CN114507666A - 一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用 - Google Patents

一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于大豆的根特异性启动子pro‑GmPRlike及其应用，属于基因工程和分子生物学领域。本发明提供一种来源于大豆的根特异性启动子，所述根特异性启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：6所示的A1‑A6序列中的任意一条。该根特异性启动子能驱动目的基因只在根中高量表达，其有效克服了传统基因工程使用的组合型CaMV35S和玉米Ubiquitin启动子在转基因植物所有器官组织、不同发育时期均表达的缺陷，同时也提高了转基因植物的安全性，并为通过转基因手段培育大豆抗根部病害新品种奠定了良好的技术基础。

Description

一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和分子生物学领域，特别是涉及一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用。
背景技术
大豆(GLycine max.Merr.)是重要的油料作物，同时还是蛋白质源，在农业生产上意义重大。田间病虫害防控是保障大豆生产安全的重要环节，其中由土传病原菌引起的大豆根部病害是严重危害大豆生产的世界性病害。大豆根部病害往往由多种病原菌混合侵染导致，主要致病菌有疫霉菌、腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌等。由于根部侵染的特性，在田间已经发生肉眼可辨病症的时候往往已经处于发病后期，此时进行农药防治难以取得预期效果。因此越来越多的科学家希望利用植物抗病转基因育种技术来扩大基因资源、加速育种进程、进一步实现相对“广谱持久”的抗病目的。
利用生物工程技术手段进行广谱持久抗病的精确分子设计，是培育广谱持久转基因抗病新品种的关键技术瓶颈。当前利用转基因技术培育抗病品种的手段多是利用CaMV35S和玉米Ubiquitin等一些组成性强启动子，然而利用这些强启动子驱动目的抗病基因在受体作物中过量表达后，往往会影响植物的正常生长和发育(即适合性代价，FitnessCost)，同时由于目的基因在收获器官的表达也会引起公众对转基因食品安全性的疑虑，因此利用组织特异性启动子来驱动目的基因的表达是植物转基因抗病育种的一个重要环节。
根是植物的重要器官，除了支撑植物地上部分作用之外，在水分、养分吸收，有机物贮存，土壤微生物互作方面也有着重要功能。大豆根部病害是田间主要病害之一，克隆根部特异启动子，对于保证抗病基因在大豆根中特异、稳定、高效表达及提高转基因作物生物安全性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该启动子能够驱动目的基因在植物根中特异表达，提高了转基因植物的安全性，并为培育大豆抗根部病害新品种奠定了良好的技术基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种来源于大豆的根特异性启动子，所述根特异性启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示的A1-A6序列中的任意一条。
本发明还提供一种引物组，所述引物组包括扩增A1序列的SEQ ID NO：11所示的上游引物和SEQ ID NO：12所示下游引物；扩增A2序列的SEQ ID NO：13所示上游引物和SEQ IDNO：14所示下游引物；扩增A3序列的SEQ ID NO：15所示上游引物和SEQ ID NO：14所示下游引物；扩增A4序列的SEQ ID NO：16所示上游引物和SEQ ID NO：17所示下游引物；扩增A5序列的SEQ ID NO：18所示上游引物和SEQ ID NO：19所示下游引物；扩增A6序列的SEQ ID NO：20所示上游引物和SEQ ID NO：21所示下游引物。
本发明还提供一种重组载体，包括上述的根特异性启动子。
本发明还提供一种重组菌，包括上述的重组载体。
本发明还提供一种构建上述的根特异性启动子的方法，包括以下步骤：
以大豆根部提取的DNA为模板，利用上述的引物组进行PCR扩增，获得所述的根特异性启动子。
本发明还提供上述的根特异性启动子或上述的引物组或上述的重组载体或上述的重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。
进一步地，所述目的基因表达是在植物根中表达。
进一步地，所述植物包括大豆或本氏烟草。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以大豆品种Williams 82基因组为模板克隆获得启动子pro-GmPRlike(A1序列)，将该启动子及其截短片段(A2-A6)融合报告基因并转化大豆根毛和本氏烟草，GUS染色发现它们能驱动报告基因在根中高通量表达，而在茎和叶片中不表达；这证明本发明所述的根部特异启动子pro-GmPRlike及其具有同样生物学功能的截短序列能够驱动目的基因在根部特异表达，可有效克服传统基因工程使用的组合型CaMV35S和玉米Ubiquitin启动子在转基因植物所有器官组织、不同发育时期均表达的缺陷，同时也提高了转基因植物的安全性。本发明为通过转基因手段培育大豆抗根部病害新品种奠定了良好的技术基础，并且在培育仅在植物根中特异表达外源目的基因的基因工程育种中具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中大豆根特异基因GmPRlike(GLYMA_13G251600)在大豆不同器官中表达水平的转录组数据分析结果；
