CN114563510A - 一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药检测技术领域，涉及一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法。将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，利用检测谱图建立指纹图谱；高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈‑0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。本发明研究发现，采用相同的流动相、色谱柱及检测波长，能够同时对不同小柴胡汤类方进行高效液相色谱检测，减少检测前流动相容易的配制、色谱柱的更换及检测波长的输入，大大节省检测不同小柴胡汤类方的准备时间。

Description

一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，涉及一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

基于少阳病方证的小柴胡汤类方包括大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤、柴胡龙骨牡蛎汤等。据发明人研究了解，不同小柴胡汤类方指纹图谱的建立需要选择不同流动相、色谱柱及检测波长进行检测，当需要同时建立不同小柴胡汤类方的指纹图谱时，操作繁琐，准备时间较长，大大提高时间成本。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，能够大大降低对不同小柴胡汤类方指纹图谱的建立的准备时间。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

另一方面，一种上述小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法在建立小柴胡汤类方指纹图谱中的应用。

第三方面，一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，利用检测谱图建立指纹图谱；高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

本发明研究不同小柴胡汤类方指纹图谱的过程中，经过实验意外发现，不同小柴胡汤类方优化后的流动相、色谱柱及检测波长相同，在这种流动相、色谱柱及检测波长的检测下，高效液相色谱表现出更多的峰的数量，且峰型较好，更有利于小柴胡汤类方指纹图谱的建立。同时采用相同的流动相、色谱柱及检测波长，能够同时对不同小柴胡汤类方进行高效液相色谱检测，减少检测前流动相容易的配制、色谱柱的更换及检测波长的输入，大大节省检测不同小柴胡汤类方的准备时间。

本发明所述的小柴胡汤类方优选包括大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤和柴胡龙骨牡蛎汤。

本发明的有益效果为：

经过实验表明，本发明仅配制一次流动相，在同一色谱柱及检测波长的条件下，即可对不同小柴胡汤类方进行高效液相色谱检测，在该流动相及色谱柱、检测波长下，对谱图中各特征峰的分离效果更好，峰的数量更多、峰型更好，从而有利于建立不同小柴胡汤类方指纹图谱。本发明的方法在建立不同小柴胡汤类方指纹图谱步骤简单，尤其在同时建立多种小柴胡汤类方指纹图谱过程中，建立指纹图谱的小柴胡汤类方种类越多，其省略的步骤更多，节约的时间更多，从而大大降低时间成本。

另外，本发明首次建立了柴胡加芒硝汤的指纹图谱，从而有利于柴胡加芒硝汤的现代化研究。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中大柴胡汤不同DAD波长下HPLC图；

