CN114533969A - 一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用,其中,方法包括步骤:丝胶蛋白的提取与纯化;阻流膜表面处理;阻流膜表面接枝丝胶蛋白;生物活性分子的固定。本发明对阻流膜进行表面处理,通过席夫碱反应或者自组装的方法将丝胶蛋白分子接枝至阻流膜上,再通过席夫碱反应将促进内皮化的生物分子固定在阻流膜表面,实现原位促内皮化,加快心脏封堵器表面内皮化的速度,通过本发明提供的方法制备出的阻流膜具有较高的硬度,能够促进内皮化,并潜在的延长其使用寿命。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料以及医疗器械领域,具体涉及一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用。
背景技术
房间隔缺损(ASD)约占全部先天性心脏病(CHD)的30%,是继室间隔缺损后最常见的先天性心脏病。随着心导管介入技术及介入器械的发展,介入封堵治疗已经成为ASD疾病的主要治疗方式。目前为止,临床上应用的所有ASD封堵器均为非降解金属封堵器加合成纤维阻流膜构成,由于阻流膜的致密性导致内皮化的速度较慢,并且内皮化后依然长期留存于体内。
在生物材料表面固定生物活性分子能够选择性捕获EPCs(或ECs),进而实现原位内皮化。这些生物活性分子包括抗体、多肽和适配子。如CD34抗体是迄今为止用于支架涂层最常用的EPCs捕获生物活性分子。纤维粘连蛋白CS5区的多肽片段精氨酸-谷氨酰氨-天冬氨酸-缬氨酸(REDV)能够促进内皮细胞的粘附和增殖,有报道表明,REDV活性多肽可选择性吸附ECs,加速内皮化,改善支架表面界面,降低再狭窄。
目前,为了加速心脏封堵器内皮化,一般采用在心脏封堵器表面涂覆生物活性分子的方法,然而,生物活性分子较易溶于水,封堵器进入人体后,生物活性分子很快溶解于血液中,并不能有效促进封堵器的内皮化,甚至完全被血液冲走而起不到任何作用。
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用,旨在解决现有技术生物活性分子不能有效固定在心脏封堵器上实现促内皮化作用问题。
为了解决上述技术问题,本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
一种促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,包括步骤:
将丝胶粉加入到6M的卤化锂溶液中,水浴搅拌至充分混匀,得到丝胶粉溶液,将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶物质并将上清液转入透析袋中进行透析,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,得到纯化的丝胶蛋白;
将阻流膜浸入聚合物溶液中进行氨基化处理,用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到表面带正电的阻流膜;
采用所述纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间,将所述表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜;
配置生物活性分子溶液,将所述接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中,用PBS溶液清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心的步骤中,离心的速度为4500-10000rpm,离心时间15-30min。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述将上清液转入透析袋中进行透析,包括步骤:
将上清液转入透析袋;
向透析袋中加入上清液1/4体积的1M、pH 9.0的Tris-HCl溶液;
透析48h,每24h换水7~8次。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,包括步骤:
用聚乙二醇6000对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述聚合物溶液为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、乙二胺、聚乙烯亚胺、多巴胺中的一种。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述丝胶蛋白溶液的浓度为1-10mg/ml,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-10mg/ml;所述碳化二亚胺的浓度为1.5-15mg/ml,反应的预定时间为0.5-1.5h。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述得到接枝丝胶蛋白的阻流膜后,还包括步骤:
将所述接枝丝胶蛋白溶液的阻流膜浸泡在0.1-2.5%(w/v)的戊二醛溶液中0.5-3h,用去离子水清洗3天后冷冻干燥。
所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其中,所述生物活性分子溶液包括CD34抗体、VEGF、REDV中的一种或两种,所述生物活性分子溶液的浓度为2-5μg/ml。
