学を可能にするために、最初は保護された形で存在し得る。特定の実施態様において、アダプター単位は、アミノ酸の誘導体、特にリシン、システイン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、αアミン基がアジドに変換された誘導体、例えば2-アジドグルタル酸のモノエステルを含む。アダプターユニットは、各プレポリマーアーム上の官能基Aとアダプターユニット上の同族の官能基A'との縮合によって形成される接続官能基A*を介して各第1プレポリマーアームに接続される。第2プレポリマーは、4アームのPEGを含み、各アームは、第1のプレポリマーの基Cと相互に反応性を有する官能基C'で終端され、CとC'が反応してC*を形成するときに2つのプレポリマー間の架橋が起こる。
実例として、第1プレポリマーを以下のように製造した。H-Lys(Boc)-OHを、式3（式中、Z＝アジド）のリンカーでアシル化して、A＝COOH、B＝Boc保護NH2およびC＝アジドであるアダプターユニットを得た。これを20kDaの4アームPEG-テトラアミンに結合させ、Boc基を除去して、第1プレポリマーを提供し、ここで、A*＝アミド、B＝NH2、C＝アジドであり、式3の切断可能なリンカーが各アームと第1プレポリマーの基Cの間の結合に組み込まれている。対応する第2プレポリマーは、20kDaの4アームPEG-テトラアミンを5-シクロオクチニルスクシンイミジルカーボネートでアシル化して、C'＝シクロオクチンである第2プレポリマーを得ることによって製造した。第1プレポリマーと第2プレポリマーを混合すると、C＝アジド基とC'＝シクロオクチン基の反応により、対応するトリアゾール基が形成され、これにより2つのプレポリマーが3次元ネットワークに架橋され、ここで、各架橋は、式3の化合物の組み込みにより生じる切断リンカーを含み、第1プレポリマーの組み込みにより生じる各ノードは、更なるリンカー、薬物、フルオロフォア、金属キレート剤などの結合のために誘導体化できる残りの官能基B＝NH2を含む。このタイプのヒドロゲルは、様々なサイズ、例えば5、10、20および40kDaのPEGを用いて製造されている。これらのヒドロゲルのマイクロスフェア懸濁液は、典型的には、直径20～100μmの粒子を含むが、他のサイズおよび物理的形状のヒドロゲルを製造することもできる。蒸気滅菌下でのヒドロゲルの安定性は、主にβ脱離によるクロスリンカーの切断速度によって制御され；これはリンカーの特性ならびに媒体のpHおよび温度に依存するが、PEGまたはヒドロゲルのサイズおよび形状には依存しないので、ヒドロゲル構造のそのようなすべての変異型は、本発明での使用に適している。
A*＝アミド、B＝アミン、C＝アジドであるプレポリマーA
(1)Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OH
Boc-Lys-OH（2.96g、12.0mmol）の28mLのH2O中の溶液を、1M aq NaOH（12.0mL、12.0mmol）、1M aq NaHCO3（10.0mL、10.0mmol）、およびO-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチル}-O'-スクシンイミジルカーボネート（3.91g、10.0mmol、0.1Mの最終濃度）の50mLのMeCN中の溶液で連続して処理した。周囲温度にて2時間撹拌後、反応がC18 HPLC（ELSD）により完了したことを判断した。反応物を30mLの1M KHSO4（aq）でクエンチした。混合物を500mLの1：1 EtOAc：H2Oに分配した。水相を100mLのEtOAcで抽出した。合わせた有機相をH2Oおよび食塩水（各100mL）で洗浄し、その後MgSO4で乾燥し、ろ過し、ロータリー蒸発により濃縮して、粗製表題化合物（5.22g、9.99mmol、粗収率99.9％）を白色のフォームとして得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.1％（RV＝9.29mL）。
LC-MS(m/z)：計算値521.2；測定値521.3 [M-H]-。
(2)Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OSu
ジシクロヘキシルカルボジイミド（キシレン中60％、2.6M、4.90mL、12.7mmol）を、Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OH（5.11g、9.79mmol、0.1Mの最終濃度）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（1.46g、12.7mmol）の98mLのCH2Cl2中の溶液に加えた。反応物懸濁液を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）によりモニターした。2.5時間後、反応混合物をろ過し、ろ液をSiliaSep 120gカラムに負荷した。生成物を、アセトンのヘキサン中の段階的グラジェント（0％、20％、30％、40％、50％、60％、各240mL）で溶離した。清浄な生成物含有画分を合わせて濃縮して、表題化合物（4.95g、7.99mmol、収率81.6％）を白色のフォームとして得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.7％（RV＝10.23mL）。
LC-MS(m/z)：計算値520.2；測定値520.2 [M+H-Boc]+。
