CN112707957B

CN112707957B - 大豆分生组织基因GmWUS2及其在根瘤发育中的应用

Info

Publication number: CN112707957B
Application number: CN202110185231.4A
Authority: CN
Inventors: 傅永福; 张晓玫; 韩露
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2021-02-10
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-02-10
Also published as: CN112707957A

Abstract

本发明涉及大豆分生组织基因GmWUS2及其在根瘤发育中的应用，GmWUS2的氨基酸序列如(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；或(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。本发明同时提供了GmWUS2基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO.2所示，该基因的敲除或表达降低可明显促进大豆根瘤的发育，对改进和改良大豆等作物的种质资源有重要作用，在农业生产中具有潜在的应用价值。

Description

大豆分生组织基因GmWUS2及其在根瘤发育中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆分生组织相关基因、其编码的蛋白及其在植物根瘤发育调控中的应用。

背景技术

大豆是共生固氮类植物的典型代表，其根部可与根瘤菌共生并产生根瘤。根瘤具有固氮能力，在自然界氮素的循环中起着重要的作用。结瘤的数量影响植物的固氮能力。结瘤由多种过程控制，包括外部环境和结瘤内部的自动调节机制等。结瘤的自动调节通过涉及叶片的系统过程，来控制每株植物的根瘤数量。叶组织感知来自根部早期结瘤事件的信号，然后产生新信号并传递到根，进一步限制根瘤发生和发育。

在植物器官发生过程中，分生组织细胞的有序分化和增殖赖于其不同器官、不同组织区域细胞间的信号交流。WUS基因在植物分生组织中具有重要作用。拟南芥WUS基因在茎端分生组织中心表达，其基因功能缺失突变体植株茎端分生组织不能有序维持，植株的地下部发育也受到影响。在拟南芥中，WUS和STM蛋白发生直接的相互作用，共同结合到CLV3基因的启动子上并激活其表达，从而调控茎端分生组织干细胞的活性。当CLV3蛋白积累到一定量之后会反过来抑制STM基因与WUS基因的表达。这样，WUS、STM和CLV3共同维持茎端分生组织中干细胞的数量。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物根瘤数相关的大豆分生组织基因GmWUS2及其应用。

本发明的大豆GmWUS2基因是从大豆Williams82中通过RT-PCR克隆到的，该基因具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少80％；更优选为90％。

此外，应理解、考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明提供的一种大豆GmWUS2蛋白，所述GmWUS2蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；

优选地，所述同源性为至少95％；更优选为99％。

本发明的另一个目的是提供携带GmWUS2基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞或宿主菌。

本发明的所述的植物表达载体为pSoy10。

本发明将GmWUS2基因构建到表达载体pSoy10上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pSoy10携带的GmWUS2基因转入大豆Williams82中，获得过表达GmWUS2的发根转基因大豆。本发明还将GmWUS2基因的CRISPR/Cas9基因编辑体系构建到表达载体pSoy10上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pSoy10携带的GmWUS2基因的CRISPR/Cas9基因编辑体系转入大豆Williams82中，获得过表达GmWUS2的发根转基因编辑大豆。结果表明，GmWUS2具有抑制大豆根瘤数的功能。

本发明还提供含有GmWUS2核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明提供了大豆GmWUS2蛋白、或其编码基因的抑制因子的以下任一所述的应用

(1)在提高植物根瘤数中的应用；

(2)在提高植物固氮效率中的应用；

(3)在根瘤数增加、或叶绿素含量增加、叶片增大、或产量提高的植物遗传育种中的应用；

(4)在根瘤数增加、或叶绿素含量增加、叶片增大、或产量提高的转基因植物构建中的应用；

(5)在根瘤数增加、或叶绿素含量增加、叶片增大、或产量提高的植物种质资源改良中的应用。

上述应用中，是通过降低所述GmWUS2蛋白的表达量和/或活性，增加所述植物的根瘤数、叶绿素含量、叶片大小、或产量；

所述抑制因子包括能够抑制GmWUS2蛋白表达的蛋白质、DNA或RNA；优选地，所述抑制因子为干扰RNA或sgRNA。

本发明实施例中所用的sgRNA为5’-CAACAAAACGAGGATGCAGG-3’和5’-ACTGAGCTCCAAGGAAGCAC-3’。

本发明还提供了一种大豆GmWUS2基因突变体，其为大豆GmWUS2基因编码区起始密码ATG下游30位至1575位碱基被敲除，共被敲除1546个碱基，敲除的基因序列如SEQ IDNO.9所示。具体而言，是大豆基因组(Phytozome V.12.1，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)的GmWUS2基因编码序列(CDS)序列中第33-866位发生828bp的缺失，导致GmWUS2基因功能丧失。