图2为本发明实施例1中大柴胡汤不同色谱柱HPLC图；

图3为本发明实施例1中大柴胡汤不同流动相HPLC图；

图4为本发明实施例1中大柴胡汤254nm下HPLC图；

图5为本发明实施例1中大柴胡汤276nm下HPLC图；

图6为本发明实施例1中大柴胡汤ELSD检测HPLC图；

图7为本发明实施例1中大柴胡汤与各单味药HPLC图；

图8为本发明实施例2中小柴胡汤不同DAD波长下HPLC图；

图9为本发明实施例2中小柴胡汤不同色谱柱HPLC图；

图10为本发明实施例2中小柴胡汤不同流动相HPLC图；

图11为本发明实施例2中小柴胡汤254nm下HPLC图；

图12为本发明实施例2中小柴胡汤276nm下HPLC图；

图13为本发明实施例2中小柴胡汤ELSD检测HPLC图；

图14为本发明实施例2中小柴胡汤与各单味药HPLC图；

图15为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤不同DAD波长下HPLC图；

图16为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤不同色谱柱HPLC图；

图17为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤不同流动相HPLC图；

图18为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤254nm下HPLC图；

图19为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤276nm下HPLC图；

图20为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤ELSD检测HPLC图；

图21为本发明实施例3中柴胡加芒硝汤与各单味药HPLC图；

图22为本发明实施例4中柴胡桂枝汤不同DAD波长下HPLC图；

图23为本发明实施例4中柴胡桂枝汤不同色谱柱HPLC图；

图24为本发明实施例4中柴胡桂枝汤不同流动相HPLC图；

图25为本发明实施例4中柴胡桂枝汤254nm下HPLC图；

图26为本发明实施例4中柴胡桂枝汤276nm下HPLC图；

图27为本发明实施例4中柴胡桂枝汤ELSD检测HPLC图；

图28为本发明实施例4中柴胡桂枝汤与各单味药HPLC图；

图29为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤不同DAD波长下HPLC图；

图30为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤不同色谱柱HPLC图；

图31为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤不同流动相HPLC图；

图32为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤254nm下HPLC图；

图33为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤276nm下HPLC图；

图34为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤ELSD检测HPLC图；

图35为本发明实施例5中柴胡龙骨牡蛎汤与各单味药HPLC图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于建立小柴胡汤类方指纹图谱的过程中，不同中药需要采用不同流动相、色谱柱及检测波长进行检测，存在操作繁琐、准备时间较长等问题，本发明提出了一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

小柴胡汤类方中的君药为柴胡，本领域通常需要检测柴胡中的主要成分，但是本发明实验发现，检测柴胡的主要成分不利于其他组分中成分的检出，因而本发明采用基于检测波长为253～255nm和275～277nm，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，能够检测出更多的小柴胡汤类方中的特征峰，从而更有利于小柴胡汤类方指纹图谱的建立。

该实施方式的一些实施例中，小柴胡汤类方包括大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤和柴胡龙骨牡蛎汤。

该实施方式的一些实施例中，高效液相色谱采用的串联的ELSD检测器。

该实施方式的一些实施例中，高效液相色谱检测过程中，流速为0.5～1.5mL/min，进样量为15～25μL。

虽然流动相均为乙腈-0.19～0.21％甲酸水(乙腈为流动相B，0.19～0.21％甲酸水为流动相A)，但是不同小柴胡汤类方中所含的成分并不相同，因而需要通过合适的洗脱条件进行洗脱。

具体地，大柴胡汤的洗脱条件如下：

小柴胡汤的洗脱条件如下：

柴胡芒硝汤梯度洗脱条件如下：

柴胡桂枝汤梯度洗脱条件如下：

柴胡龙骨牡蛎汤梯度洗脱条件如下：

本发明的另一种实施方式，提供了一种上述小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法在建立小柴胡汤类方指纹图谱中的应用。

本发明的第三种实施方式，提供了一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，利用检测谱图建立指纹图谱；高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

该实施方式的一些实施例中，小柴胡汤类方包括大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤和柴胡龙骨牡蛎汤。

该实施方式的一些实施例中，高效液相色谱采用的串联的ELSD检测器。

该实施方式的一些实施例中，高效液相色谱检测过程中，流速为0.5～1.5mL/min，进样量为15～25μL。

流动相的梯度洗脱条件与高效液相色谱检测方法中记载的条件相同。

该实施方式的一些实施例中，将指纹图谱中的特征峰进行来源归属。

在一种或多种实施例中，来源归属的具体过程为：对小柴胡汤类方中的各单味药分别进行高效液相色谱检测，将指纹图谱中的特征峰与各单味药的高效液相色谱的特征峰进行对比，获得指纹图谱中的特征峰的来源。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中，Agilent 1220高效液相色谱仪(美国Aglient公司)；SB-5200T超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SQP-Sartorius分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，山东禹王试剂有限公司)；实验用水为超纯水。药材购买于济南建联中药店。

实施例1

大柴胡汤HPLC指纹图谱的建立。

大柴胡汤供试品溶液的制备：按伤寒论原方比例：柴胡24g、黄芩9g、芍药9g、半夏12g、生姜15g、枳实9g(炙)、大枣(擘)12枚、大黄6g。加入2400mL水，小火煮取1200mL，去除药渣，煮至600mL。