Boc-Lys-OH（2.96g、12.0mmol）の28mLのH2O中の溶液を、1M aq NaOH（12.0mL、12.0mmol）、1M aq NaHCO3（10.0mL、10.0mmol）、およびO-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチル}-O'-スクシンイミジルカーボネート（3.91g、10.0mmol、0.1Mの最終濃度）の50mLのMeCN中の溶液で連続して処理した。周囲温度にて2時間撹拌後、反応がC18 HPLC（ELSD）により完了したことを判断した。反応物を30mLの1M KHSO4（aq）でクエンチした。混合物を500mLの1：1 EtOAc：H2Oに分配した。水相を100mLのEtOAcで抽出した。合わせた有機相をH2Oおよび食塩水（各100mL）で洗浄し、その後MgSO4で乾燥し、ろ過し、ロータリー蒸発により濃縮して、粗製表題化合物（5.22g、9.99mmol、粗収率99.9％）を白色のフォームとして得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.1％（RV＝9.29mL）。
LC-MS(m/z)：計算値521.2；測定値521.3 [M-H]-。
(2)Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OSu
ジシクロヘキシルカルボジイミド（キシレン中60％、2.6M、4.90mL、12.7mmol）を、Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OH（5.11g、9.79mmol、0.1Mの最終濃度）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（1.46g、12.7mmol）の98mLのCH2Cl2中の溶液に加えた。反応物懸濁液を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）によりモニターした。2.5時間後、反応混合物をろ過し、ろ液をSiliaSep 120gカラムに負荷した。生成物を、アセトンのヘキサン中の段階的グラジェント（0％、20％、30％、40％、50％、60％、各240mL）で溶離した。清浄な生成物含有画分を合わせて濃縮して、表題化合物（4.95g、7.99mmol、収率81.6％）を白色のフォームとして得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.7％（RV＝10.23mL）。
LC-MS(m/z)：計算値520.2；測定値520.2 [M+H-Boc]+。
(3)(Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys)4-PEG20kDa
PEG20kDa-(NH)4（20.08g、0.9996mmol、3.998mmol NH2、0.02M NH2最終濃度)を145mLのMeCN中に溶解させた。Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OSu（2.976g、4.798mmol）の50mLのMeCN中の溶液を加えた。反応物を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）により分析した。出発物質を、3つのゆっくりと溶出する中間ピークを介して単一の生成物ピークに変換した。1時間後、Ac2O（0.37mL、4.0mmol）を加えた。反応混合物を30分超撹拌し、その後、ロータリー蒸発により約50mLまで濃縮した。反応濃縮物を400mLの撹拌MTBEに加えた。混合物を周囲温度にて30分間撹拌し、その後デカントした。MTBE（400mL）を湿潤固体に加え、懸濁液を5分間撹拌し、デカントした。固体を真空フィルターに移し、3×100mLのMTBEで洗浄/粉砕した。フィルター上で10分間乾燥させた後、固体を、風袋を量った250mLHDPE包装ボトルに移した。重量が安定するまで残留揮発性物質を高真空下で除去して、表題化合物（21.23g、0.9602mmol、収率96.1％を白色の固体として得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定し：89.1％（RV＝10.38mL）、10.6％（RV＝10.08）の純度であった。
PEG20kDa-(NH)4（20.08g、0.9996mmol、3.998mmol NH2、0.02M NH2最終濃度)を145mLのMeCN中に溶解させた。Nα-Boc-Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys-OSu（2.976g、4.798mmol）の50mLのMeCN中の溶液を加えた。反応物を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）により分析した。出発物質を、3つのゆっくりと溶出する中間ピークを介して単一の生成物ピークに変換した。1時間後、Ac2O（0.37mL、4.0mmol）を加えた。反応混合物を30分超撹拌し、その後、ロータリー蒸発により約50mLまで濃縮した。反応濃縮物を400mLの撹拌MTBEに加えた。混合物を周囲温度にて30分間撹拌し、その後デカントした。MTBE（400mL）を湿潤固体に加え、懸濁液を5分間撹拌し、デカントした。固体を真空フィルターに移し、3×100mLのMTBEで洗浄/粉砕した。フィルター上で10分間乾燥させた後、固体を、風袋を量った250mLHDPE包装ボトルに移した。重量が安定するまで残留揮発性物質を高真空下で除去して、表題化合物（21.23g、0.9602mmol、収率96.1％を白色の固体として得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定し：89.1％（RV＝10.38mL）、10.6％（RV＝10.08）の純度であった。
(4)(Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys)4-PEG20kDa
(Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys)4-PEG20kDa（19.00g、0.8594mmol、3.438mmol Boc、0.02M Boc最終濃度）を86mLの1,4-ジオキサン中に溶解させた。PEGが完全に溶解するまで5分間撹拌後、ジオキサン中の4M HCl（86mL、344mmol HCl）を加えた。反応物を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）により分析した。出発物質を、3つのゆっくりと溶出する中間ピークを介して単一の生成物ピークに変換した。2時間後、反応混合物を約40mLまで濃縮した。THF（10mL）を濃縮物に加え、溶液を再度約40mLまで濃縮した。粘稠な油を400mLの撹拌Et2Oに注いだ。周囲温度にて20分間撹拌後、上清を沈殿からデカントした。湿潤固体を、200mLのEt2Oを用いて真空フィルターに移し、Et2O（3×75mL）で洗浄した。固体を、フィルター上で10分間乾燥させ、その後、風袋を量った250mLHDPE包装ボトルに移した。残留揮発性物質を高真空下で一晩除去して、表題化合物（17.52g、0.8019mmol、4HClにて収率93.3％）を白色の固体として得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.2％（RV＝9.34mL）。
(Nε-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノスルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-Lys)4-PEG20kDa（19.00g、0.8594mmol、3.438mmol Boc、0.02M Boc最終濃度）を86mLの1,4-ジオキサン中に溶解させた。PEGが完全に溶解するまで5分間撹拌後、ジオキサン中の4M HCl（86mL、344mmol HCl）を加えた。反応物を周囲温度にて撹拌し、C18 HPLC（ELSD）により分析した。出発物質を、3つのゆっくりと溶出する中間ピークを介して単一の生成物ピークに変換した。2時間後、反応混合物を約40mLまで濃縮した。THF（10mL）を濃縮物に加え、溶液を再度約40mLまで濃縮した。粘稠な油を400mLの撹拌Et2Oに注いだ。周囲温度にて20分間撹拌後、上清を沈殿からデカントした。湿潤固体を、200mLのEt2Oを用いて真空フィルターに移し、Et2O（3×75mL）で洗浄した。固体を、フィルター上で10分間乾燥させ、その後、風袋を量った250mLHDPE包装ボトルに移した。残留揮発性物質を高真空下で一晩除去して、表題化合物（17.52g、0.8019mmol、4HClにて収率93.3％）を白色の固体として得た。
C18 HPLC、純度をELSDにより決定した：99.2％（RV＝9.34mL）。
C'＝シクロオクチニルであるプレポリマー
4mLのスクリュートップバイアルに、PEG20kDa-[NH2]4（SunBright PTE-200PA；150mg、7.6μmol PEG、30.2μmol NH2、1.0当量、20mMの最終アミン濃度）、MeCN（1.5mL）、およびiPr2NEt（7μL、40μmol、1.3当量、27mMの最終濃度）を入れた。活性化エステルシクロオクチンの溶液（39μmol、1.3当量、27mMの最終濃度）を加え、反応混合物を周囲温度にて撹拌した。反応物をELSDによるC18 HPLC（11分間で20～80％B）によりモニターした。完了すると、Ac2O（3μL、30μmol、開始NH2当たり1当量）を反応混合物に加え、混合物を30分間撹拌した。その後、反応混合物を濃厚な油に濃縮し、MTBE（20mL）中に懸濁させた。得られた懸濁液を10分間激しく撹拌した。激しく混合し、遠心分離（2800rpm、4℃、10分）でペレット化し、ピペットにより上清を除去することにより、得られた固体をMTBE（20mL）で3回粉砕した。得られた固体を30分以内で周囲温度にて真空下乾燥した。ストック溶液を、20mM NaOAc（pH5）中で、標的アミン濃度を20mMにして製造した。その後、シクロオクチン濃度を、PEG7-N3（2当量）で処理し、未反応のPEG7-N3をDBCO-CO2Hで逆滴定することによって確認した。
4mLのスクリュートップバイアルに、PEG20kDa-[NH2]4（SunBright PTE-200PA；150mg、7.6μmol PEG、30.2μmol NH2、1.0当量、20mMの最終アミン濃度）、MeCN（1.5mL）、およびiPr2NEt（7μL、40μmol、1.3当量、27mMの最終濃度）を入れた。活性化エステルシクロオクチンの溶液（39μmol、1.3当量、27mMの最終濃度）を加え、反応混合物を周囲温度にて撹拌した。反応物をELSDによるC18 HPLC（11分間で20～80％B）によりモニターした。完了すると、Ac2O（3μL、30μmol、開始NH2当たり1当量）を反応混合物に加え、混合物を30分間撹拌した。その後、反応混合物を濃厚な油に濃縮し、MTBE（20mL）中に懸濁させた。得られた懸濁液を10分間激しく撹拌した。激しく混合し、遠心分離（2800rpm、4℃、10分）でペレット化し、ピペットにより上清を除去することにより、得られた固体をMTBE（20mL）で3回粉砕した。得られた固体を30分以内で周囲温度にて真空下乾燥した。ストック溶液を、20mM NaOAc（pH5）中で、標的アミン濃度を20mMにして製造した。その後、シクロオクチン濃度を、PEG7-N3（2当量）で処理し、未反応のPEG7-N3をDBCO-CO2Hで逆滴定することによって確認した。