本发明提供了上述大豆GmWUS2基因突变体或含有该突变体的生物材料的以下任一所述的应用：

(1)在提高植物根瘤数中的应用；

(2)在提高植物固氮效率中的应用；

(5)在根瘤数增加、或叶绿素含量增加、叶片增大、或产量提高的植物种质资源改良中的应用；

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。

本发明提供一种制备根瘤数增多、叶绿素含量增多、叶片增大、和/或产量提高的转基因植物的方法，通过基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法降低所述植物中所述GmWUS2蛋白的表达量，以增加所述植物的根瘤数、叶绿素含量、叶片大小和/或产量。

本发明还提供了GmWUS2启动子在大豆根部和根瘤中驱动外源基因表达的应用，所述GmWUS2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的有益效果在于，获得了大豆GmWUS2基因及其编码蛋白GmWUS2，通过试验发现在植物中敲除GmWUS2基因以及使该基因表达量降低能够增加植物根瘤数量、提高植物叶绿素含量，促进叶片发育，GmWUS2基因启动子能够驱动外源基因在大豆根和根瘤中特异表达，本发明通过基因工程方法获得的大豆GmWUS2基因突变体特别显著增加大豆根瘤数目，较野生型相比增加率达到88.26％。与对照相比，突变体植株的叶片长增加27.8％，宽增加39.1％。而过表达大豆GmWUS2基因的转基因大豆，其大豆根瘤数较野生型相比，降低了33.34％。与对照相比，而过表达植株叶片长减少12.9％，宽减少17.6％。本发明提供的大豆GmWUS2基因及其突变体对改进和改良大豆等作物的种质资源有重要作用，在农业生产中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明大豆分生组织相关基因GmWUS2编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥AtWUS基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。

图2为本发明实施例2的克隆中间载体pGWCm的结构示意图。

图3为本发明实施例3的克隆中间载体Fu76的结构示意图。

图4为本发明实施例3的克隆中间载体Fu76-35S的结构示意图。

图5为本发明实施例4的植物表达载体pSoy10的结构示意图。

图6为本发明实施例5的克隆中间载体Fu79-sgRNA的结构示意图。

图7为本发明实施例5的克隆中间载体Fu76-Cas9的结构示意图。

图8为本发明实施例6的克隆中间载体Fu79-GUS的结构示意图。

图9为本发明实施例5-7，10的转基因发根的阳性根鉴定。左图，白场照片；右图RFP荧光照片。

图10为本发明实施例8的GmWUS2pro:GUS在大豆根和根瘤中的表达模式分析。A和B表示GmWUS2pro:GUS在根的维管组织中表达，C为GmWUS2pro:GUS在根瘤中表达，D为GmWUS2pro:GUS在根的侧根原基和根尖中表达。

图11为本发明实施例11的突变发根的基因编辑结果分析。

图12为本发明实施例12的叶片表型分析。接菌后28天Gmwus2突变体和35S:GmWUS2叶片对比。A为对照植株叶片，B为Gmwus2突变体植株叶片，C为35S:GmWUS2植株叶片。

图13为本发明实施例9的根瘤表型分析。Gmwus2突变体和35S:GmWUS2根瘤对比。A为对照植株根瘤，B为Gmwus2突变体植株根瘤，C为35S:GmWUS2植株根瘤。D为植株结瘤数统计。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别说明，实施例中所用试剂耗材均为市售可得。

实施例1大豆分生组织相关基因GmWUS2的克隆

分别利用正向引物5’-ATGATGGAACCTCAACAACAAC-3’和反向引物5’-ATCATAATCTGGAGACCTGCG-3’从大豆(Glycine max L.Williams82)中克隆并测序获得GmWUS2基因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

