CN104560987A - 来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-2504及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-2054及其应用。本发明所提供的启动子为如下中的至少一种：a）序列表中序列2所示的DNA片段；b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明所提供的启动子能够有效启动目的基因在根中的特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就有一定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-2504及其应用

技术领域

本发明涉及一种来源于大豆的根特异性启动子GmTIPp-2504及其应用。

背景技术

启动子是基因的组成部分，控制基因表达的起始和表达程度。在转基因育种中，外源基因在植物体中的精确调控主要是通过合适的启动子实现的。目前，在基因工程中广泛使用的是组成型启动子，但是由于组成型启动子驱使目的基因在植物组织中的表达是恒定和持续的，不受时空和外界因素的限制，会过度消耗细胞内的物质和能量，产生大量异源蛋白质或代谢产物，破坏了植物原有的生理代谢平衡，导致植物生长异常甚至死亡。与组成型启动子相比，根特异性启动子它所驱动的外源基因在受体植物根中表达，克服了组成型启动子由于持续、高效的启动外源基因非特异性表达而造成的细胞物质的过度消耗。随着转基因植物安全标准的提高，包括所有商业化转基因农作物在内，要求必须对所用启动子的表达活性、潜在重组能力、对周边环境以及安全性影响进行详细的研究。

大豆是一种重要的粮油饲兼用作物，在我国大豆产区大多处于干旱、盐碱及高寒等区域，应用的大豆品种耐逆性不强，严重的旱涝病虫害等非生物和生物逆境胁迫显著影响大豆产量。目前在转基因大豆中使用的都是CaMV35S启动子，根特异启动子应用到大豆转基因中，为大豆转基因研究提供更加丰富的启动子元件，同时也为培育耐旱、耐盐、耐冷等转基因大豆新品种提供一种手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，来源于豆科大豆属栽培大豆（Glycine max(L.)Merr.）Williams82，命名为GmTIPp-2504，是下述a）-c）中任一DNA片段：

a）序列表中序列2所示的DNA片段；

b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由2054个核苷酸组成，为序列1的第1-2054位。

含有所述DNA分子（启动子）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组载体为在pC13P1载体的多克隆位点（如KpnⅠ和PstⅠ）插入所述DNA分子得到的重组质粒。

所述pC13P1载体是以pCAMBIA1301载体为基础改造得到的环形载体，所述pC13P1载体上不含有任何启动子的序列，用来满足研究启动子功能的需要。

具体的，所述pC13P1载体的序列如序列表中序列3所示。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因（来源于所述pC13P1载体）；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于所述pC13P1载体）。

所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述表达为根特异性表达。

进一步，所述根特异性表达为根中高表达，具体为根中的表达量显著高于其他组织（如叶柄、叶片主脉、花、果荚外壳），在其他组织中表达量极低。

在所述应用中，所述目的基因可为GUS基因。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥或大豆。

在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）Columbia。

另外，扩增所述DNA分子（启动子）的引物对也属于本发明的保护范围。

在本发明中，扩增所述DNA分子（启动子）的引物对为如下b1）或b2）：

b1）5'-TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'；

5'-TTTGGCACCTCACCTCAC-3'。

b2）5'-GGTACCTCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'；

5'-CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3'。

实验证明，本发明所提供的GmTIPp-2504启动子能够有效启动目的基因在根中的特异性表达。本发明为植物在根部的分子改良提供了一种手段，对植株的抗逆研究就有一定意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为第一轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条带。

图2为第二轮PCR产物GmTIPp-2054的琼脂糖凝胶电泳图。箭头所示为目的条带。

图3为GmTIPp-2054启动子的PCR检测结果。其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准；泳道1为用引物对F-2054/R进行PCR扩增所得的PCR产物的电泳图。

图4为重组质粒pMD18-GmTIPp-2054，以及pC13P1载体的KpnⅠ和PstⅠ双酶切电泳图。其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准；泳道1、2分别为pMD18-GmTIPp-2054和pPC13P1。

图5为pC13P1载体的质粒图谱。

图6为pC13（Delta）GUS载体的质粒图谱。

图7为转基因拟南芥T1代的分子检测结果。其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准；泳道CK+为阳性对照；泳道CK-为阴性对照；其他泳道分别为不同转基因株系，有目的条带（箭头所示位置）出现的为阳性。