この手順を用いて製造されたマクロモノマーは、MFCOペンタフルオロフェニルエステル、5-((4-ニトロフェノキシ-カルボニル)オキシ)シクロオクチン、3-(4-ニトロフェノキシカルボニル)オキシシクロオクチン、BCNヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、DIBO4-ニトロフェニルカーボネート、3-(カルボキシメトキシ)シクロオクチンスクシンイミジルエステル、および3-(ヒドロキシエトキシ)シクロオクチン4-ニトロフェニルカーボネートをそれぞれ用いて製造した、シクロオクチン基が、MFCO、5-ヒドロキシシクロオクチン、3-ヒドロキシシクロオクチン、BCN(ビシクロ[6.1.0]ノナ-4-イン-9-イルメチル)、DIBO、3-(カルボキシメトキシ)シクロオクチン、および3-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロオクチンを含む。
ヒドロゲルマイクロスフェアの製造。ヒドロゲルマイクロスフェアを、Schneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15に記載のとおり製造し、活性化させた。
実施例6 滅菌ヒドロゲルコンジュゲートの製造
例えばPCT出願US2020/026726（2020年4月3日出願）および米国特許第9,649,385号に記載のように、本発明の滅菌ヒドロゲルは、小分子、ペプチド、タンパク質または核酸薬物の結合によるインビボ投与に適した滅菌ヒドロゲル-薬物コンジュゲートの製造に使用し得る。一般に、滅菌ヒドロゲルコンジュゲートを作る方法は、(1)ヒドロゲルマイクロスフェアの滅菌；(2)コンジュゲートのためのヒドロゲルマイクロスフェアの活性化；(3)コンジュゲートの3つの工程を含む。非無菌条件下での工程(2)および(3)の標準的な手順は、以前に説明されている（例えばSchneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15参照）。本発明では、これらの方法は、すべての液体が適切な滅菌フィルターを通して導入される、密閉された滅菌篩底撹拌洗浄機/反応器でそれらを実施することにより、無菌処理に適合する（Henise et al. (2020), Engineering Reports. 2020;e12213. https://doi.org/10.1002/eng2.12213参照）。工程(1)について、適切な緩衝液、例えばpH2～5の酢酸またはリン酸緩衝液中のヒドロゲルマイクロスフェアスラリーを洗浄機/反応器に入れ、滅菌フィルターで閉じ、本発明の方法に従ってオートクレーブ処理する。懸濁液を周囲温度まで冷却し、滅菌緩衝液を、篩の底を通って流し出すことにより除去する。その後、得られた滅菌マイクロスフェアスラリーを滅菌緩衝液または水で洗浄し、活性化工程に適した溶媒に交換する。工程(2)では、有機溶媒中の滅菌マイクロスフェアスラリーを、活性化剤、および活性化基の結合に必要な中和塩基で処理する。すべての試薬を、適切な滅菌フィルターを通して洗浄機/反応器に導入し、過剰な試薬を反応の最後に篩の底から除去する。工程(3)について、滅菌活性化ヒドロゲルマイクロスフェアを適切なローディング緩衝液中に懸濁させ、コンジュゲートするリンカー-薬物の溶解性および安定性に基づいて選択し、リンカー-薬物の溶液を適切な滅菌フィルターを通して導入する。必要に応じて、コンジュゲート反応は、洗浄機/反応器を加熱することにより高温で、または冷却することによって周囲温度よりも低い温度で実施し得る。コンジュゲートが完了すると、過剰な試薬を篩の底から除去し、滅菌マイクロスフェアコンジュゲートを適切な保存または投与製剤に交換する。
例えばPCT出願US2020/026726（2020年4月3日出願）および米国特許第9,649,385号に記載のように、本発明の滅菌ヒドロゲルは、小分子、ペプチド、タンパク質または核酸薬物の結合によるインビボ投与に適した滅菌ヒドロゲル-薬物コンジュゲートの製造に使用し得る。一般に、滅菌ヒドロゲルコンジュゲートを作る方法は、(1)ヒドロゲルマイクロスフェアの滅菌；(2)コンジュゲートのためのヒドロゲルマイクロスフェアの活性化；(3)コンジュゲートの3つの工程を含む。非無菌条件下での工程(2)および(3)の標準的な手順は、以前に説明されている（例えばSchneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15参照）。本発明では、これらの方法は、すべての液体が適切な滅菌フィルターを通して導入される、密閉された滅菌篩底撹拌洗浄機/反応器でそれらを実施することにより、無菌処理に適合する（Henise et al. (2020), Engineering Reports. 2020;e12213. https://doi.org/10.1002/eng2.12213参照）。工程(1)について、適切な緩衝液、例えばpH2～5の酢酸またはリン酸緩衝液中のヒドロゲルマイクロスフェアスラリーを洗浄機/反応器に入れ、滅菌フィルターで閉じ、本発明の方法に従ってオートクレーブ処理する。懸濁液を周囲温度まで冷却し、滅菌緩衝液を、篩の底を通って流し出すことにより除去する。その後、得られた滅菌マイクロスフェアスラリーを滅菌緩衝液または水で洗浄し、活性化工程に適した溶媒に交換する。工程(2)では、有機溶媒中の滅菌マイクロスフェアスラリーを、活性化剤、および活性化基の結合に必要な中和塩基で処理する。すべての試薬を、適切な滅菌フィルターを通して洗浄機/反応器に導入し、過剰な試薬を反応の最後に篩の底から除去する。工程(3)について、滅菌活性化ヒドロゲルマイクロスフェアを適切なローディング緩衝液中に懸濁させ、コンジュゲートするリンカー-薬物の溶解性および安定性に基づいて選択し、リンカー-薬物の溶液を適切な滅菌フィルターを通して導入する。必要に応じて、コンジュゲート反応は、洗浄機/反応器を加熱することにより高温で、または冷却することによって周囲温度よりも低い温度で実施し得る。コンジュゲートが完了すると、過剰な試薬を篩の底から除去し、滅菌マイクロスフェアコンジュゲートを適切な保存または投与製剤に交換する。