PCR反应程序为:95℃5min预变性，94℃30s，55℃35s，72℃1min30s，25个循环，72℃10min延伸。

大豆分生组织相关基因GmWUS2的蛋白序列与拟南芥AtWUS蛋白的氨基酸序列之间的相似性为42.9％。氨基酸序列比较见图1。

实施例2大豆分生组织相关基因GmWUS2的克隆载体

从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。

实施例3 35S启动子入门克隆载体

将35序列如SEQ ID NO.4构建克隆到如图3所示的Fu76载体上，获得如图4所示Fu76-35S启动子的入门克隆载体。

实施例4大豆分生组织相关基因GmWUS2的过表达载体

将从实施例2中得到的大豆分生组织GmWUS2的克隆载体、实施例3获得的Fu76-35S启动子的入门克隆载体与如图5所示的植物表达载体pSoy10等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmWUS2和35S构建在pSoy10上，用于在大豆中过表达大豆分生组织相关基因GmWUS2，研究其功能。植物的转化方法采用发根农杆菌介导法进行大豆发根。植物中的筛选标记为RFP红色荧光，即阳性转化根具有红色荧光(如图9所示)，实验只选取阳性根分析。

实施例5大豆分生组织相关基因GmWUS2的基因编辑载体

将大豆GmWUS2的基因编辑的两个靶序列(分别位于基因编码区起始密码ATG下游的第40至59位及第1530至1549位碱基)5’-CAACAAAACGAGGATGCAGG-3’和5’-GTGCTTCCTTGGAGCTCAGT-3’同时构建到如图6所示Fu79-sgRNA载体上，得到Fu79-sgRNA-GmWUS2载体。利用该载体，获得的突变体的基因是大豆GmWUS2基因编码区起始密码ATG下游30位至1575位碱基被敲除，共被敲除1546个碱基，如SEQ ID NO.9所示。结果导致大豆GmWUS2基因大片段缺失，功能丧失。

将Cas9基因克隆到Fu76-35S克隆载体上，获得如图7所示Fu76-35S-Cas9表达的入门克隆载体。

将从中得到的大豆分生组织Fu79-sgRNA-GmWUS2载体、Fu76-35S-Cas9表达的入门克隆载体与如图5所示的植物表达载体pSoy10等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmWUS2和35S构建在pSoy10上，获得Cas9:GmWUS2，用于在植物中大豆分生组织相关基因GmWUS2的基因编辑，研究其功能。植物的转化方法采用发根农杆菌介导法进行大豆发根。植物中的筛选标记为RFP红色荧光，即阳性转化根具有红色荧光(如图9所示)，实验只选取阳性根分析。

实施例6大豆分生组织相关基因GmWUS2的启动子分析载体

将分别利用正向引物5’-tgtatatgtatgtttggattgaaagtaa-3’和反向引物5’-ccactactcaaaacaaacaaaaaca-3’从大豆(Glycine max L.Williams82)中克隆并测序获得GmWUS2pro启动子，其序列如SEQ ID NO.3所示。

将GmWUS2pro启动子克隆到Fu76克隆载体上，获得Fu76-GmWUS2pro的入门克隆。

将从中得到的大豆Fu76-GmWUS2pro的入门克隆载体、Fu79-GUS载体(如图8所示)与如图5所示的植物表达载体pSoy10等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmWUS2pro和GUS构建在pSoy10上，获得GmWUS2pro:GUS，用于在植物中大豆分生组织相关基因GmWUS2pro启动子活性研究。植物的转化方法采用发根农杆菌介导法进行大豆转化。植物中的筛选标记为RFP红色荧光，即阳性转化根具有红色荧光(如图9所示)，实验只选取阳性根分析。

