CN114504649A - Malat1抑制剂在腹主动脉瘤防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供Malat1抑制剂在腹主动脉瘤防治中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究首次发现，Malat1抑制剂MALAT1‑IN‑1可以基于三个方面有效保护主动脉，实现腹主动脉瘤的预防、抑制和逆转。因此，Malat1抑制剂的新型应用在腹主动脉瘤治疗策略中具有重要的临床价值。同时，本发明还使用单细胞分析确认抑制剂在单细胞水平上的治疗效果，从而为MALAT1‑IN‑1开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的腹主动脉瘤药物奠定理论和试验基础，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

Malat1抑制剂在腹主动脉瘤防治中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及Malat1抑制剂在腹主动脉瘤防治中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一类发病率高、死亡率高、检出率低、控制率低的严重大血管疾病。AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉，患者通常没有症状，即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉，患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA，因此早期发现极为困难。然而，AAA常呈进行性膨胀，内径增长速率约为1-6mm/年，AAA直径越大，扩张速度越快，AAA最大直径与AAA破裂风险之间呈指数曲线关系。

如何发现AAA的快速膨胀并进行有效的抑制，是临床医学面临的重大难题。遗憾的是，目前临床推荐使用的药物均不能抑制AAA的发展。β受体阻滞剂、抗生素和抗炎药的随机临床试验以及血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、他汀类药物、抗血小板药和金属蛋白酶抑制剂强力霉素的非随机临床试验均获得了阴性的结果，表明这些药物对于AAA的病程没有影响。

当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时，可实施外科矫正术或血管内介入手术。因此，对于预防AAA破裂，手术矫正和支架介入是唯一有效的方法，但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药，已成为AAA研究领域中的当务之急。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供Malat1抑制剂在腹主动脉瘤防治中的应用。本发明通过研究首次发现，Malat1抑制剂MALAT1-IN-1可以基于三个方面有效保护主动脉，实现AAA的预防、抑制和逆转。因此，Malat1抑制剂的新型应用在AAA治疗策略中具有重要的临床价值。基于上述研究成果，从而完成本发明。

本发明的第一个方面，提供MALAT1-IN-1在制备腹主动脉瘤预防和/或治疗药物中的应用。

本发明通过研究发现，MALAT1-IN-1可以显著改善AAA的发生率和其他AAA评估的基本指标，有效阻止Ang II输注诱导的主动脉壁的病理重塑，因此具有良好的AAA预防作用。同时，MALAT1-IN-1还可以有效逆转和抑制Ang II诱导的AAA，即MALAT1-IN-1具有有效的预防、逆转和抑制AAA的作用。

因此，本发明的第二个方面，提供MALAT1-IN-1在制备抑制腹主动脉瘤的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供MALAT1-IN-1在制备逆转腹主动脉瘤的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物组合物，所述药物组合物由MALAT1-IN-1与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

本发明的第五个方面，提供一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的方法，所述方法包括向受试者施用上述MALAT1-IN-1或药物组合物。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道Malat1抑制剂MALAT1-IN-1可以有效预防、抑制和逆转AAA的发生发展，因此Malat1抑制剂的新型应用在AAA治疗策略中具有重要的临床价值，同时，上述技术方案使用单细胞分析确认抑制剂在单细胞水平上的治疗效果，从而为MALAT1-IN-1开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的AAA药物奠定理论和试验基础，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中的细胞实验，其中a为在给予Ang II的DMSO和MALAT1-IN-1平滑肌细胞组中检测到Malat1，MMPs和炎症因子的相对RNA水平。每组样本数n＝5。同时通过免疫印迹检测相应的蛋白质表达水平。每组样本数n＝5。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。每个实验独立重复至少三次。

图2为本发明实施例中的动物实验，其中，a为抑制剂的预防实验流程图。Ang II泵注的前2周注射抑制剂对AAA形成的预防作用显著。生存曲线和AAA发生率的结果支持了抑制剂的预防效果。每组样本数n＝20。b为各组腹主动脉组织大体病理表现，揭示了抑制剂对AAA形成的预防作用。注射抑制剂的小鼠的最大腹主动脉直径和总主动脉重量均低于DMSO组。统计结果样本数：D组和IN组n＝20。4WA+D组n＝12，4WA+IN组n＝15。c为MMP2、MMP9、IL-1β、TNF-α和tubulin在各组腹主动脉中的表达。每组样本数n＝5。d为各组腹主动脉的H&E和弹性蛋白代表性染色。放大倍率分别为40倍和400倍。e为抑制剂的抑制实验流程图。抑制剂4周连续Ang II泵注的最后2周内给药。生存曲线和AAA发生率的结果支持了抑制剂的抑制作用。每组样本数n＝20。f为各组腹主动脉组织大体病理表现，揭示了抑制剂对AAA进展的抑制作用。注射抑制剂的小鼠的最大腹主动脉直径和总主动脉重量低于DMSO组。统计结果样本数：D组和IN组n＝20，4WA+2WD组n＝14，4WA+2WIN组n＝16。g为各组腹主动脉的H&E和弹性蛋白代表性染色。h为抑制剂的逆转实验流程图。抑制剂在Ang II泵注两周后开始注射，注射时间为两周。生存曲线和AAA发生率的结果支持抑制剂的逆转作用。每组样本数n＝20。i为各组腹主动脉组织大体病理表现，显示抑制剂对AAA的逆转作用。注射抑制剂的小鼠的最大腹主动脉直径和总主动脉重量低于DMSO组。对照组和2WA组n＝20，2WA+D组n＝16，2WA+IN组n＝18。j为各组腹主动脉的H&E和弹性蛋白代表性染色。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。每个实验独立重复至少三次。