图2为实施例1中大豆根特异基因GmPRlike(GLYMA_13G251600)在大豆不同器官中表达水平的RT-PCR检测分析结果；
图3为实施例4中pro-GmPRlike及其截短序列分布图和对应片段转基因大豆根毛GUS染色情况；
图4为实施例4中pro-GmPRlike转基因本氏烟草株系的GUS染色情况，其中A为整株幼苗染色表型；B为叶片染色表型；C为茎染色表型；D为根染色表型。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本实施例中方法如无特殊说明均按照常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或市场商品化试剂盒产品。
实施例1pro-GmPRlike启动子全长序列的获得
收集大豆品种Williams82幼苗期根、茎、叶三个器官的RNA样本进行转录组测序，根据获得的各基因在三个样本中的FPKM值，筛选到一个在根中特异高表达的病程相关同源基因GmPRlike(GLYMA_13G251600)(见图1)。该基因FPKM值在根部样本中达到998.59，在茎和叶中的信号值分别为0.09和0.12。
在基因GLYMA_13G251600特异区段设计RT-PCR检测引物(RT-F：5′-GCCTACGCTCAAGATTCA-3′，RT-R：5′-CAGTTTGTAGGGTCTTTCAC-3′)，以大豆actin基因作为内参。重新提取大豆品种Williams82幼苗期根、茎、叶三个器官的RNA样本，并经反转录获得cDNA。经过RT-PCR进一步分析后，证明该基因的转录表达具有根特异性(图2)。
根据大豆全基因组序列预测的GmPRlike(GLYMA_13G251600)序列，选择该基因座上游1500bp片段作为该基因的启动子序列，命名为pro-GmPRlike，简称A1，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，并设计引物：
NO:1-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAATCA-3′(SEQID NO:11)
NO:1-R：5′-ttaccctcagatctaccatggTATATTAATTATGCTTAATAGTATCACTTTC-3′(SEQID NO:12)
引物5′端分别添加植物表达载体pCAMBIA3301HindIII和NcoI酶切位点两侧对应21bp同源序列，用于后续利用同源重组方法将启动子序列导入pCAMBIA3301载体。
采用CTAB法提取大豆品种Williams82根的基因组DNA。在50μL PCR反应体系中取200ng基因组样本作为模板，以NO:1-F和NO:1-R为引物进行PCR反应。反应液试剂采用诺维赞生物科技公司生产的2×Phanta Flash Master mix(P510-01)试剂盒，体系配制为：ddH2O 20μL，2×Phanta Flash Master mix 25μL，NO:1-F 2μL，NO:1-R2μL，gDNA 1μL。PCR程序设置为：98℃ 30s；98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 30s，32个循环；72℃ 5min。PCR结束后取5μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明PCR产物只有1条大小为1500bp的DNA带，将此片段回收纯化。
实施例2pro-GmPRlike启动子5′及3′端缺失突变体序列的获得
为了对pro-GmPRlike启动子核心功能元件进行分析，分别在pro-GmPRlike启动子序列的第248-1500、1096-1500、1096-1190、1191-1330、1335-1500、1-1331、1-1095、1-247、248-1096位置处分别设计以下引物，并分别将其片段命名为：A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10，具体序列见序列表SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:10。利用大豆Williams82的根基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。依据实施例1中描述的PCR程序分别获得相应的启动子片段。
扩增启动子A2的引物为:
NO:2-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttGCGGATTATTCAACACAAG-3′(SEQ ID NO:13)
NO:2-R：5′-ttaccctcagatctaccatggCAGCGTGTCCTCTCCAAATGA-3′(SEQ ID NO:14)
扩增启动子A3的引物为:
NO:3-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttCTACAATTTTATATTATATTAG-3′(SEQ ID NO:15)
NO:3-R：5′-ttaccctcagatctaccatggCAGCGTGTCCTCTCCAAATGA-3′(SEQ ID NO:14)