实施例7大豆发根转化

将GmWUS2pro:GUS表达载体、35Spro:GmWUS2:GFP表达载体和大豆基因编辑载体Cas9:GmWUS2分别导入发根农杆菌K599菌株中用于大豆毛状根转化。大豆种子用氯气熏蒸法灭菌16hr,取出置于超净台吹净剩余氯气后,再用灭菌的超纯水浸泡17hr备用。将含有目标载体的K599农杆菌,挑单克隆鉴定,活化后用培养基振荡培养至菌液OD₆₀₀值在1.0～1.1之间。菌液在22℃,4000g下离心10min后,菌块重悬于LCCM培养基(1/10X Gamborg B5盐，30g/L；蔗糖(3.9g/L)；0.59g/L MES pH5.4；灭菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)，获得重悬液。将浸泡好的大豆胚根切掉,留下靠近子叶节的下胚轴和子叶为外植体。将外植体浸于重悬菌液中浸泡30min完成侵染。取出外植体，在滤纸上吸干重悬液。将侵染后的大豆外植体置于共培养基(1/10X Gamborg B5盐；30g/L蔗糖(3.9g/L)；0.59g/L MES；4.25g/L琼脂；pH5.4；灭菌后加入Cysteine(400mg/L)；二硫苏糖醇(154.2mg/L)；and 40mg/L乙酰丁香酮)上,避光培养3天。将共培养后的大豆外植体的下胚轴垂直插入发根诱导培养基(1XGamborg B5盐；30g/L蔗糖；0.59g/L MES；7g/L琼脂；pH5.7；灭菌后加入100mg/L Timentin；100mg/L Cefotaxime)中,置于16hr/8hr光暗下培养12d。待在靠近子叶节的下胚轴处诱导生成毛状根生长至2cm时，取出洗净培养基。置于根瘤菌HH103悬浮液中浸染30min，完成根瘤菌接种。把整个植株移至蛭石中培养。培养14d后可见幼嫩根瘤，在荧光显微镜下观察，可以看到植株根部的红色荧光清晰明亮(如图9)，即为阳性转化根。幼嫩根瘤取材用于实验分析。实验分析20个植株以上的根上生长的根瘤。

实施例8大豆发根GUS染色

GUS染色GUS表达的组织化学分析主要参考(Jefferson et al.,1987)方法进行。将接种HH103根瘤菌的发根植株在蛭石中生长14d后取出,在流水下轻柔清洗洗净根和根瘤上残留的蛭石。在距离根瘤着生处的上下各1cm的位置剪断,获取根瘤及根瘤附近根新鲜组织为材料。将新鲜材料在预先冷却的90％丙酮中真空固定5min,在冰上放置20min,用冷水冲洗5min,加入冷却的GUS染液(50mM Sodium phosphate buffer,0.2％Triton-X-100,5mMK₄Fe(CN)₆,5mM K₃Fe(CN)₆,1～2mM X-gluc)，使用真空浓缩机抽真空10min,并在37℃下过夜。再浸泡在不同浓度下的乙醇(50％和75％)中梯度脱水。将样品材料放置在在4℃下保存或在显微镜下观察染色结果，如图10所示。

将含GmWUS2pro:GUS的转化发根植株移栽到蛭石中生长14d后,取其根和根瘤进行GUS染色。如图10所示，GmWUS2pro:GUS在根的维管组织，侧根原基，根尖和根瘤中都可见GUS信号。结果显示GmWUS2启动子在大豆根部和根瘤中均能驱动GUS基因表达。

实施例9大豆发根结瘤实验

在荧光显微镜下观察植株的毛状根是否具有RFP标记基因片段的红色荧光。将成功转化35Spro:GmWUS2:GFP表达载体、大豆基因编辑载体Cas9:GmWUS2或对照的发根植株，分别接种根瘤菌HH103：即将植物根部浸泡在根瘤菌重悬液中30min完成根瘤菌侵染。然后将植株移栽到装有蛭石、含有营养液的盆中，放置在温室(短日照8hr/16hr光暗)正常培养。培养根瘤菌HH103的TY培养基配方为：3g/L酵母提取物,5g/L Tryptone,0.4g/L CaCl₂,pH7.0。植物营养液配方：1mM KNO₃,1mM CaCl₂，10μM Fe-citrate,0.25μM MgSO₄,0.25μMK₂SO₄,1μM MnSO₄,2μM H₃BO₃,0.5μM ZnSO₄,0.2μM CuSO₄,0.1μM CoSO₄，0.1μM Na₂MoO₄，KH₂PO₄,pH5.8。在接种根瘤菌28d后取材，分析大豆根和根瘤的表型。根瘤的数目是以单株(发根遗传转化材料)为单位的总的根瘤数。其大豆根瘤数较野生型相比，突变体植株增幅为88.26％，过表达植株降低33.34％。