実施例7 滅菌ヒドロゲル-エキセナチドコンジュゲートの製造
本発明の滅菌ヒドロゲルの使用を例示するために、エクセナチドペプチド誘導体[Gln28]エキセナチドのヒドロゲルマイクロスフェアへの滅菌コンジュゲートを製造した。
本発明の滅菌ヒドロゲルの使用を例示するために、エクセナチドペプチド誘導体[Gln28]エキセナチドのヒドロゲルマイクロスフェアへの滅菌コンジュゲートを製造した。
(1)リンカー-薬物、Nα-{4-アジド-3,3-ジメチル-1-[(N,N-ジメチル)アミノ-スルホニル]-2-ブチルオキシカルボニル}-[Gln28]エキセナチドの製造は、PCT出願US/2020/026726（2020年4月3日出願；出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。25mlのフリットSPEカラムにおいて、リンクアミド樹脂上の保護[Gln28]エキセナチド（fmocα-アミン）（0.63meq/g置換、0.12mmolペプチド/gペプチド樹脂、1.00gペプチド樹脂、0.12mmolペプチド）を、10mlのDMF中で30分間周囲温度にて膨潤させた。f/fルアーアダプターおよび12mlシリンジを用いて、DMFをシリンジろ過により除去し、膨潤樹脂をDMF中の5％4-メチルピペリシン（2×10ml、各5分；その後2×10ml、各20分）で処理した。その後、fmoc保護樹脂をDMF（10×10ml）で洗浄し、上清をシリンジろ過により除去した。洗浄樹脂を8.4mlのDMF中に懸濁させ、3.6mlの4-アジド-3,3-ジメチル-1-[（N,N-ジメチル）アミノスルホニル]-2-ブチルスクシンイミジルカーボネート（DMF中0.10m、0.36mmol、30mm最終濃度）および4-メチルモルホリン（40μl、0.36mmol、30mmの最終濃度）で処理した。オービタルシェーカーを用いて反応混合物を撹拌した。20時間後、上清をシリンジろ過により除去し、樹脂をDMF（5×15ml）およびCH2Cl2（5×15ml）で連続洗浄した。カイザーテストは、中間リンカー修飾樹脂中の遊離アミンに対して陰性であった。その後、オービタルシェーカーで穏やかに撹拌しながら、樹脂を10mlの予冷却（0℃）90：5：5のトリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：H2Oで処理した。2時間後、樹脂を真空ろ過し、TFA（2×1.5ml）で洗浄した。ろ液をロータリー蒸発により約6mlまで濃縮した。風袋を量った50mlファルコンチューブ中で40mlの-20℃MTBEにTFA濃縮物を滴下することにより、粗製リンカー-ペプチドを沈殿させた。-20℃で10分間インキュベート後、粗製リンカー-ペプチド懸濁液を遠心分離（3000×g、2分、4℃）ペレット化し、上清をデカントした。得られたペレットを40mlの-20℃MTBE中に懸濁させ、ボルテックスして混合し、遠心分離し、上記のようにデカントした。高真空下で乾燥後、ペレットをオフホワイトの固体（575mg）として単離し、その後これを8mlの5％酢酸（約70mg/ml）中に溶解させた。50℃水浴中で45分間加熱後、溶液を分取C18 HPLCにより精製して、13mlの表題化合物（3.33mm、A280により43μmol）を水溶液として得た。凍結乾燥により235mgの白色の固体を得た。C18 HPLC純度を280nmにて決定した：90.0％（RV＝11.47ml）。Mav：計算値4476.9；測定値476。
(2)式(2)で示され、式中R1＝SO2NMe2であるヒドロゲルマイクロスフェアは、上記の実施例5に記載のとおり製造した。ヒドロゲルマイクロスフェアを0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）中に懸濁させ、洗浄機/反応器に入れ、オートクレーブ内で121℃にて保持時間20分で蒸気滅菌した。
(3)緩衝液を、滅菌ヒドロゲルマイクロスフェア懸濁液から洗浄機/反応器の篩の底を通って流し出し、マイクロスフェアを、滅菌フィルターを通して導入したアセトニトリルに交換した。BCNスクシンイミジルカーボネート（26mM、1.2当量/マイクロスフェアアミン当量）およびトリエチルアミン（172mM、4当量/マイクロスフェアアミン当量）のアセトニトリル中の溶液を、滅菌フィルターを通して加え、混合物を3時間穏やかに撹拌した。過剰な試薬を、洗浄機/反応器の篩の底を通って流し出し、マイクロスフェアを、滅菌フィルターを通して導入したアセトニトリルで洗浄し、続いて、50％の0.1Mクエン酸（pH3.5）、50％のイソプロパノール、30mMメチオニンローディング緩衝液で洗浄し、再懸濁させた。
(4)リンカー-薬物のローディング緩衝液中の溶液（24mM、1.1モル当量/マイクロスフェアアミン当量）を滅菌フィルターで導入し、混合物を40℃まで穏やかに温めながら21時間撹拌した。過剰な試薬を洗浄機/反応器の篩の底から流し出し、マイクロスフェアをIPA/クエン酸/メチオニン緩衝液で洗浄して、[Gln28]エキセナチドを負荷したヒドロゲルマイクロスフェアの滅菌懸濁液を得た。得られたマイクロスフェアの分析は、1mgマイクロスフェアスラリー当たり4.2±0.2nmolペプチドの薬物含有量を示した。
Claims (20)
- β脱離により分解するクロスリンカーと結合したヒドロゲルを滅菌する方法であって、該クロスリンカーの分解を最小限にするために該ヒドロゲルを含有する媒体のpHを調節すること、および滅菌を行うのに十分な温度および時間まで加熱することを含む方法。
- 媒体のpHが、該媒体の非反応性緩衝化により決定される、請求項1に記載の方法。