扩增启动子A4的引物为:
NO:4-F：5′-gagctcggtacccggggatccCTACAATTTTATATTATATTAGAG-3′(SEQ ID NO:16)
NO:4-R：5′-ggaagggtcttgcgaaagcttATATAAACCACTAGTAAAATGATC-3′(SEQ ID NO:17)
扩增启动子A5的引物为:
NO:5-F：5′-gagctcggtacccggggatccGATTTCCTTAATATAACATAC-3′(SEQ ID NO:18)
NO:5-R：5′-ggaagggtcttgcgaaagcttCGGACAATCATCTTTGACGG-3′(SEQ ID NO:19)
扩增启动子A6的引物为:
NO:6-F：5′-gagctcggtacccggggatccCCTCCGCATGCATGTCACC-3′(SEQ ID NO:20)
NO:6-R：5′-ggaagggtcttgcgaaagcttTATATTAATTATGCTTAATAG-3′(SEQ ID NO:21)
扩增启动子A7的引物为:
NO:7-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAAT-3′
NO:7-R：5′-ttaccctcagatctaccatggACGGACAATCATCTTTGACGGA-3′
扩增启动子A8的引物为:
NO:8-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAAT-3′
NO:8-R：5′-ttaccctcagatctaccatggAAGTAGGTGATGCTCTAGCCATATAT-3′
扩增启动子A9的引物为:
NO:9-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttTTATCTGTGTGTCTGTGCTAAATAAAT-3′
NO:9-R：5′-ttaccctcagatctaccatggACCCTTGACAATTTTTAGAAATAATTTT-3′
扩增启动子A10的引物为:
NO:10-F：5′-gacctgcaggcatgcaagcttGCGGATTATTCAACACAAGATTTTT-3′
NO:10-R：5′-ttaccctcagatctaccatggAAGTAGGTGATGCTCTAGCCATATAT-3′
引物5′端分别添加植物表达载体pCAMBIA3301HindIII和NcoI酶切位点两侧对应21bp同源序列，用于后续利用同源重组方法将启动子序列导入pCAMBIA3301载体。
实施例3构建pro-GmPRlike启动子及缺失突变体驱动GUS基因表达的植物表达载体
首先以本实验室保存的pBIN-GFP载体为模板扩增GFP表达框序列，凝胶电泳后切胶回收目的片段；EcoRI酶切植物表达载体pCAMBIA3301，回收线性化的载体后与GFP表达框序列通过同源重组的方法进行连接；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，菌落PCR挑选阳性克隆后进一步经过酶切和测序验证。插入GFP表达盒的载体命名为pCAMBIA3301-GFP，以GFP作为后续阳性大豆根毛的筛选标记。
使用HindIII、NcoI双酶切pCAMBIA3301-GFP植物表达载体，回收切除载体自带的CaMV35S启动子序列后的线性化目的片段，分别与A1-A2序列片段按比例混合后加入同源重组酶和反应缓冲液后重组反应，构建融合GUS基因的植物表达载体。反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，菌落PCR挑选阳性克隆后进一步经过酶切和测序验证后，通过电转化方法转入发根农杆菌K599和根癌农杆菌EHA105感受态细胞，菌落PCR挑选阳性克隆后保存。
以上实验操作内切酶采用NEB公司产品；同源重组酶采用诺维赞生物科技公司生产的ClonExpress II One Step Cloning Kit(C112-01)试剂盒。酶切和重组反应液配制按照产品说明书推荐用量进行。
实施例4转基因材料获得及GUS活性分析
利用发根农杆菌介导的大豆发状根转化系统将实施例3中构建好的载体分别转到大豆品种Williams82子叶中，诱导发状根产生。主要操作步骤如下：
(1)挑选籽粒圆润无皱褶、破损的大豆Willims82，分装在玻璃培养皿中，每皿籽粒平铺满培养皿底部即可，防止大豆籽粒数目过多，影响灭菌质量。在通风橱中向100ml次氯酸钠中滴加15ml的浓盐酸产生氯气，对大豆进行氯气灭菌2h，结束后超净台吹1-2h后封口备用。
(2)将灭菌的大豆籽粒无菌水冲洗2遍后浸泡过夜，在超净工作台剥除种皮后种植于0.6％的琼脂培养基中5天。
(3)大豆生长至第6天时收集子叶，并用灭菌手术刀片在子叶上端削出一个凹形伤口，平铺在0.3％的White培养(含有头孢，羧苄)上。
(4)对每一粒子叶的伤口滴加5μl的农杆菌K599，培养皿盖上标明日期等信息后置于培养箱黑暗培养。
处理3周左右通过荧光筛选带有GFP荧光的阳性根毛组织，收集并用于GUS活性分析，具体见图3，其中图3左图为A1-A10启动子序列分布图，右图为pro-GmPRlike(A1)及其截短序列(A2-A10)在转基因大豆根毛中的GUS染色情况。
将在大豆发状根组织中验证过具有GUS驱动活性的载体通过叶盘法转入本氏烟草，获得转基因植株。主要操作步骤如下：
(1)选取种子外形完整的本氏烟(Nicotiana tabacum)种子，用70％的酒精消毒两次，每次30s，接着无菌水冲洗3次，将种子布在MS固体培养基上种植，置于25℃条件下12h光照，12h黑暗培养。