接菌28d后对植株的地下部进行表型分析。如图13所示Gmwus2突变体植株上的平均结瘤数为99.78个，对照植株的平均结瘤数53个，而GmWUS2基因过表达植株的平均结瘤数为35.33个。说明Cas9突变体植株上的结瘤数目要多于GmWUS2过表达植株和对照植株，而GmWUS2过表达植株的结瘤数目也明显少于对照植株的结瘤数目，过表达植株上的根瘤数是最少的。

实施例10大豆分生组织相关基因GmWUS2基因的启动子在根和根瘤中表达

由于pSoy10载体上带有RFP标记基因片段，所以阳性大豆毛状根具有红色荧光。在接菌28天后取发根植株，在荧光显微镜下观察，可以看到植株根部的红色荧光清晰明亮(如图9)，即为阳性转化根。

实施例11大豆分生组织相关基因GmWUS2基因的基因编辑位点检测

在接菌28天后，取转化Cas9:GmWUS2载体的发根，用CTAB法提取基因组DNA。以DNA为模板，进行PCR扩增，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。切胶回收目的条带，送交公司测序。测序结果如图11所示，编辑后的基因缺失1546bp碱基(如SEQ ID NO.9所示)，如实施例5所示，证明靶位点有效。

实施例12大豆分生组织相关基因GmWUS2基因抑制叶片发育

接菌28d后对植株的地上部进行表型分析。发现实施例5的GmWUS2突变体植株的叶片明显要比实施例4获得的GmWUS2过表达植株和对照组(野生型)植株的叶片更大。与对照相比，突变体植株的叶片长增加27.8％，宽增加39.1％，而过表达植株叶片长减少12.9％，宽减少17.6％(如图12所示)。

综上所述，GmWUS2基因对大豆根瘤形成具有抑制作用，根瘤的多少影响植物的固氮效率，从而对植物地上部(叶片)生长也具有间接的调控作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆分生组织基因GmWUS2及其在根瘤发育中的应用

<130> KHP211111056.8

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Glu Pro Gln Gln Gln Gln Gly Ser Gln Gln Gln Gln Gln Asn

1 5 10 15

Glu Asp Ala Gly Gly Ser Gly Lys Gly Gly Phe Leu Ser Arg Gln Ser

20 25 30

Ser Thr Arg Trp Thr Pro Thr Asn Asp Gln Ile Arg Ile Leu Lys Asp

35 40 45

Leu Tyr Tyr Asn Asn Gly Ile Arg Ser Pro Ser Ala Glu Gln Ile Gln

50 55 60

Arg Ile Ser Ala Arg Leu Arg Gln Tyr Gly Lys Ile Glu Gly Lys Asn

65 70 75 80

Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn His Lys Ala Arg Glu Arg Gln Lys Lys

85 90 95

Arg Phe Thr Phe Asp His Asn Asn Asn Asn Val Pro Met Gln Gln Arg

100 105 110

Pro Pro Thr His Pro Asn Pro Ser Ala Ser Ala Trp Lys Pro Asp Pro

115 120 125

Ile His Thr Lys Tyr Ser Asn Ile Ser Ser Thr Ala Gly Ile Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Ser Ser Ser Val Glu Met Val Thr Val Gly His Met Gly Asn

145 150 155 160

Tyr Gly Tyr Gly Ser Ala Pro Met Glu Lys Ser Phe Arg Asp Cys Ser

165 170 175

Ile Ser Ala Gly Gly Ser Ser Gly His Val Gly Ile Asn His Asn Leu

180 185 190

Gly Trp Val Gly Val Asp Pro Tyr Ser Ser Thr Tyr Ala Asn Phe Phe

195 200 205

Asp Lys Ile Arg Pro Thr Asp Gln Glu Glu Glu Ala Glu Asn Phe Gly

210 215 220

Ala Thr Lys Ile Glu Thr Leu Pro Leu Phe Pro Met His Gly Glu Asp

225 230 235 240

Ile His Gly Tyr Cys Asn Leu Lys Ser Asn Ser Tyr Asn Tyr Asp Gly

245 250 255

Asn Gly Trp Tyr His Thr Glu Glu Gly Phe Lys Asn Ala Ser Arg Ala

260 265 270

Ser Leu Glu Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Thr Arg Arg Ser Pro Asp Tyr