图3为本发明实施例中的单细胞实验，其中，a为从三组主动脉组织中获得的22975个细胞的t-SNE聚类图。AA，健康的腹主动脉；D_A，Ang II诱导的AAA同时注射DMSO；IN_A，Ang II诱导的AAA同时注射抑制剂。b为各组主要细胞类型的数目。c为各组主要细胞类型的比例。VSMC和免疫细胞的比例变化最大。d为D_A组和IN_A组VSMC差异显著基因火山图。e为IN_A组与D_A组的下调基因的KEGG分析。

图4为本发明实施例中的补充材料，其中，a，b分别为蛋白质印迹和免疫组织化学染色中MMP2，MMP9，IL-1β，TNF-α蛋白表达水平的统计结果。每组样本数n＝6。c为预防实验中各组小鼠主动脉弹性蛋白降解分级统计结果。d为抑制实验中两组小鼠腹主动脉的代表性计算机断层扫描血管造影(CTA)图像。通过两周抑制剂注射，腹主动脉的直径显著减小。e为逆转实验中，两组小鼠腹部主动脉的代表性CTA图像。f，g分别为抑制实验和逆转实验小鼠主动脉弹性蛋白降解分级统计结果。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如前所述，大力研发可抑制AAA发生和发展的新药，已成为AAA研究领域中的当务之急。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供MALAT1-IN-1在制备腹主动脉瘤预防和/或治疗药物中的应用。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗腹主动脉瘤及其相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

其中，所述MALAT1-IN-1，其化学式为：5-(4-甲氧基苯基)-N-[(3-甲氧基苯基)甲基]-1-甲基-1H-咪唑-2-胺，CAS No:827327-28-6，其是一种有效且特异性的Malat1(转移相关性肺腺癌转录本1)抑制剂。MALAT1-IN-1以剂量依赖性方式调节Malat1下游基因，而不影响富含核的丰度转录本1(Neat1)的表达。

本发明通过研究发现，MALAT1-IN-1可以显著改善AAA的发生率和其他AAA评估的基本指标，有效阻止Ang II输注诱导的主动脉壁的病理重塑，因此具有良好的AAA预防作用。同时，MALAT1-IN-1还可以有效逆转和抑制Ang II诱导的AAA，即MALAT1-IN-1具有有效的预防、逆转和抑制AAA的作用。

因此，本发明又一具体实施方式中，提供MALAT1-IN-1在制备抑制腹主动脉瘤的药物中的应用。

本发明又一具体实施方式中，提供MALAT1-IN-1在制备逆转腹主动脉瘤的药物中的应用。

根据本发明，不仅公开了MALAT1-IN-1在制备预防和/或治疗腹主动脉瘤药物中的应用，而且还公开了，施用MALAT1-IN-1与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，MALAT1-IN-1还可以与其它非药物活性成分组合使用。

本发明又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物组合物，所述药物组合物由MALAT1-IN-1与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

在本发明的意义上，本发明所述的药物组合物表示一种物质，其所含有的MALAT1-IN-1对AAA具有明显的预防、抑制和逆转作用。

所述非药物活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

优选的，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的方法，所述方法包括向受试者施用上述MALAT1-IN-1或药物组合物。

本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

方法

在机制实验中，将小鼠分为DMSO组(D)，抑制剂组(IN)，4周Ang II+DMSO组(4WA+D)和4周Ang II+抑制剂组(4WA+IN)。在Ang II泵注之前注射抑制剂2周，并持续整个过程(n＝20)。通过尾静脉注射MALAT1-IN-1溶液(200ug/kg，MCE，Cat.No.:HY-13948)和DMSO溶液每周两次，使用相同的助溶剂稀释，DMSO浓度相同均为2％。

在抑制实验中，ApoE-/-小鼠随机分为2组(n＝20)，同时泵注Ang II(1，000ng/kg/min)并高脂喂养4周。在泵注Ang II的最后2周分别注射抑制剂或DMSO。在逆转实验中，将ApoE-/-小鼠随机分为2组(n＝20)，同时泵注Ang II(1，000ng/kg/min)。并进行高脂喂养。2周后，取出渗透泵，停止泵注Ang II。然后，两组分别注射抑制剂或DMSO 2周。