图8为转基因拟南芥T3代的营养生长阶段不同发育时期GUS染色结果。

图9为转基因拟南芥T3代的生殖生长阶段不同发育时期GUS染色结果。

图10为转基因拟南芥T3代的植株根和叶中的GUS活性定量测定结果。其中，WT表示未转基因的野生型拟南芥Columbia；T2054-7、T2054-10、T2054-18是三株鉴定阳性的转pCAM-TIPp-2054拟南芥植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的引物合成及测序工作均由华大公司完成。

栽培大豆（Glycine max(L.)Merr.）Williams82：记载于“许硕.野生大豆盐胁迫相关microRNA的功能分析.2011年中国农业科学院硕士论文”一文，由中国农业科学院作物科学研究所供给。

pC13P1载体和pC13（Delta）GUS载体：均为环形载体，由中国科学院亚热带农业生态研究所Pedro S.C.F.Rocha研究员提供。pC13P1载体上不含有任何启动子，但含有GUS报告基因（如图5）；pC13（Delta）GUS载体不含有GUS基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素抗性（如图6）。所述pC13P1载体的序列如序列表中序列3所示；所述pC13（Delta）GUS载体的序列如序列表中序列4所示。

拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）Columbia：记载于“郭晓丽.Columbia型拟南芥愈伤组织培养研究.河南农业科学,2009年01期”一文，由中国农业科学院作物科学研究所供给。

根癌农杆菌GV3101：记载于“赵湛,李文生.不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响.北方园艺,2006年03期”一文，由中国农业科学院作物科学研究所供给。

实施例1、GmTIPp全长启动子的克隆及序列测定

以栽培大豆（Glycine max(L.)Merr.）Williams82为材料，采用CTAB法提取大豆根系基因组DNA。根据大豆基因组数据库查找TIP基因及其上游序列，设计特异引物上游引物F1和下游引物R1，以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。

F1：5'-TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列1的第1-20位）；

R1：5'-CAACACCAGCGAACACGAAA-3'（序列1的第2145-2163位的反向互补序列），

反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min30s，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果见图1，其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。用回收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体（TaKaRa，目录号：D103A）连接，连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α（TIANGEN，目录号：CB101），提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果表明，PCR产物为2163bp，如序列1所示，其中包括109bp TIP基因CDS序列（序列1的第2055-2163位）。

为了得到不含TIP基因CDS序列的启动子片段，从翻译起始密码子ATG开始，新设计了一条下游引物R2进行第二轮PCR扩增，以第一轮PCR产物（序列1）为模板，以F1和R2为引物进行第二轮PCR扩增。

F1：5'-TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列2的第1-20位）；

R2：5'-TTTGGCACCTCACCTCAC-3'（序列2的第2037-2054位的反向互补序列）。

反应程序：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃2min15s，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果见图2，其中，泳道M为DL2000的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。用回收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体连接，连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果得到了2054bp的GmTIPp全长启动子序列，如序列2所示，命名为GmTIPp-2054。将测序正确的重组质粒命名为pMD18-GmTIPp。

实施例2、含有GmTIPp-2054启动子的重组表达载体的构建

一、带有酶切位点的大豆GmTIPp-2054启动子序列的获得

由于pMD18-T-Simple载体不带有酶切位点，根据GmTIPp-2054序列（序列2），分别设计了1条带KpnⅠ酶切位点的上游引物F-2054和1条带PstⅠ酶切位点的下游引物R，以实施例1获得的重组质粒pMD18-GmTIPp为模板，分别进行PCR扩增。

引物序列如下：

F-2054：5'-GGTACCTCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（下划线后的序列为序列2的第1-20位）；

R：5'-CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3'（下划线后的序列为序列2的第2037-2054位的反向互补序列）。

采用引物对F-2054/R扩增进行PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃2min15s，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

结果如图3所示。将所得PCR产物分别进行测序，结果显示：引物对F-2054/R扩增所得PCR产物的序列为“GGTACC+序列2的第1-2054位+CTGCAG”。

进一步，将以上PCR产物与pMD18-T-Simple载体连接，所得重组质粒命名为pMD18-GmTIPp-2054。

二、重组表达载体的构建

将步骤一获得pMD18-GmTIPp-2054进行KpnⅠ和PstⅠ的双酶切，回收酶切产物，将所得回收片段分别与经过同样双酶切的pC13P1载体（质粒图谱如图5所示）的骨架大片段相连（酶切图谱如图4所示），获得重组质粒。将经酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pC13P1载体的多克隆位点KpnⅠ和PstⅠ之间插入序列表中序列2的第1-2054位核苷酸的重组质粒命名为pCAM-TIPp-2054。