一种如上所述的促进内皮化阻流膜的制备方法制备的阻流膜在制备心脏封堵器中的应用。
所述的应用,其中,所述阻流膜在制备心脏封堵器中的应用具体按照以下步骤进行:将阻流膜缝合在网状支架盘面上,即得到所述心脏封堵器。
本发明的有益效果:本发明提供一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用,其中,方法包括步骤:将丝胶粉加入到6M的卤化锂溶液中,水浴搅拌至充分混匀,得到丝胶粉溶液,将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶物质并将上清液转入透析袋中进行透析,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,得到纯化的丝胶蛋白;将阻流膜浸入聚合物溶液中进行氨基化处理,用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到表面带正电的阻流膜;采用所述纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间,将所述表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜;配置生物活性分子溶液,将所述接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中,用PBS溶液清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。本发明。对阻流膜进行表面处理,通过席夫碱反应或者自组装的方法将丝胶蛋白分子接枝至阻流膜上,再通过席夫碱反应将促进内皮化的生物分子固定在阻流膜表面,实现原位促内皮化,加快心脏封堵器表面内皮化的速度,通过本发明提供的方法制备出的阻流膜具有较高的硬度,能够促进内皮化,并潜在的延长其使用寿命。
附图说明
图1是本发明的促进内皮化阻流膜的制备方法较佳实施例的流程图。
图2是本发明制备方法技术原理演示图。
图3是本发明的制备方法中阻流膜表面接枝丝胶蛋白的显微组织图。
图4是本发明的制备方法中阻流膜表面固定FITC-CD34抗体荧光显微组织图。
具体实施方式
本发明提供一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用,为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
具体地,请参阅图1和图2,图1为本发明的促进内皮化阻流膜的制备方法较佳实施例的流程图,其具体包括以下步骤:
S100、将丝胶粉加入到6M的卤化锂溶液中,水浴搅拌至充分混匀,得到丝胶粉溶液,将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶物质并将上清液转入透析袋中进行透析,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,得到纯化的丝胶蛋白;
S200、将阻流膜浸入聚合物溶液中进行氨基化处理,用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到表面带正电的阻流膜;
S300、采用所述纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间,将所述表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜;
S400、配置生物活性分子溶液,将所述接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中,用PBS溶液清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。
本发明的制备方法包括丝胶蛋白的提取与纯化;阻流膜表面处理;阻流膜表面接枝丝胶蛋白;生物活性分子的固定等步骤,通过对阻流膜进行表面处理,通过席夫碱反应或者自组装的方法将丝胶蛋白分子接枝至阻流膜上,通过席夫碱反应将促进内皮化的生物分子固定在阻流膜表面,实现原位促内皮化,加快心脏封堵器表面内皮化的速度,通过本发明提供的方法制备出的阻流膜具有较高的硬度,能够促进内皮化,并潜在的延长其使用寿命。
在本实施例中,所述步骤S100是提取与纯化丝胶蛋白,具体为预先配置好6M的卤化锂溶液,所述卤化锂溶液为氯化锂、溴化锂、碘化锂溶液中的一种,本实施例优选使用溴化锂溶液,随后将丝胶粉以1g丝胶粉配20~100mL溴化锂溶液的比例与配置好的溴化锂溶液进行混合,在35℃水浴中搅拌24h至充分混合均匀,随后将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶性物质,得到上清液,离心的速度为4500-10000rpm,离心时间15-30min,。
随后,将上清液转入透析袋中进行透析,具体包括步骤:
A、将上清液转入透析袋;
B、向透析袋中加入上清液1/4体积的1M、pH 9.0的Tris-HCl溶液;
C、透析48h,每24h换水7~8次。
具体地,将上清液和Tris-HCl缓冲液转入透析袋后,将透析袋两端用麻线扎紧,放置于含有超纯水的烧杯中,并将烧杯置于磁力搅拌器上慢速搅拌透析,共透析48小时,每隔3~3.4小时换一次水,本实施例中的透析袋的分子量为2000-4500M.W.。