单味药材供试品溶液的制备：分别取柴胡24g、黄芩9g、芍药9g、半夏12g、生姜15g、枳实9g(炙)、大枣(擘)12枚、大黄6g，按上述方法制成单味药材供试品溶液。

色谱条件优化：

检测波长：DAD采集波长190-640nm，对比不同波长的HPLC图，最终选择254nm和276nm，同时选择ELSD图谱。色谱图如图1所示，可以看出254nm和276nm波长下，峰的数量较多且峰形较好，因此DAD检测选择254nm和276nm。

色谱柱：选择三根不同品牌的色谱柱(waters C18柱、agilent C18柱、kromasil100 C18柱规格均为250*4.6mm,5μm)对大柴胡汤进行色谱分析，结果如图2所示，可以看出使用waters C18柱各峰的分离效果较好，峰的数量较多，因此选择waters C18柱。

不同流动相对色谱峰分离的影响(乙腈-水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水)，结果如图3所示，可以看出，流动相为乙腈-0.2％甲酸水时各峰的分离效果较好，因此选择流动相为乙腈-0.2％甲酸水。

色谱条件确定：

色谱条件为waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件见表1；流速为1.0mL/min；DAD检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器；进样量为20μL。HPLC图见图4～6。

表1大柴胡汤梯度洗脱条件

大柴胡汤特征色谱峰的可能来源确认，将大柴胡汤指纹图谱分别于其组方中各单味药(柴胡、黄芩、半夏、生姜、大枣、芍药、枳实、大黄)的HPLC图谱(254nm)进行比对，如图7所示，通过对比各峰的保留时间，对各峰的可能来源进行归属，结果见表2。

表2大柴胡汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析

实施例2

小柴胡汤HPLC指纹图谱的建立。

小柴胡汤供试品溶液的制备：柴胡24g、黄芩9g、人参9g、半夏12g、甘草(炙)、生姜(切)各9g、大枣(擘)12枚。加入2400mL水，小火煮取1200mL，去除药渣，煮至600mL。

单味药材供试品溶液的制备：分别取柴胡24g、黄芩9g、人参9g、半夏12g、甘草(炙)、生姜(切)各9g、大枣(擘)12枚，按上述方法制成单味药材供试品溶液。

检测波长：DAD采集波长190-640nm，对比不同波长的HPLC图，最终选择254nm和276nm，同时选择ELSD图谱。色谱图如图8所示，可以看出254nm和276nm波长下，峰的数量较多且峰形较好，因此DAD检测选择254nm和276nm。

色谱柱：选择三根不同品牌的色谱柱(waters C18柱、agilent C18柱、kromasil100 C18柱规格均为250*4.6mm,5μm)对小柴胡汤进行色谱分析，结果如图9所示，可以看出使用waters C18柱各峰的分离效果较好，峰的数量较多，因此选择waters C18柱。

不同流动相对色谱峰分离的影响(乙腈-水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水)，结果如图10所示，可以看出，流动相为乙腈-0.2％甲酸水时各峰的分离效果较好，因此选择流动相为乙腈-0.2％甲酸水。

色谱条件确定：

色谱条件为waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件见表3；流速为1.0mL/min；DAD检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器；进样量为20μL。HPLC图见图11～13。

表3小柴胡汤梯度洗脱条件

将小柴胡汤指纹图谱分别于其组方中各单味药(柴胡、黄芩、半夏、甘草、生姜、大枣、人参)的HPLC图谱(254nm)进行比对，如图14所示，通过对比各峰的保留时间，对各峰的可能来源进行归属，结果见表4。

表4小柴胡汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析

实施例3

柴胡芒硝汤HPLC指纹图谱的建立。

柴胡芒硝汤供试品溶液的制备：柴胡24g，黄芩9g，人参9g，半夏12g，炙甘草9g，生姜9g，大枣(擘)4枚，芒硝12g。除芒硝外加入2400mL水，小火煮取1200mL，去除药渣，煮至600mL，加芒硝。