在重组表达载体pCAM-TIPp-2054中，GmTIPp-2054启动子位于GUS基因上游，驱动GUS基因的转录，同时在GUS基因下游均连接有终止其转录的NOS终止子。

实施例3、转GmTIPp-2054拟南芥的获得及表达特性研究

一、浸花法转化拟南芥及鉴定

YEP液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：5g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨；pH7.0。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

1/2MS固体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2.17g/L MS盐（Phyto Tech,目录号：M524）、7g/L琼脂、30g/L蔗糖，1ml/L MS有机（Phyto Tech,目录号：M533），pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

1、用实施例2获得的重组质粒pCAM-TIPp-2054，以及pC13P1空载体分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到2种重组农杆菌。将2种重组农杆菌分别接种于YEP液体培养基（含卡那霉素50mg/L），28℃、220rmp振荡培养，得到OD600=0.4-0.6的2种重组农杆菌菌液。

2、将pC13（Delta）GUS载体（质粒图谱如图6所示）转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于YEP液体培养基（含卡那霉素50mg/L），28℃、220rmp振荡培养，得到OD600=0.4-0.6的重组农杆菌菌液。

3、将步骤1得到的2种重组农杆菌菌液分别与步骤2中的重组农杆菌菌液按体积比1:1混合，加入0.5%（v/v）silwet L-77，共得到2种农杆菌混合液，用来浸染植株。

4、浸染植株的准备：将拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.）Columbia的种子在10%（v/v）次氯酸钠的水溶液中消毒15min，用无菌水洗3-4次后，将种子种于1/2MS固体培养基上，4℃培养3d后，置于22℃培养箱中培养，光照16h/黑暗8h。生长2周的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，生长到开花期的拟南芥用来浸染。

5、浸染：将上述步骤4中生长到花期的拟南芥植株在步骤3中制备好的2种农杆菌混合液中浸泡1min，浸染后的植株遮光过夜，浸染第二天后，恢复正常培养，一周后采用同样方法对植株进行第二次浸染。直至收获T₁代种子。

6、将收获的T₁代种子消毒后，种植于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4℃培养3d后，置于22℃培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，筛选出能够正常生长的植株，将生长2周的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，收获T₂代种子。同时提取T₁代植株的基因组DNA，进行PCR检测。具体如下：以基因组DNA为模板，采用引物对F-2054/R进行PCR检测，得到大小约为2054bp目的条带（序列2）的拟南芥为转入pCAM-TIPp-2054的阳性植株。同时设置以未转基因的野生型植株基因组DNA代替模板的阴性对照，以及以对应质粒代替模板的阳性对照。PCR检测结果如图7所示。

7、检测出目的条带的株系，其T₂代种子采用步骤6中同样的方法种植培养，收获T₃种子，选择T₃代不再分离的纯合株系的种子用来后续的试验。

二、转GmTIPp-2054拟南芥表达特性的研究

1、营养生长阶段不同发育时期的组织表达特性

取生长1d、3d、7d、20d的T₃代转基因拟南芥植株进行GUS组织染色。同时以未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。实验重复三次。

GUS组织化学染色参照Jefferson的方法。具体如下：将待染色的组织样品放入检测液中，37℃温育12-16h。70%，90%乙醇分别浸泡2h后，70%乙醇过夜，以除去绿色组织中的叶绿素。显微镜下或用肉眼观察供试样品的染色结果，并照相。白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。其中，检测液配方如下：50mmol·L^-1磷酸缓冲液（配方：4.095g Na₂HPO₄和2.537g NaH₂PO₄定容到1L水溶液中），pH7.0，10mmol·L^-1EDTA，0.1％（w/v）Triton X-100，2mmol·L^-1铁氰化钾，2mmol·L^-1亚铁氰化钾，5％（w/v）X-Gluc。各浓度为相应组分在检测液中的终浓度。

结果如图8所示，从图中可以看出，在所有转GmTIPp-2054拟南芥植株中，从种子萌发开始，在其不同生长时期，在根和下胚轴中检测到GUS基因的表达活性（蓝色），在其转基因植株叶片中几乎没有检测到。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株均无GUS表达。三次重复实验结果一致。