(2)当烟草生长至3周时，选取完全展开的叶片，避开烟草叶脉和叶缘，将叶片浸入70％的乙醇溶液中短暂浸泡，进行表面消毒，然后浸入30％的次氯酸钠中浸泡5min，无菌水冲洗4-5次后小心用灭菌手术刀将叶片切成0.5cm×0.5cm的小方块供转化用。
(3)将切好的叶片方块放入菌液中，混匀使菌液充分接触叶片，轻轻摇动10min后小心用镊子取出叶片，用灭菌滤纸吸除菌液后布在MS固体培养基上，25℃黑暗培养3天。
(4)将黑暗处理3天的叶盘转移到分化培养基MS1(MS+6-BA 1mg L-1+Basta 50mgL-1+cef 200mg L-1)上，25℃条件下16h光照，8h黑暗培养3-4周，将叶盘边缘压实进入到培养基中，隔一周更换一次分化培养基注意观察是否有污染。20天后生长出愈伤组织并分化不定芽后，转接到新培养基中待芽长大。
(5)将再生苗转接上多余的以上组织切除后，转接到生根培养基MS2(1/2MS+Basta50mg L-1+IBA 0.2mg L-1)中。生长2-3周后待再生苗的根系生长发达以后，将组培罐开封，暴露环境中培养3天进行炼苗，炼苗结束后对根部的琼脂进行清理，保持根系的完整，将整颗幼苗转移到营养土中培养，定期浇水悉心照料直至收获种子。
T1代植株通过Basta抗性和荧光筛选后的幼苗用于GUS染色鉴定，具体见图4，其中图4A为整株幼苗染色表型；图4B为叶片染色表型；图4C为茎染色表型；图4D为根染色表型。
GUS染色分析具体方法为：
待染色的组织样品在检测液(磷酸缓冲液，10mM EDTA，2mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，2mM K3[Fe(CN)6]，0.1％(w/v)Triton·X-100，5％(w/v)X-Gluc。)中37℃温育12-16h后，经70％乙醇褪色5min，再转到100％乙醇中直至背景无色。显微镜下或用肉眼观察供试样品的染色结果，并拍照记录。白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。
结果如图3和图4所示。结果表明A2、A3、A4、A5、A6启动子片段与A1启动子序列具有相同的在根中驱动基因表达的生物学功能。转基因烟草检测的结果说明本发明公布的启动子序列仅驱动外源基因在转基因本氏烟草的根中表达。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种来源于大豆的根特异性启动子pro-GmPRlike及其应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttatctgtgt gtctgtgcta aataaatcaa atttagattt tttataaaat tatttaatac 60
attcattaaa taaatataac ttaatttgta taaaatactt tttaaaatat aatgagtaaa 120
tattgactgt aaaattatcc aacacaaacg tttgatctat ttaaagttta gtatatgtat 180
gcatggttat ttgggataac ttaattaatc actgtcctaa aaattatttc taaaaattgt 240
caagggtgcg gattattcaa cacaagattt tttttaacaa gtgattttga aagttcaact 300
cctgaatatt gaattggttt aaatatttta agagagaaat tttctactcg tattaattat 360
ttctaactaa aatatatgat tatcttctga tacatacaca gtttttactt aaaactatat 420
ttaaaaacta tttttcctat ggattagtat ggcatatttc aatcctcgag aaccatcatg 480
tattacacaa tctcaacatc attttacttt acaaaaacac atgttgcata gccttgagaa 540
agaaaaaatt aaaactggtt gcgctaccag ttttgagttg atttgccaat tctctacatg 600
ttgcactttt ttctggttaa ttttgttcac atcagtttga cccatttgat ttcataccaa 660
ttcaaatggc tcatggttat caaaattttg ggatagccta gcttggatta caaaatttta 720
tactgactcg aacccaattg gacaaattga aacacagttc atctttaagt tttcactttc 780
tgagattgaa atctcaaagc acaatgaatt aacaagtagc gtgtattacg taagaatcgc 840
tcaagattat aaatattata gcatgcatgt acaacacgta caggaatgac ttggattgat 900
tttcactttt gaaagtgtta tttaaatatt ataaatattt tagtcgatca gttgtcacaa 960
aaactttatc caaaggcctt gaatgtgtca gttttcgttt tttctttata aaataaacga 1020
attggataaa gacgcatacc aatttcctaa cagttcaatt tgacaatgta tatatggcta 1080