单味药材供试品溶液的制备：分别取柴胡24g，黄芩9g，人参9g，半夏12g，炙甘草9g，生姜9g，大枣(擘)4枚，按上述方法制成单味药材供试品溶液。

检测波长：DAD采集波长190-640nm，对比不同波长的HPLC图，最终选择254nm和276nm，同时选择ELSD图谱。色谱图如图15所示，可以看出254nm和276nm波长下，峰的数量较多且峰形较好，因此DAD检测选择254nm和276nm。

色谱柱：选择三根不同品牌的色谱柱(waters C18柱、agilent C18柱、kromasil100 C18柱规格均为250*4.6mm,5μm)对柴胡芒硝汤进行色谱分析，结果如图16所示，可以看出使用waters C18柱各峰的分离效果较好，峰的数量较多，因此选择waters C18柱。

不同流动相对色谱峰分离的影响(乙腈-水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水)，结果如图17所示，可以看出，流动相为乙腈-0.2％甲酸水时各峰的分离效果较好，因此选择流动相为乙腈-0.2％甲酸水。

色谱条件确定：

色谱条件为waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件见表5；流速为1.0mL/min；DAD检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器；进样量为20μL。HPLC图见图18～20。

表5柴胡芒硝汤梯度洗脱条件

将柴胡芒硝汤指纹图谱分别于其组方中各单味药(柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣、芒硝)的HPLC图谱(254nm)进行比对，如图21所示，通过对比各峰的保留时间，对各峰的可能来源进行归属，结果见表6。

表6柴胡芒硝汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析

实施例4

柴胡桂枝汤HPLC指纹图谱的建立。

柴胡桂枝汤供试品溶液的制备：桂枝4.5g，黄芩4.5g，人参4.5g，甘草(炙)3g，半夏6g，芍药4.5g，大枣(擘)6枚，生姜(切)4.5g，柴胡12g。加入2400mL水，小火煮取1200mL，去除药渣，煮至600mL。

单味药材供试品溶液的制备：分别取桂枝4.5g，黄芩4.5g，人参4.5g，甘草(炙)3g，半夏6g，芍药4.5g，大枣(擘)6枚，生姜(切)4.5g，柴胡12g，按上述方法制成单味药材供试品溶液。

检测波长：DAD采集波长190-640nm，对比不同波长的HPLC图，最终选择254nm和276nm，同时选择ELSD图谱。色谱图如图22所示，可以看出254nm和276nm波长下，峰的数量较多且峰形较好，因此DAD检测选择254nm和276nm。

色谱柱：选择三根不同品牌的色谱柱(waters C18柱、agilent C18柱、kromasil100 C18柱规格均为250*4.6mm,5μm)对柴胡桂枝汤进行色谱分析，结果如图23所示，可以看出使用waters C18柱各峰的分离效果较好，峰的数量较多，因此选择waters C18柱。

不同流动相对色谱峰分离的影响(乙腈-水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水)，结果如图24所示，可以看出，流动相为乙腈-0.2％甲酸水时各峰的分离效果较好，因此选择流动相为乙腈-0.2％甲酸水。

色谱条件确定：

色谱条件为waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件见表7；流速为1.0mL/min；DAD检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器；进样量为20μL。HPLC图见图25～27。

表7柴胡桂枝汤梯度洗脱条件

将柴胡桂枝汤指纹图谱分别于其组方中各单味药(柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣、桂枝)的HPLC图谱(254nm)进行比对，如图28所示，通过对比各峰的保留时间，对各峰的可能来源进行归属，结果见表8。

表8柴胡桂枝汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析

实施例5

柴胡龙骨牡蛎汤HPLC指纹图谱的建立。

柴胡龙骨牡蛎汤供试品溶液的制备：半夏6g(洗)、大枣6枚、柴胡12g、生姜4.5g、人参4.5g、龙骨4.5g、桂枝4.5g(去皮)、茯苓4.5g、大黄6g、牡蛎4.5g(煅)。除大黄外加入2400mL水，煮取1200mL加入大黄，小火煮沸后，去除药渣，煮至600mL。