275 280 285

Asp

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatggaac ctcaacaaca acaagggagc caacaacaac aacaaaacga ggatgcaggt 60

ggcagtggaa aaggggggtt tctgagcagg caaagtagta cacggtggac tcccacaaac 120

gaccagatac gaatactgaa ggacctttac tacaacaatg gaattagatc cccgagtgca 180

gagcagattc agaggatctc tgctaggctg aggcagtacg gtaagattga aggcaagaat 240

gtcttttatt ggttccagaa ccacaaagct cgagaaaggc agaagaaaag gttcactttt 300

gatcataata acaataacgt ccccatgcaa caaagaccac caactcatcc taatccttct 360

gcttctgctt ggaaacctga tcccattcac accaagtatt ctaacatctc ttctactgca 420

gggatctctt cggcatcttc ttcttctgtt gagatggtta ctgtgggaca tatggggaat 480

tatgggtatg gttctgcgcc catggagaaa agttttaggg actgctcaat atcagctggg 540

ggtagcagtg gccatgttgg aataaaccac aacttggggt gggtcggtgt ggacccatat 600

tcctcaacct atgccaactt ctttgacaaa ataaggccaa ctgatcagga agaagaagca 660

gagaattttg gtgctactaa gattgaaacc ctccctttat tccctatgca cggtgaggac 720

atccatggct attgcaacct caagtctaat tcctataact atgatggaaa tggctggtat 780

catactgaag aagggttcaa gaatgcttcc cgtgcttcct tggagctcag tctcaattcc 840

tacactcgca ggtctccaga ttatgattaa 870

<210> 3

<211> 2967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtatatgta tgtttggatt gaaagtaaaa atattataaa tgcttttcaa tttgaaacaa 60