在透析完成后,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩具体为:用聚乙二醇6000对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩。
聚乙二醇6000(PEG-6000)为环氧乙烷和水缩聚而成的高分子聚合物,其无毒无刺激性,因此,在本实施例中,选用质量百分浓度为10-40%(w/v)的PEG-6000溶液对丝胶粉溶液进行浓缩,直到需要的浓度为止,本实施例中优选将丝胶粉溶液浓缩到浓度为0.1-1g/L,然后将浓缩后的样品从透析袋中取出置于4℃冰箱保存备用。
在本实施例中,所述步骤S200是对阻流膜的表面进行处理,主要是利用聚合物溶液对阻流膜表面进行氨基化处理,使阻流膜得到一个氨基化或者带正电的表面,具体地,所述聚合物溶液为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、乙二胺、聚乙烯亚胺(PEI 25000)、多巴胺中的一种。
其中,聚乙烯亚胺的分子量是25000M.W.,浓度为1-15mg/ml;3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为1-50mg/ml;3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷的浓度为1-50mg/ml;乙二胺的浓度为10-80%(v/v);多巴胺的浓度为1-10mg/ml;反应时间为1-24h。
在对阻流膜表面氨基化处理后,用磷酸盐缓冲溶液(PBS,PH=7.4)进行清洗,氮气吹干,即得表面带正电的阻流膜,记为S-N。
在本实施例中,所述步骤S300是将纯化的丝胶蛋白接枝到阻流膜的表面,首先,采用所述步骤S100中得到的纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,所述丝胶蛋白溶液的浓度为1-10mg/ml,随后向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间以活化丝胶蛋白表面的羧基,其中,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-10mg/ml,所述碳化二亚胺的浓度为1.5-15mg/ml,反应的预定时间为0.5-1.5h。
随后,将所述步骤S200中得到的表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,使丝胶蛋白表面的羧基与阻流膜表面的氨基发生席夫碱反应,将丝胶蛋白分子固定在阻流膜表面,反应时间为3-24h,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜,图3为阻流膜表面接枝丝胶蛋白的显微组织图。
在一些实施方式中,在得到接枝丝胶蛋白的阻流膜后,还包括步骤:
将所述接枝丝胶蛋白溶液的阻流膜浸泡在0.1-2.5%(w/v)的戊二醛溶液中0.5-3h,用去离子水清洗3天后冷冻干燥。
具体地,在得到接枝丝胶蛋白的阻流膜后,用去离子水进行清洗,氮气吹干,然后将所述接枝丝胶蛋白溶液的阻流膜浸泡在0.1-2.5%(w/v)的戊二醛溶液中0.5-3h,通过丝胶蛋白与戊二醛之间的共价交联,使得所述接枝丝胶蛋白溶液的阻流膜具有优良的力学性能、多孔微观结构和形变记忆性,然后用去离子水清洗3天,一天换5次水,最后冷冻干燥样品,记为S-N-S。
在本实施例中,所述步骤S400是利用接枝在阻流膜表面的丝胶蛋白固定能够促进内皮化的生物活性分子,具体地,用PBS(PH=7.4)溶液配置一定浓度的生物活性分子溶液,然后将接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中12-24h,然后用PBS溶液进行清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。
具体地,所述生物活性分子溶液包括CD34抗体、VEGF、REDV中的一种或两种,所述生物活性分子溶液的浓度为2-5μg/ml。
为了得到具有良好性能的阻流膜,本实施例优选将S-N-S浸泡在所述生物活性分子溶液中12-24h,然后用PBS溶液进行清洗,得到所述促进内皮化阻流膜,记为S-N-S-E。
本发明还提供一种如上所述的促进内皮化阻流膜的制备方法制备的阻流膜在制备心脏封堵器中的应用。
所述阻流膜在制备心脏封堵器中的应用具体按照以下步骤进行:将阻流膜缝合在网状支架盘面上,即得到所述心脏封堵器。
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施实例1
1、丝胶蛋白的提取与纯化
称取1g丝胶粉与40ml浓度为6M LiBr溶液中,充分混匀,35℃水浴24h;将溶解好的样品5000r/min离心15min,将不溶物去除;将溶液轻轻转入透析袋(3500)中,并加入上清液1/4体积的Trish-HCl(1M,pH=9.0);放在磁力搅拌器上透析24h-48h,定期换水7-8次,透析后丝胶粉溶液采用PEG6000浓缩,直到达到需要的浓度,浓缩好以后将样品从透析袋中取出4℃冰箱备用。
2、阻流膜表面处理
用PBS缓冲溶液配置浓度2mg/ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷,然后将阻流膜浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中4h,然后用0.1M的盐酸溶液进行清洗,最后真空干燥,记为S-N。