结果

Malat1抑制剂在体外显著保护血管平滑肌细胞(VSMC)免受Ang II刺激

我们在VSMC中使用了浓度为10^-5M/ml的Malat1抑制剂(MALAT1-IN-1)，Malat1的RNA水平降低了近50％；此外，MMP2，MMP9，IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白质水平也显著降低(图1a)。综上所述，Malat1抑制剂显著保护血管平滑肌细胞(VSMC)免受Ang II刺激。

Malat1抑制剂可显著预防、抑制和逆转Ang II诱导的AAA

为了探索Malat1抑制剂在体内的预防作用，我们通过Ang II皮下泵注同时高脂喂养的ApoE-/-雄性小鼠中构建了AAA模型。将小鼠分为4组，DMSO(D)，抑制剂(IN)，4周Ang II+DMSO(4WA+D)和4周Ang II+抑制剂(4WA+IN)组。在Ang II输注前注射抑制剂2周，并持续整个过程。在实验结束时，4WA+IN组的存活小鼠数量高于4WA+D组(图2a)。抑制剂显著改善了AAA的发生率和其他AAA评估的基本指标(图2b)。此外我们通过蛋白质印迹和免疫组化染色检测了MMPs和炎症细胞因子的表达(图2c，d；图4a，b)。HE和弹性蛋白染色表明，4WA+D组中AAA病变更严重，弹性蛋白降解的等级更高(图4c)。这些结果表明，MALAT1-IN-1有效地预防了Ang II诱导的主动脉壁的病理重塑。

为了探讨抑制剂的抑制和逆转作用，我们进一步设计了抑制和逆转动物实验，以评估抑制剂在AAA保护中的作用。

在抑制实验中，将小鼠随机分为两组(n＝20)，并注入Ang II 4周。在Ang II输注的最后2周分别注射抑制剂或DMSO(图2e)。在逆转实验中，将小鼠随机分为两组(n＝20)，并注入Ang II 2周。然后去除渗透泵以停止Ang II输注，并分别注射抑制剂或DMSO 2周(图2h)。基于CT成像的同一组小鼠直径变化的统计分析表明，抑制剂可以逆转已建立的AAA或扩张的主动脉(图4d，e)。AAA评价指标(生存曲线、AAA发病率、主动脉直径等)和组织病理学结果表明，该抑制剂可有效逆转和抑制Ang II诱导的AAA(图2e-j，图4f，g)。最终，这些结果阐明了抑制剂的预防，抑制和逆转作用，并为其在进一步临床应用中的治疗价值提供了新的证据。

单细胞分析揭示了Malat1抑制剂对Ang II诱导的AAA细胞组成和基因表达的改善

为了分析Malat1抑制剂对AAA在单细胞水平的作用，我们使用单细胞测序来检测相应的AAA组织，并验证了上述结论。

根据批次校正后的scRNA-seq数据，我们从健康腹主动脉组(AA组)，Ang II+DMSO组(D_A组)和Ang II+抑制剂组(IN_A组)三组的主动脉组织中获得了22975个细胞(图3a)。来自三个不同组的样本具有相似的细胞组成，但具有不同的细胞比例。与AA组相比，D_A组VSMC的数量和比率明显降低，但被抑制剂恢复(图3b，c)。然而，免疫细胞如单核细胞表现出完全相反的变化(图3b，c)。

火山图差异基因分析表明，与SMC收缩表型(Rock1，Myh11)相关的基因表达被下调，而与IN_A组相比，D_A组中AAA相关基因(Mmp2，Spp1)表达上调(图3d)。KEGG分析表明，与D_A组相比，IN_A组的下调基因主要富集在ECM-受体相互作用和TNF信号通路途径(图3e)。这些结果表明，该抑制剂可以缓解细胞外基质降解和SMC收缩表型的减少。

综上所述，在单细胞水平上该抑制剂可以有效缓解AAA病变。

本发明未尽事宜为公知技术。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.MALAT1-IN-1在制备腹主动脉瘤预防和/或治疗药物中的应用。

2.MALAT1-IN-1在制备抑制腹主动脉瘤的药物中的应用。

3.MALAT1-IN-1在制备逆转腹主动脉瘤的药物中的应用。

4.一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由MALAT1-IN-1与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述非药物活性成分是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂。

6.如权利要求4所的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型。

7.如权利要求4所的药物组合物，其特征在于，所述载体、赋形剂及稀释剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。

8.权利要求4-7任一项所述的药物组合物在预防、抑制和逆转腹主动脉瘤中的应用。

9.一种预防和/或治疗腹主动脉瘤的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用MALAT1-IN-1或权利要求4-7任一项所述药物组合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受试者是人和非人哺乳动物。

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