- 緩衝液が、リン酸緩衝液または酢酸緩衝液である、請求項2に記載の方法。
- 調節したpHが、2～5である、請求項1に記載の方法。
- β脱離による分解速度が、クロスリンカーに含まれる1つ以上の置換基により制御される、請求項１に記載の方法。
- ヒドロゲルが、式：
mが、0または1であり；
Xが、クロスリンカーを第1ポリマーに接続する官能基を含み；
R1、R2およびR5の少なくとも1つが、クロスリンカーを第2ポリマーに接続する官能基Zを含み；
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］；
あるいは
mが、0または1であり；
nが、1～1000であり；
sが、0～2であり；
tが、2、4、8、16または32であり；
Wが、O(C=O)O、O(C=O)NH、O(C=O)S、
Qが、原子価＝tを有するコア基であり；
ここで、R1、R2およびR5の少なくとも1つが、ポリマーと接続できる官能基Z1を含み、そして
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；および
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］
で示されるクロスリンカーを含む、請求項5に記載の方法。 - Xが、カルバメートであり、Zが、トリアゾール、カルボキサミドまたはカルバメートである、請求項5に記載の方法。
- ヒドロゲルが、式：
- R1が、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
である、請求項8に記載の方法。 - R1が、CNまたはSO2R3であり、ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する、請求項8に記載の方法。 - R1が、CN；SO2Me；SO2NMe2；SO2N(CH2CH2)2XまたはSO2(Ph-R10)であり、ここで、Xが、存在しないか、OまたはCH-R10であり、R10が、H、アルキル、アルコキシ、NO2またはハロゲンである、請求項8に記載の方法。
- 滅菌が、20分の保持時間で121℃に加熱することにより達成される、請求項1に記載の方法。
- 滅菌を行うのに十分な温度に加熱することにより滅菌されたβ脱離機構により分解可能なクロスリンカーを含むヒドロゲル。
- 微粒子の懸濁液である、請求項13に記載のヒドロゲル。
- β脱離機構により分解可能なクロスリンカーが、式
mが、0または1であり；
Xが、クロスリンカーを第1ポリマーに接続する官能基を含み；
ここで、R1、R2およびR5の少なくとも1つが、クロスリンカーを第2ポリマーに接続する官能基Zを含み；
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］；
あるいは
mが、0または1であり；
nが、1～1000であり；
sが、0～2であり；
tが、2、4、8、16または32であり；
Wが、O(C=O)O、O(C=O)NH、O(C=O)S、
Qが、原子価＝tを有するコア基であり；
ここで、R1、R2およびR5の少なくとも1つが、クロスリンカーを第2ポリマーに接続する官能基Zを含み、そして
R1およびR2の少なくとも1つまたは両方が、独立して、CN；NO2；
置換されていてもよいアリール；
置換されていてもよいヘテロアリール；
置換されていてもよいアルケニル；
置換されていてもよいアルキニル；
COR3またはSOR3またはSO2R3（ここで、
R3が、H、または置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；または
OR9またはNR9 2であり、ここで、各Rが、独立して、Hまたは置換されていてもよいアルキルであり、あるいは、両方のR9基が、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
SR4（ここで、
R4が、置換されていてもよいアルキル；
各々置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル；または
各々置換されていてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）
であり；
R1およびR2が結合して、3～8員環を形成してもよく；そして
R1およびR2の1つのみが、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであってもよく；および
各R5が、独立して、H、または各々置換されていてもよいアルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、(OCH2CH2)pO-アルキル（ここで、p＝1～1000）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである］
を有する、請求項13に記載のヒドロゲル。 - m＝0、R2が、Hであり、1つのR5が、Hであり、その他が、C(Me)2(CH2)nZであり、n＝0～6、Wが、
- ヒドロゲルが、式：
- 滅菌が、pH2～5の緩衝液中のヒドロゲルの懸濁液を121℃の温度に20分の保持時間で加熱することにより達成される、請求項13に記載のヒドロゲル。
- 滅菌ヒドロゲルコンジュゲートを製造する方法であって、下記工程
(a)適切なpH、温度および時間でオートクレーブすることにより、ヒドロゲルを滅菌する工程；
(b)所望により、コンジュゲートのために滅菌ヒドロゲルを活性化する工程；および
(c)コンジュゲートの滅菌を維持する条件下で、薬物またはリンカー-薬物を滅菌ヒドロゲルに結合させる工程
を含む、方法。 - 薬物が、ペプチド、タンパク質または小分子である、請求項19に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962883982P | 2019-08-07 | 2019-08-07 | |