gagcatcacc tacttctaca attttatatt atattagagc cacagttgct ctattaaaat 1140
tagttatttg tgtcattctg gctgctgatc attttactag tggtttatat gatttcctta 1200
atataacata cacatgctaa aattgatagt ggtcatttaa aaaatattaa agacttttaa 1260
aatttccaaa aacaacaaag aacaaagaaa aagtcatcca tctcactttt ccgtcaaaga 1320
tgattgtccg tattcctccg catgcatgtc accaccttcc attctattcc attccatgtt 1380
aaaaaaaaaa acctataaat acctaagacg agctccaacc tttttcatca aaaacctttc 1440
cttttagtat caatttctat atagctaaag aaagtgatac tattaagcat aattaatata 1500
<210> 2
<211> 1253
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggattatt caacacaaga ttttttttaa caagtgattt tgaaagttca actcctgaat 60
attgaattgg tttaaatatt ttaagagaga aattttctac tcgtattaat tatttctaac 120
taaaatatat gattatcttc tgatacatac acagttttta cttaaaacta tatttaaaaa 180
ctatttttcc tatggattag tatggcatat ttcaatcctc gagaaccatc atgtattaca 240
caatctcaac atcattttac tttacaaaaa cacatgttgc atagccttga gaaagaaaaa 300
attaaaactg gttgcgctac cagttttgag ttgatttgcc aattctctac atgttgcact 360
tttttctggt taattttgtt cacatcagtt tgacccattt gatttcatac caattcaaat 420
ggctcatggt tatcaaaatt ttgggatagc ctagcttgga ttacaaaatt ttatactgac 480
tcgaacccaa ttggacaaat tgaaacacag ttcatcttta agttttcact ttctgagatt 540
gaaatctcaa agcacaatga attaacaagt agcgtgtatt acgtaagaat cgctcaagat 600
tataaatatt atagcatgca tgtacaacac gtacaggaat gacttggatt gattttcact 660
tttgaaagtg ttatttaaat attataaata ttttagtcga tcagttgtca caaaaacttt 720
atccaaaggc cttgaatgtg tcagttttcg ttttttcttt ataaaataaa cgaattggat 780
aaagacgcat accaatttcc taacagttca atttgacaat gtatatatgg ctagagcatc 840
acctacttct acaattttat attatattag agccacagtt gctctattaa aattagttat 900
ttgtgtcatt ctggctgctg atcattttac tagtggttta tatgatttcc ttaatataac 960
atacacatgc taaaattgat agtggtcatt taaaaaatat taaagacttt taaaatttcc 1020
aaaaacaaca aagaacaaag aaaaagtcat ccatctcact tttccgtcaa agatgattgt 1080
ccgtattcct ccgcatgcat gtcaccacct tccattctat tccattccat gttaaaaaaa 1140
aaaacctata aatacctaag acgagctcca acctttttca tcaaaaacct ttccttttag 1200
tatcaatttc tatatagcta aagaaagtga tactattaag cataattaat ata 1253
<210> 3
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacaatttt atattatatt agagccacag ttgctctatt aaaattagtt atttgtgtca 60
ttctggctgc tgatcatttt actagtggtt tatatgattt ccttaatata acatacacat 120
gctaaaattg atagtggtca tttaaaaaat attaaagact tttaaaattt ccaaaaacaa 180
caaagaacaa agaaaaagtc atccatctca cttttccgtc aaagatgatt gtccgtattc 240
ctccgcatgc atgtcaccac cttccattct attccattcc atgttaaaaa aaaaaaccta 300