3、阻流膜表面接枝丝胶蛋白
用PH=8的纯水配置浓度为5mg/ml的丝胶蛋白溶液,在其中加入浓度为5mg/ml的EDC和7.5mg/ml的NHS,反应30min,然后将S-N浸泡在该溶液中24h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h。将冷冻干燥好的样品浸泡在浓度为0.25%(w/v)的戊二醛溶液中1h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h,记为S-N-S。
4、生物活性分子的固定
用PH=7.4的PBS溶液,配置浓度为2μg/ml CD34抗体溶液,将S-N-S浸泡在CD34抗体溶液中,室温孵育过夜,然后用PBS进行清洗,记为S-N-S-E,阻流膜表面固定FITC-CD34抗体荧光显微组织图如图4所示。
实施实例2
1、丝胶蛋白的提取与纯化
称取1g丝胶粉与40ml浓度为6M LiBr溶液中,充分混匀,35℃水浴24h;将溶解好的样品5000r/min离心15min,将不溶物去除;将溶液轻轻转入透析袋(3500)中,并加入上清液1/4体积的Trish-HCl(1M,pH=9.0);放在磁力搅拌器上透析24h-48h,定期换水7-8次,透析后丝胶粉溶液采用PEG6000浓缩,直到达到需要的浓度,浓缩好以后将样品从透析袋中取出4℃冰箱备用。
2、阻流膜表面处理
用PBS缓冲溶液配置浓度2mg/ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷,然后将阻流膜浸泡在3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中4h,然后用0.1M的盐酸溶液进行清洗,最后真空干燥,记为S-N。
3、阻流膜表面接枝丝胶蛋白
用PH=8的纯水配置浓度为5mg/ml的丝胶蛋白溶液,在其中加入浓度为5mg/ml的EDC和7.5mg/ml的NHS,反应30min,然后将S-N浸泡在该溶液中24h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h。将冷冻干燥好的样品浸泡在浓度为0.25%(w/v)的戊二醛溶液中1h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h,记为S-N-S。
4、生物活性分子的固定
用PH=7.4的PBS溶液,配置浓度为4μg/ml VEGF溶液,将S-N-S浸泡在VEGF溶液中,室温孵育过夜,然后用PBS进行清洗,记为S-N-S-E。
实施实例3
1、丝胶蛋白的提取与纯化
称取1g丝胶粉与40ml浓度为6M LiBr溶液中,充分混匀,35℃水浴24h;将溶解好的样品10000rpm,离心15min,将不溶物去除;将溶液轻轻转入透析袋(Mw4500)中,并加入上清液1/4体积的Trish-HCl(1M,pH=9.0);放在磁力搅拌器上透析24h,定期换水7-8次,透析后丝胶粉溶液采用PEG6000浓缩,直到达到需要的浓度,浓缩好以后将样品从透析袋中取出4℃冰箱备用。
2、阻流膜表面处理
用PBS缓冲溶液配置浓度1mg/ml的PEI,然后将阻流膜浸泡PEI溶液中2h,然后PBS溶液进行清洗,最后真空干燥,记为S-N。
3、阻流膜表面接枝丝胶蛋白
用PH=8的纯水配置浓度为5mg/ml的丝胶蛋白溶液,在其中加入浓度为5mg/ml的EDC和7.5mg/ml的NHS,反应30min,然后将S-N浸泡在该溶液中24h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h。将冷冻干燥好的样品浸泡在浓度为0.25%(w/v)的戊二醛溶液中,1h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h,记为S-N-S。
4、生物活性分子的固定
用PH=7.4的PBS溶液,配置浓度为5μg/mlREDV溶液,将S-N-S浸泡在REDV溶液中,室温孵育过夜,然后用PBS进行清洗,记为S-N-S-E。
实施实例4
1、丝胶蛋白的提取与纯化
称取1g丝胶粉与40ml浓度为6M LiBr溶液中,充分混匀,35℃水浴24h;将溶解好的样品5000r/min离心15min,将不溶物去除;将溶液轻轻转入透析袋(3500)中,并加入上清液1/4体积的Trish-HCl(1M,pH=9.0);放在磁力搅拌器上透析24h-48h,定期换水7-8次,透析后丝胶粉溶液采用PEG6000浓缩,直到达到需要的浓度,浓缩好以后将样品从透析袋中取出4℃冰箱备用。
2、阻流膜表面处理
用PH=8的Tris-HCl溶液配置浓度为2mg/ml的多巴胺溶液,将阻流膜浸泡在多巴胺溶液中,然后置于恒温摇床中,37℃,避光,100rpm反应12h;反应完毕用超纯水进行超声清洗,每次1min,一共3次,最后真空干燥,记为S-N。
3、阻流膜表面接枝丝胶蛋白
用PH=8的纯水配置浓度为5mg/ml的丝胶蛋白溶液,在其中加入浓度为5mg/ml的EDC和7.5mg/ml的NHS,反应30min,然后将S-N浸泡在该溶液中24h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h。将冷冻干燥好的样品浸泡在浓度为0.25%(w/v)的戊二醛溶液中,1h,然后用超纯水进行清洗,然后冷冻干燥24h,记为S-N-S。
4、生物活性分子的固定