| US62/883,982 | 2019-08-07 | ||
| PCT/US2020/045484 WO2021026494A1 (en) | 2019-08-07 | 2020-08-07 | Steam sterilization of hydrogels crosslinked by beta-eliminative linkers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022544109A true JP2022544109A (ja) | 2022-10-17 |
| JPWO2021026494A5 JPWO2021026494A5 (ja) | 2023-08-15 |
Family
ID=74503661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022507351A Pending JP2022544109A (ja) | 2019-08-07 | 2020-08-07 | β脱離リンカーにより架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220265873A1 (ja) |
| EP (1) | EP4010041A4 (ja) |
| JP (1) | JP2022544109A (ja) |
| KR (1) | KR20220045975A (ja) |
| CN (1) | CN114585397A (ja) |
| AU (1) | AU2020327038A1 (ja) |
| BR (1) | BR112022002308A2 (ja) |
| CA (1) | CA3152373A1 (ja) |
| MX (1) | MX2022001528A (ja) |
| WO (1) | WO2021026494A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2020335917A1 (en) * | 2019-08-28 | 2022-03-17 | Prolynx Llc | Conjugated inhibitors of DNA damage response |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102109067B1 (ko) * | 2011-09-07 | 2020-05-13 | 프로린크스 엘엘시 | 생분해성 교차결합을 가지는 하이드로젤 |
| WO2014032780A1 (en) * | 2012-08-28 | 2014-03-06 | University Of Geneva | Hybrid hydrogels |
| FR3024362A1 (fr) * | 2014-08-01 | 2016-02-05 | Synolyne Pharma Sa | Composition thermogelifiable sterilisee |
| AU2017234680A1 (en) * | 2016-03-16 | 2018-10-11 | Prolynx Llc | Extended release conjugates of exenatide analogs |
| WO2019066505A1 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 주식회사 엘지화학 | 히알루론산 기반 하이드로겔 약제학적 안정화 조성물 및 그 제조방법 |
| KR20190038368A (ko) * | 2017-09-29 | 2019-04-08 | 주식회사 엘지화학 | 히알루론산 기반 하이드로겔 약제학적 안정화 조성물 및 그 제조방법 |
-
2020
- 2020-08-07 EP EP20849666.1A patent/EP4010041A4/en active Pending
- 2020-08-07 BR BR112022002308A patent/BR112022002308A2/pt unknown
- 2020-08-07 CN CN202080069493.8A patent/CN114585397A/zh active Pending
- 2020-08-07 US US17/631,325 patent/US20220265873A1/en active Pending
- 2020-08-07 MX MX2022001528A patent/MX2022001528A/es unknown
- 2020-08-07 KR KR1020227007524A patent/KR20220045975A/ko unknown
- 2020-08-07 CA CA3152373A patent/CA3152373A1/en active Pending
- 2020-08-07 AU AU2020327038A patent/AU2020327038A1/en active Pending
- 2020-08-07 WO PCT/US2020/045484 patent/WO2021026494A1/en unknown
- 2020-08-07 JP JP2022507351A patent/JP2022544109A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4010041A4 (en) | 2024-10-02 |
| BR112022002308A2 (pt) | 2022-04-26 |
| KR20220045975A (ko) | 2022-04-13 |
| AU2020327038A1 (en) | 2022-03-24 |