aaacatatat tttgatcttt ttgataaaat tatttttgtc ttaaaaagta ttttttcata 120

aaatcaaata tgcaccaggc caagttaccg attgttttgg aatgaaaatt agttacattc 180

aacgtaaccg acatccaaat acactttaat taaattaatg ttactaggtt acccagttaa 240

agttggcaga ttaatttcat gggtttggat caataaataa aatgttggac atgaattgag 300

ttatggatag tttattgact gcagagtggt acaagaatgc aacagttggg cgggcacatc 360

ttttcagtac tctcactcac tttcaagggt tgcttacagg caaaatagca taaaacgctg 420

aaagctgaac cgcaggttaa ttaagctgca gtggcaaaaa atgatggagc tttcgagttc 480

tgatctcacc caagataaac acaggaaaaa aaaactccag aaaccgtgaa atcccttgca 540

tttaatattc ggggtgcatg ctccgctgca ttattaagga cctgtaccca tcacaaattc 600

atccactttc ctttacattt ataacctatc aatgtagtat atatttttac tttctctcaa 660

aatatttgta ggtattttaa aaatgaaaat tttaatttta tgaaattcac atgtatattt 720

cccaactaaa ccatctttat ttattacagc aataattagc taactagtaa aaaaattatt 780

atatttttag ttgaaataga ttattagaaa aaataattaa tattttttga taattttaaa 840

cgataataag cagtatgaga taaaaaaaaa ttctgaaaat actactacaa aacgagacga 900

tggaatgaag taccatccat gatatggagt aaaatttaaa ttattcgatt gatttattga 960

aaacaacatg caaaaactgc ccaaactggt tgtttgcatc aagttttatc aatcccaaag 1020

ttgacgtata tatataaatc cacatacaag tttttttttt tcttagtagt atgtgtgaac 1080

aatttgtttt attttgagat gagctagtgc ctattgtggg cgtacccata gagtcgaaaa 1140

aacaagacaa gataaatgaa agggttaact tgtctgacaa ctataatttc taactaaacc 1200

gcttcaatag gctcactata tagagttttt aagattttct tcgttttagc ctatcttatt 1260

ggtctgttta tttacttttc tccagataaa gtgcagtcac tttataccaa taagtagaaa 1320

agtgtagcat atatgatata taccagagag aatcgtaacg ttactgtgtg atattctcat 1380

tttatttgta atttaaagta atacatgcat tgcatttttt tttaaaaaca attaattatt 1440

ctaattttat gattaaaata tttttgttta ttgaggcagc tgtaactatg catcatatct 1500

ataggttgaa atatcaatat tctaaagtga caaataaatt aaaagagaaa aatatttcaa 1560

agtgacaata aaatgaggga gaagaaagta ttgaactatt gatacaggaa gagaggagaa 1620

gaaatgaacg ttattgtttc tggttgagtt gaggataaat aacttgaaag gtacgtataa 1680

ccaaaacaga gattgagaag aagcatttac attatttttc tgtttttggt cattggtcca 1740

gtgttcataa tgaaggcctg tgaagaaaca agcatacata atagagcttt taagatcccc 1800

tcttctctca aggctttata ttgaaaatct ttgtcacata gggtgtagta ttcttcattg 1860

ctcaagcatc atcactagtc ctcgccactg cctcacaagt acaatttgaa aagctctact 1920

tcctgaaata cctatagaat atgcggacca atgcagacca caaaaataaa tagccctaat 1980

agaaaggaaa attcggtcta aatgcatgta catctatctc atcttttaag tgtatgtacg 2040

gaaagaagag atatatataa aaaataaaga aaaataagta aaaattaata gatataataa 2100

aatactaatt gatgaaaaat aaaaataaaa atacataaag agaattcaag taaaggtgag 2160

atgaaaaaga aatggataat gtatcagcat tataactcta tatgttccat gcattggttg 2220

ggacccatga gatgcacagt aagttcacaa acacattttt acccttcaat tcatcagtta 2280

agtacagaat atatcttggc agcttgttga ttcgacttaa taactataga gtatgaattt 2340

atttttaaaa aaaatatgta tatgtgtgtg taggggccat gtctgatatc tgcatcaaaa 2400

gaagaaccta ttgaactccc aaatcacaac ccgcatcatt ccattgccat tcattcattc 2460

attcattcag aacatctact cttttttttt ctttccttcc ttccatccaa tatatcattt 2520

catgcctcat ttttctacct tttctcactg tctcggtgtg caaatacttt tatttcacac 2580

atacctggtc atgccttttc gtccaagtaa ttcctgatag tactcacttt ctaagctctc 2640

ttttgtccct tcccttttta tgaacaccac tctgtcaccc tcagtccttc tctctcagac 2700

attttttatg acttttctct ctttatcact ccatgtacta tatgtccctg tgcctcatct 2760

attatctatc atcatcacct attataagtt tataaccccc ctcacccctc cctctcccct 2820

tcataattca tgcagtagta gtactctctc ttctcaccta ccctcttata ttcaaattct 2880

ctttcttggt ccaaccaaca aacactacat actactactc tttttgtttt gtttggtttg 2940

gttgtttttg tttgttttga gtagtgg 2967

<210> 4

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacccctac tccaaaaatg tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac 60

ttttcaacaa agggtaattt cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca 120

cttcatcgaa aggacagtag aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa 180

aggaaaggct atcattcaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc 240

cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg 300

atgtgacatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cacccctact ccaaaaatgt 360

caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatttc 420

gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga 480

aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcattcaaga 540

tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 600

agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgacatct ccactgacgt 660

aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 720

atttcatttg gagaggac 738

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatggaac ctcaacaaca ac 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcataatct ggagacctgc g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacaaaacg aggatgcagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcttcctt ggagctcagt 20