单味药材供试品溶液的制备：分别取半夏6g(洗)、大枣6枚、柴胡12g、生姜4.5g、人参4.5g、龙骨4.5g、桂枝4.5g(去皮)、茯苓4.5g、大黄6g、牡蛎4.5g(煅)，按上述方法制成单味药材供试品溶液。

检测波长：DAD采集波长190-640nm，对比不同波长的HPLC图，最终选择254nm和276nm，同时选择ELSD图谱。色谱图如图29所示，可以看出254nm和276nm波长下，峰的数量较多且峰形较好，因此DAD检测选择254nm和276nm。

色谱柱：选择三根不同品牌的色谱柱(waters C18柱、agilent C18柱、kromasil100 C18柱规格均为250*4.6mm,5μm)对柴胡龙骨牡蛎汤进行色谱分析，结果如图30所示，可以看出使用waters C18柱各峰的分离效果较好，峰的数量较多，因此选择waters C18柱。

不同流动相对色谱峰分离的影响(乙腈-水、乙腈-0.1％乙酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水)，结果如图31所示，可以看出，流动相为乙腈-0.2％甲酸水时各峰的分离效果较好，因此选择流动相为乙腈-0.2％甲酸水。

色谱条件确定：

色谱条件为waters C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件见表9；流速为1.0mL/min；DAD检测波长为254nm和276nm串联ELSD检测器；进样量为20μL。HPLC图见图32～34。

表9柴胡龙骨牡蛎汤梯度洗脱条件

将柴胡龙骨牡蛎汤指纹图谱分别与其组方中各单味药(柴胡、人参、半夏、生姜、大枣、大黄、桂枝、牡蛎、龙骨、茯苓)的HPLC图谱(254nm)进行比对，如图35所示，通过对比各峰的保留时间，对各峰的可能来源进行归属，结果见表10。

表2柴胡龙骨牡蛎汤HPLC指纹图谱特征峰的来源分析

实施例1～5表明，在建立大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤、柴胡龙骨牡蛎汤的指纹图谱的优化过程中，流动相、色谱柱及检测波长的优化结果相同，因而在建立大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤、柴胡龙骨牡蛎汤等小柴胡汤类方的指纹图谱过程中，仅需对流动相溶液进行一次配制即可，也无需更换调节色谱柱及检测波长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

2.如权利要求1所述的小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，小柴胡汤类方包括大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡加芒硝汤、柴胡桂枝汤和柴胡龙骨牡蛎汤。

3.如权利要求1所述的小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，高效液相色谱采用的串联的ELSD检测器。

4.如权利要求1所述的小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，高效液相色谱检测过程中，流速为0.5～1.5mL/min，进样量为15～25μL。

5.如权利要求1所述的小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，乙腈为流动相B，0.19～0.21％甲酸水为流动相A。

6.如权利要求5所述的小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法，其特征是，

大柴胡汤的洗脱条件如下：

小柴胡汤的洗脱条件如下：

柴胡芒硝汤梯度洗脱条件如下：

柴胡桂枝汤梯度洗脱条件如下：

柴胡龙骨牡蛎汤梯度洗脱条件如下：

7.一种上述小柴胡汤类方的高效液相色谱检测方法在建立小柴胡汤类方指纹图谱中的应用。

8.一种基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，其特征是，将小柴胡汤类方制成试品溶液，采用高效液相色谱对试品溶液进行检测，利用检测谱图建立指纹图谱；高效液相色谱检测过程中，流动相为乙腈-0.19～0.21％甲酸水，色谱柱为waters C18柱，检测波长为253～255nm和275～277nm。

9.如权利要求8所述的基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，其特征是，将指纹图谱中的特征峰进行来源归属。

10.如权利要求9所述的基于少阳病方证的小柴胡汤类方指纹图谱的建立方法，其特征是，来源归属的具体过程为：对小柴胡汤类方中的各单味药分别进行高效液相色谱检测，将指纹图谱中的特征峰与各单味药的高效液相色谱的特征峰进行对比，获得指纹图谱中的特征峰的来源。

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