用PH=7.4的PBS溶液,配置浓度为2μg/ml CD34抗体溶液,将S-N-S浸泡在CD34抗体溶液中,室温孵育过夜,然后用PBS进行清洗,记为S-N-S-E。
综上所述,本发明公开了一种促进内皮化阻流膜的制备方法与应用,其中,方法包括步骤:将丝胶粉加入到6M的卤化锂溶液中,水浴搅拌至充分混匀,得到丝胶粉溶液,将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶物质并将上清液转入透析袋中进行透析,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,得到纯化的丝胶蛋白;将阻流膜浸入聚合物溶液中进行氨基化处理,用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到表面带正电的阻流膜;采用所述纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间,将所述表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜;配置生物活性分子溶液,将所述接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中,用PBS溶液清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。本发明对阻流膜进行表面处理,通过席夫碱反应或者自组装的方法将丝胶蛋白分子接枝至阻流膜上,再通过席夫碱反应将促进内皮化的生物分子固定在阻流膜表面,实现原位促内皮化,加快心脏封堵器表面内皮化的速度,通过本发明提供的方法制备出的阻流膜具有较高的硬度,能够促进内皮化,并潜在的延长其使用寿命。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,包括步骤:
将丝胶粉加入到6M的卤化锂溶液中,水浴搅拌至充分混匀,得到丝胶粉溶液,将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心,去除不溶物质并将上清液转入透析袋中进行透析,对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,得到纯化的丝胶蛋白;
将阻流膜浸入聚合物溶液中进行氨基化处理,用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到表面带正电的阻流膜;
采用所述纯化的丝胶蛋白配置丝胶蛋白溶液,向所述丝胶蛋白溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和碳化二亚胺反应预定时间,将所述表面带正电的阻流膜浸入反应后的丝胶蛋白溶液中,得到接枝丝胶蛋白的阻流膜;
配置生物活性分子溶液,将所述接枝丝胶蛋白的阻流膜浸泡在所述生物活性分子溶液中,用PBS溶液清洗,得到所述促进内皮化阻流膜。
2.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述将充分混匀的丝胶粉溶液进行离心的步骤中,离心的速度为4500-10000rpm,离心时间15-30min。
3.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述将上清液转入透析袋中进行透析,包括步骤:
将上清液转入透析袋;
向透析袋中加入上清液1/4体积的1M、pH 9.0的Tris-HCl溶液;
透析48h,每24h换水7~8次。
4.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩,包括步骤:
用聚乙二醇6000对透析后的丝胶粉溶液进行浓缩。
5.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述聚合物溶液为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷、乙二胺、聚乙烯亚胺、多巴胺中的一种。
6.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述丝胶蛋白溶液的浓度为1-10mg/ml,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-10mg/ml;所述碳化二亚胺的浓度为1.5-15mg/ml,反应的预定时间为0.5-1.5h。
7.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述得到接枝丝胶蛋白的阻流膜后,还包括步骤:
将所述接枝丝胶蛋白溶液的阻流膜浸泡在0.1-2.5%(w/v)的戊二醛溶液中0.5-3h,用去离子水清洗3天后冷冻干燥。
8.根据权利要求1所述的促进内皮化阻流膜的制备方法,其特征在于,所述生物活性分子溶液包括CD34抗体、VEGF、REDV中的一种或两种,所述生物活性分子溶液的浓度为2-5μg/ml。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的促进内皮化阻流膜的制备方法制备的阻流膜在制备心脏封堵器中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述阻流膜在制备心脏封堵器中的应用具体按照以下步骤进行:将阻流膜缝合在网状支架盘面上,即得到所述心脏封堵器。
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