taaataccta agacgagctc caaccttttt catcaaaaac ctttcctttt agtatcaatt 360
tctatatagc taaagaaagt gatactatta agcataatta atata 405
<210> 4
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctacaatttt atattatatt agagccacag ttgctctatt aaaattagtt atttgtgtca 60
ttctggctgc tgatcatttt actagtggtt tatat 95
<210> 5
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatttcctta atataacata cacatgctaa aattgatagt ggtcatttaa aaaatattaa 60
agacttttaa aatttccaaa aacaacaaag aacaaagaaa aagtcatcca tctcactttt 120
ccgtcaaaga tgattgtccg 140
<210> 6
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctccgcatg catgtcacca ccttccattc tattccattc catgttaaaa aaaaaaacct 60
ataaatacct aagacgagct ccaacctttt tcatcaaaaa cctttccttt tagtatcaat 120
ttctatatag ctaaagaaag tgatactatt aagcataatt aatata 166
<210> 7
<211> 1331
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttatctgtgt gtctgtgcta aataaatcaa atttagattt tttataaaat tatttaatac 60
attcattaaa taaatataac ttaatttgta taaaatactt tttaaaatat aatgagtaaa 120
tattgactgt aaaattatcc aacacaaacg tttgatctat ttaaagttta gtatatgtat 180
gcatggttat ttgggataac ttaattaatc actgtcctaa aaattatttc taaaaattgt 240
caagggtgcg gattattcaa cacaagattt tttttaacaa gtgattttga aagttcaact 300
cctgaatatt gaattggttt aaatatttta agagagaaat tttctactcg tattaattat 360
ttctaactaa aatatatgat tatcttctga tacatacaca gtttttactt aaaactatat 420
ttaaaaacta tttttcctat ggattagtat ggcatatttc aatcctcgag aaccatcatg 480
tattacacaa tctcaacatc attttacttt acaaaaacac atgttgcata gccttgagaa 540
agaaaaaatt aaaactggtt gcgctaccag ttttgagttg atttgccaat tctctacatg 600
ttgcactttt ttctggttaa ttttgttcac atcagtttga cccatttgat ttcataccaa 660
ttcaaatggc tcatggttat caaaattttg ggatagccta gcttggatta caaaatttta 720
tactgactcg aacccaattg gacaaattga aacacagttc atctttaagt tttcactttc 780
tgagattgaa atctcaaagc acaatgaatt aacaagtagc gtgtattacg taagaatcgc 840
tcaagattat aaatattata gcatgcatgt acaacacgta caggaatgac ttggattgat 900
tttcactttt gaaagtgtta tttaaatatt ataaatattt tagtcgatca gttgtcacaa 960
aaactttatc caaaggcctt gaatgtgtca gttttcgttt tttctttata aaataaacga 1020
attggataaa gacgcatacc aatttcctaa cagttcaatt tgacaatgta tatatggcta 1080
gagcatcacc tacttctaca attttatatt atattagagc cacagttgct ctattaaaat 1140
tagttatttg tgtcattctg gctgctgatc attttactag tggtttatat gatttcctta 1200
atataacata cacatgctaa aattgatagt ggtcatttaa aaaatattaa agacttttaa 1260
aatttccaaa aacaacaaag aacaaagaaa aagtcatcca tctcactttt ccgtcaaaga 1320