<210> 9

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acaacaacaa caaaacgagg atgcaggtgg cagtggaaaa ggggggtttc tgagcaggca 60

aagtagtaca cggtggactc ccacaaacga ccagatacga atactgaagg acctttacta 120

caacaatgga attagatccc cgagtgcaga gcagattcag aggatctctg ctaggctgag 180

gcagtacggt aagattgaag gcaagaatgt cttttattgg ttccagaacc acaaagctcg 240

agaaaggcag aagaaaaggt tcacttttga tcataataac aataacgtcc ccatgcaaca 300

aagaccacca actcatccta atccttctgc ttctgcttgg aaacctgatc ccattcacac 360

caagtattct aacatctctt ctactgcagg taggttaacc aaaccaacca tatactaatt 420

tctctctcaa attacttcac taactagttg attaaattta tgtcttactc ttatattgtg 480

gccatgtttg tgtatgtagg gatctcttcg gcatcttctt cttctgttga gatggttact 540

gtgggacata tggggaatta tgggtatggt tctgcgccca tggagaaaag ttttagggtg 600

agttaagatg actcctaatt tggtttttat ggatatgaga cacttatata tagtttttaa 660

acagcctagc tccccactct aatatgaatt cctatatata tatatatata tatatatata 720

tatatatata tatatatata tatatttatt tttttccttt ctcttttatc attgttcagt 780

gtccatatat atgcaacttt gtgatgcatt gaaatggaaa gcaatatcca tgatccatca 840

catgtgtagt gcgcaagtaa ttagtgatag tctactatac atacccacga tatcttattt 900

aacaacaaaa cggagcgaca atcagtcttt tacactattc aatccttgaa acttccataa 960

atggaagaac cccattggcc tcttggctct cttctataat gacaaagcaa tgtataatta 1020

aggaaaacat ttcaatgagt aaaacttata tatttctctt gagagagaag gagtataagt 1080

agtattcaaa gttcaaacaa ggagttcact agcttataac tagatttaga aatgatcatt 1140

tcaatgaagt gtttgattaa ttcttaatga tcaatttgtt ttgaactttc ttaatttctt 1200

atcaggactg ctcaatatca gctgggggta gcagtggcca tgttggaata aaccacaact 1260

tggggtgggt cggtgtggac ccatattcct caacctatgc caacttcttt gacaaaataa 1320

ggccaactga tcaggaagaa gaagcagaga attttggtgc tactaagatt gaaaccctcc 1380

ctttattccc tatgcacggt gaggacatcc atggctattg caacctcaag tctaattcct 1440

ataactatga tggaaatggc tggtatcata ctgaagaagg gttcaagaat gcttcccgtg 1500

cttccttgga gctcagtctc aattcctaca ctcgcaggtc tccaga 1546

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtatatgta tgtttggatt gaaagtaa 28

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccactactca aaacaaacaa aaaca 25

Claims

1.大豆GmWUS2蛋白，其特征在于，所述GmWUS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的大豆GmWUS2蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。

4.权利要求1所述的大豆GmWUS2蛋白、权利要求2所述的编码基因或权利要求3所述的生物材料在降低植物根瘤数、降低植物固氮效率、降低植物叶片生长水平和/或减少植物叶绿素含量中的应用。

5.权利要求1所述的大豆GmWUS2蛋白或其编码基因的抑制因子的以下任一所述的应用：

(1)在提高植物根瘤数中的应用；

(2)在提高植物固氮效率中的应用；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过降低所述GmWUS2蛋白的表达量和/或活性，增加所述植物的根瘤数、叶绿素含量、或产量；

所述抑制因子包括能够抑制GmWUS2蛋白表达的蛋白质、DNA或RNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制因子为干扰RNA或sgRNA。

8.一种大豆GmWUS2基因突变体，其特征在于，其为大豆基因组Phytozome V.12.1的GmWUS2基因编码序列中第33-866位发生828bp的缺失，所述GmWUS2基因编码序列如SEQ IDNO.2所示。

9.权利要求8所述的大豆GmWUS2基因突变体或含有该突变体的生物材料的以下任一所述的应用：

(1)在提高植物根瘤数中的应用；

(2)在提高植物固氮效率中的应用；

所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。

10.一种制备根瘤数增多、叶绿素含量增多和产量提高的转基因植物的方法，其特征在于，通过基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法降低所述植物中所述GmWUS2蛋白的表达量，以增加所述植物的根瘤数、叶绿素含量、叶片大小和/或产量。

11.GmWUS2启动子在大豆根部和根瘤中驱动外源基因表达的应用，所述GmWUS2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。