| CA3152373A1 (en) | 2021-02-11 |
| CN114585397A (zh) | 2022-06-03 |
| EP4010041A1 (en) | 2022-06-15 |
| MX2022001528A (es) | 2022-03-11 |
| WO2021026494A1 (en) | 2021-02-11 |
| US20220265873A1 (en) | 2022-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022526985A (ja) | 改良されたコンジュゲーションリンカー | |
| JP4766528B2 (ja) | 自己組織化ペプチドおよびそれより得られるゲル | |
| KR0168709B1 (ko) | N-치환 올리고머의 합성 | |
| Zhang et al. | Tunable diblock copolypeptide hydrogel depots for local delivery of hydrophobic molecules in healthy and injured central nervous system | |
| EP1157039B1 (fr) | Peptides collageniques modifies par greffage de fonctions mercapto, l'un de leurs procedes d'obtention et leurs applications comme biomateriaux | |
| Wollenberg et al. | Injectable polypeptide hydrogels via methionine modification for neural stem cell delivery | |
| US8691204B2 (en) | Synthetic diblock copolypeptide hydrogels for use in the central nervous system | |
| ES2627486T3 (es) | Biomoléculas sililadas | |
| AU666858B2 (en) | Amino acid derivative and bromoacetyl modified peptides | |
| JP2022544109A (ja) | β脱離リンカーにより架橋したヒドロゲルの蒸気滅菌 | |
| Leiro et al. | Conjugation chemistry principles and surface functionalization of nanomaterials | |
| Shi et al. | Synthesis and properties of mono-or diamine-initiated imidazolium-based cationic polypeptides | |
| US9012594B2 (en) | Catalyst and byproduct-free native chemical ligation using cyclic thioester precursors | |
| WO2015169908A1 (en) | Thiol-protected amino acid derivatives and uses thereof | |
| JP2024510908A (ja) | ペプチド抗原用の担体タンパク質 | |
| AU2003217060B2 (en) | Charge-balanced chemoselective linkers | |
| CN115260300A (zh) | 一种（甲基）丙烯酰基修饰的丝蛋白及其制备方法和应用 | |
| EP1335937A2 (en) | Mixed fibrils | |
| US20040096852A1 (en) | Mixed fibrils | |
| WO2023225692A1 (en) | Polymer system for forming a hydrogel | |
| Zhu | Designing soft material exploiting peptide-PEG conjugates for biomedical applications | |
| Pitkäranta | Synthesis and study of two hydrogelators derived from L-Valine | |
| WO2022261741A1 (en) | Methods and uses for restoring, solubilizing and stabilizing polypeptides | |
| Chen | Synthesis and characterization of polymers incorporating N-alkyl urea-peptoid sequences | |
| Malda | Designing dendrimers for use in biomedical applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230804 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230804 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240402 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240701 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240830 |