tgattgtccg t 1331
<210> 8
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttatctgtgt gtctgtgcta aataaatcaa atttagattt tttataaaat tatttaatac 60
attcattaaa taaatataac ttaatttgta taaaatactt tttaaaatat aatgagtaaa 120
tattgactgt aaaattatcc aacacaaacg tttgatctat ttaaagttta gtatatgtat 180
gcatggttat ttgggataac ttaattaatc actgtcctaa aaattatttc taaaaattgt 240
caagggtgcg gattattcaa cacaagattt tttttaacaa gtgattttga aagttcaact 300
cctgaatatt gaattggttt aaatatttta agagagaaat tttctactcg tattaattat 360
ttctaactaa aatatatgat tatcttctga tacatacaca gtttttactt aaaactatat 420
ttaaaaacta tttttcctat ggattagtat ggcatatttc aatcctcgag aaccatcatg 480
tattacacaa tctcaacatc attttacttt acaaaaacac atgttgcata gccttgagaa 540
agaaaaaatt aaaactggtt gcgctaccag ttttgagttg atttgccaat tctctacatg 600
ttgcactttt ttctggttaa ttttgttcac atcagtttga cccatttgat ttcataccaa 660
ttcaaatggc tcatggttat caaaattttg ggatagccta gcttggatta caaaatttta 720
tactgactcg aacccaattg gacaaattga aacacagttc atctttaagt tttcactttc 780
tgagattgaa atctcaaagc acaatgaatt aacaagtagc gtgtattacg taagaatcgc 840
tcaagattat aaatattata gcatgcatgt acaacacgta caggaatgac ttggattgat 900
tttcactttt gaaagtgtta tttaaatatt ataaatattt tagtcgatca gttgtcacaa 960
aaactttatc caaaggcctt gaatgtgtca gttttcgttt tttctttata aaataaacga 1020
attggataaa gacgcatacc aatttcctaa cagttcaatt tgacaatgta tatatggcta 1080
gagcatcacc tactt 1095
<210> 9
<211> 247
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttatctgtgt gtctgtgcta aataaatcaa atttagattt tttataaaat tatttaatac 60
attcattaaa taaatataac ttaatttgta taaaatactt tttaaaatat aatgagtaaa 120
tattgactgt aaaattatcc aacacaaacg tttgatctat ttaaagttta gtatatgtat 180
gcatggttat ttgggataac ttaattaatc actgtcctaa aaattatttc taaaaattgt 240
caagggt 247
<210> 10
<211> 848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggattatt caacacaaga ttttttttaa caagtgattt tgaaagttca actcctgaat 60
attgaattgg tttaaatatt ttaagagaga aattttctac tcgtattaat tatttctaac 120
taaaatatat gattatcttc tgatacatac acagttttta cttaaaacta tatttaaaaa 180
ctatttttcc tatggattag tatggcatat ttcaatcctc gagaaccatc atgtattaca 240
caatctcaac atcattttac tttacaaaaa cacatgttgc atagccttga gaaagaaaaa 300
attaaaactg gttgcgctac cagttttgag ttgatttgcc aattctctac atgttgcact 360
tttttctggt taattttgtt cacatcagtt tgacccattt gatttcatac caattcaaat 420
ggctcatggt tatcaaaatt ttgggatagc ctagcttgga ttacaaaatt ttatactgac 480
tcgaacccaa ttggacaaat tgaaacacag ttcatcttta agttttcact ttctgagatt 540