2、生殖生长阶段的组织表达特性

将生长2周的T₃转基因拟南芥植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，在开花结荚期对其各组织器官（叶、花、果）进行GUS组织染色，方法同步骤1。同时以未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。实验重复三次。

结果如图9所示，在生殖生长时期，转GmTIPp-2054拟南芥中在叶柄、叶片主脉、未成熟的果荚以及成熟果荚外壳有检测到少量的GUS表达活性。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia和转入pC13P1空载体的拟南芥植株均无GUS表达。三次重复实验结果一致。

3、GUS活性的测定

分别取生长20d的转基因拟南芥植株的根和叶，转基因植株取3个株系，测定根和叶中的GUS活性。同时以未转基因的野生型拟南芥Columbia（记为WT）和转入pC13P1空载体的拟南芥植株作为对照。具体如下：

（1）4-甲基伞形酮（4-MU）标准曲线的制作

4-甲基伞形酮（4-MU）标准品溶液的配制：用0.2M Na₂CO₃水溶液分别配制不同浓度的4-MU标准品溶液，1mM4-MU、10μM4-MU、1μM4-MU、100nM4-MU、50nM4-MU、10nM4-MU、5nM4-MU。其中，4-MU标准品为sigma公司产品，目录号为M1381。测定在激发光365nm，发射光455nm下的荧光光度值。根据4-MU标准品的浓度及对应荧光光度值绘制标准曲线。

（2）待测样品的制备

将取好的根和叶分别放入研钵中（预冷），用1ml的GUS提取液研磨成匀浆，转入1.5ml的离心管中，15000rpm，4℃，离心10min，收集上清液，得到待测样品，用于检测。

其中，GUS提取液配方如下：50mM磷酸缓冲液（配方：4.095g Na₂HPO₄和2.537gNaH₂PO₄定容到1L水溶液中），pH7.0，10mM Na₂-EDTA，pH8.0，10mMβ-巯基乙醇，0.1%（w/v）Triton X-100。各浓度为相应组分在GUS提取液中的终浓度。

（3）GUS活性测定

A.GUS反应

GUS反应液：4.08g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide简称4-MUG）定容到10ml GUS提取液中，用来进行酶促反应。其中，4-MUG为INALCO公司产品，目录号为1758-1630。

GUS终止反应液：0.2M Na₂CO₃水溶液，用来终止反应。

反应过程：将90μl的GUS反应液加入1.5ml的离心管中，37℃预热，加入10μl上述步骤（1）中提取好的上清液，37℃反应60min后，加入900μl的GUS终止反应液。同时，每一个样品有0min反应的对照，测定365nm/455nm荧光光度值。根据所测荧光光度值及步骤（1）得到的4-甲基伞形酮（4-MU）标准曲线，计算得到的“单位时间的4-MU浓度变化”。

B.蛋白含量测定

取上述待测样品（提取好的上清液）10μl，加入200μl考马斯亮蓝，室温反应15min，在酶标仪上测定595nm的吸光值。

牛血清蛋白（BSA）标准溶液（1mg/ml）由Bradford蛋白质定量试剂盒提供（TIANGEN，目录号PA102）。分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5μl BSA标准溶液，每个标准样用0.15M NaCl水溶液定容到10μl，加入200μl考马斯亮蓝，室温反应15min，在酶标仪上测定595nm的吸光值。根据标准样品的浓度换算上述待测样品（提取好的上清液）中的蛋白含量。

C.GUS活性计算

根据A和B的检测结果，计算待测样品的GUS活性，用“nmol/min/mg蛋白”表示。具体而言，用“单位时间的4-MU浓度变化”除以“待测样品中的蛋白含量”，求出单位质量的蛋白单位时间的4-MU浓度变化，即为单位时间内的GUS活性。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图10，在所有转GmTIPp-2054拟南芥植株中，在根中的GUS表达活性均显著高于叶中，并且在转基因植株根中都有较强的表达活性。而作为对照的未转基因的野生型拟南芥Columbia（WT）和转入pC13P1空载体的拟南芥植株的根和叶中均无GUS表达。

Claims (9)

1.DNA分子，是下述a）-c）中任一的DNA片段：

a）序列表中序列2所示的DNA片段；

b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pC13P1载体的多克隆位点处插入权利要求1所述DNA分子后得到的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

5.权利要求1所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达为根特异性表达。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用，所述双子叶植物为拟南芥或大豆。

9.扩增权利要求1所述DNA分子的引物对。