gaaatctcaa agcacaatga attaacaagt agcgtgtatt acgtaagaat cgctcaagat 600
tataaatatt atagcatgca tgtacaacac gtacaggaat gacttggatt gattttcact 660
tttgaaagtg ttatttaaat attataaata ttttagtcga tcagttgtca caaaaacttt 720
atccaaaggc cttgaatgtg tcagttttcg ttttttcttt ataaaataaa cgaattggat 780
aaagacgcat accaatttcc taacagttca atttgacaat gtatatatgg ctagagcatc 840
acctactt 848
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacctgcagg catgcaagct tttatctgtg tgtctgtgct aaataaatca 50
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttaccctcag atctaccatg gtatattaat tatgcttaat agtatcactt tc 52
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacctgcagg catgcaagct tgcggattat tcaacacaag 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaccctcag atctaccatg gcagcgtgtc ctctccaaat ga 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacctgcagg catgcaagct tctacaattt tatattatat tag 43
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagctcggta cccggggatc cctacaattt tatattatat tagag 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaagggtct tgcgaaagct tatataaacc actagtaaaa tgatc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagctcggta cccggggatc cgatttcctt aatataacat ac 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggaagggtct tgcgaaagct tcggacaatc atctttgacg g 41
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagctcggta cccggggatc ccctccgcat gcatgtcacc 40
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaagggtct tgcgaaagct ttatattaat tatgcttaat ag 42

Claims (8)

1.一种来源于大豆的根特异性启动子，其特征在于，所述根特异性启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示的A1-A6序列中的任意一条。
2.一种引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增A1序列的SEQ ID NO：11所示的上游引物和SEQ ID NO：12所示下游引物；扩增A2序列的SEQ ID NO：13所示上游引物和SEQ IDNO：14所示下游引物；扩增A3序列的SEQ ID NO：15所示上游引物和SEQ ID NO：14所示下游引物；扩增A4序列的SEQ ID NO：16所示上游引物和SEQ ID NO：17所示下游引物；扩增A5序列的SEQ ID NO：18所示上游引物和SEQ ID NO：19所示下游引物；扩增A6序列的SEQ ID NO：20所示上游引物和SEQ ID NO：21所示下游引物。
3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异性启动子。
4.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求3所述的重组载体。
5.一种构建权利要求1所述的根特异性启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以大豆根部提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行PCR扩增，获得所述的根特异性启动子。
6.权利要求1所述的根特异性启动子或权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目的基因表达是在植物根中表达。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述植物包括大豆或本氏烟草。
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