CN112933072B - α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了α‑酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途。所述的α‑酮戊二酸可以显著降低血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤的形成，进而提高小鼠生存率。本发明发现，所述的α‑酮戊二酸是通过调控线粒体功能，进而抑制血管平滑肌的凋亡，从而最终达到抑制腹主动脉瘤的发生发展。

Description

α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的 用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种心血管药物，具体来说是α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途。

背景技术

腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)是指腹主动脉局限性扩张并且直径超过正常值的1.5倍以上，是一种常见的致命性退行性血管病变。AAA通常没有症状，直至发生破裂、濒临破裂或引起压迫，才产生症状，而AAA一旦破裂，其死亡率达60％～80％。AAA发病机制仍不清楚，目前AAA的高危因素主要包括：高龄、男性、高血脂、糖尿病、高血压、吸烟等。随着人口的老龄化，腹主动脉瘤发病率呈现明显上升趋势。超声筛查发现自然人群中AAA的发病率为：65岁以上男性4％～7％，65岁以上女性1％～2％。同时，西方的统计数据显示腹主动脉瘤发病率随着年龄的增长，逐渐增高：<60岁成年人中的AAA发病率为<0.1％，60～70岁为0.7％，>70岁为5％～10％。

腹主动脉瘤大多数没有明显症状，但随着瘤体的逐渐增大，其破裂的风险也显著提高。目前，关于AAA的治疗方式主要局限于手术或介入治疗，而对于未达到手术标准的动脉瘤，临床上常采取密切观察，缺乏有效的药物预防和治疗措施。外科手术治疗主要包括开放手术修复与腔内人工血管修复术，必要时两者联合使用。外科手术创伤大，患者经济负担重，临床上为了避免治疗手段上对手术的依赖，人们更倾向于药物治疗。然而到目前为止，本领域还没有一种疗效明确、副作用小的治疗药物。现有的关于AAA药物治疗指南仅仅停留在专家经验的层面，没有明确证据提示可以抑制AAA的发生发展。因此本领域迫切需要开发新的用于预防腹主动脉瘤发生或延缓其进展的药物。

随着医药卫生事业的进步，AAA的治疗技术也飞速发展，但其病因与具体发病机制仍不明确。目前大部分研究认为AAA的发病机制主要与以下几个方面有关：(1)遗传学方面：人类学筛查和遗传学相关研究均显示遗传因素影响AAA的发生和发展。全基因组关联分析研究(Genome wide association studies，GWAS)已明确单核苷酸多态性(SNPs)，如DAB2互作蛋白(DAB2IP)、染色体3p12.3、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)与AAA形成相关。此外，表观遗传学修饰和DNA甲基化可能对遗传因素产生作用从而影响AAA的发生。(2)炎症：炎症的发生在AAA的发生发展中起着至关重要的作用。它被认为是一种炎性疾病，病理过程起始于主动脉内壁的慢性炎性反应。多种类型的炎性细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞，以及血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)均参与AAA炎性反应。(3)血管平滑肌细胞坏死凋亡：已有研究证明，虽短期炎症细胞浸润能刺激VSMCs增殖，但长久观察，可发现中膜血管平滑肌呈现系统性程序性凋亡。除此之外，动脉粥样硬化的条件下，血管平滑肌迁移并发生一定程度的增殖。(4)细胞外基质的改变：研究发现在AAA患者中，炎症反应、氧化应激等因素的刺激加速了动脉中层弹力纤维和胶原纤维降解，主动脉壁稳定性被破坏。与此同时，VSMCs凋亡导致其修复能力不足，虽然动脉壁中胶原含量增加，但无法形成原有结构，瘤体最终无法耐受动脉的压力和血流的冲击而破裂。(5)氧化应激的发生：在炎症因子等因素的刺激下，血管壁细胞NADPH酶活性增强，活性氧生成增加，进一步加重了VSMCs的凋亡与细胞外基质的降解。(6)肾素-血管紧张素系统(renin -angiotensin system，RAS)的过度激活：已有大量动物实验证明，RAS与动脉瘤的发生有密切关系。研究人员在建立动物模型时，将AngⅡ经皮下注入正常小鼠或高胆固醇血症的小鼠后，AAA的发生率明显增加。对于不同的个体，其主要的发病机制可能不同，但上述不同机制将相互影响，形成恶性循环，促进动脉瘤的发生。

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，AKG）是三羧酸循环中的一个重要环节，其不仅是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，还是生物体内L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等多种氨基酸、维生素和有机酸的生物合成前体，动物实验也显示出了其口服的安全性。此前有研究报道，运动可显著增加血液AKG水平。外源添加AKG可显著提高正常小鼠的运动能力，激活蛋白质合成相关信号通路，增加肌肉蛋白质合成增加。α-酮戊二酸可以降低系统性炎症细胞因子水平，可以改善雌性小鼠的毛色和毛发状况、步态和脊柱后凸，并且有助于保持雄性小鼠的肌肉质量，步态和握力，且它们有较少的肿瘤和更好的眼睛健康，雌雄小鼠寿命均有所延长。因此AKG被认为是一种重要的活性代谢中间产物，在干细胞发育、抗衰老、抗癌和调节能量代谢等方面均具有重要作用，围绕AKG的研究和药物开发是目前国内外研究的前沿领域，一系列研究表明了AKG作为药物靶点在临床药物开发方面的广泛前景，然而其在改善和治疗腹主动脉瘤方面的应用尚无研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途，所述的这种应用要解决现有技术中的药物对于预防或者治疗腹主动脉瘤的效果不佳的技术问题。

本发明提供了α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途。

进一步的，所述的α-酮戊二酸由α-酮戊二酸盐转变而来，所述的α-酮戊二酸盐为α-酮戊二酸钠、α-酮戊二酸钙、α-酮戊二酸镁或者精氨酸-α-酮戊二酸。

进一步的，α-酮戊二酸的药物剂型为：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。

具体的，α-酮戊二酸的别名为：2-氧代戊二酸、2-氧化戊二酸、2-酮戊二酸，英文名称为：α-Ketoglutaric acid。

本发明发现了一种具有潜在治疗腹主动脉瘤价值的α-酮戊二酸，调控该靶点可有效降低血管紧张素II(Angiotensin II ,Ang II)诱导的小鼠腹主动脉瘤发生率，提高小鼠生存率。

具体的，α-酮戊二酸能够抑制AngII诱导的小鼠血管的细胞外基质降解和胶原形成，血管弹力纤维的断裂。

细胞实验进一步发现α-酮戊二酸主要是主要通过改善线粒体功能，减少血管平滑肌细胞凋亡，维持血管中膜结构的完整性，从而降低腹主动脉瘤的发生率和严重程度。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明提供的α-酮戊二酸可以显著降低血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤的形成，进而提高小鼠生存率。α-酮戊二酸通过调控线粒体功能，进而抑制血管平滑肌的凋亡，从而最终达到抑制腹主动脉瘤的发生发展。

附图说明

图1显示了α-酮戊二酸显著降低Ang II诱导的小鼠腹主动脉瘤发生率。

图2显示了α-酮戊二酸调节平滑肌细胞线粒体功能，抑制平滑肌细胞的凋亡，从而降低主动脉瘤的发生率。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用来描述本发明，而不是限制本发明。

下述实施例中采用的试剂及实验方法如下：

分子生物化学试剂：DM-α-酮戊二酸（DM-αKG）、蛋白酶磷酸酶抑制剂(Potease&Phosphatase Inhibitor Cocktail)、血管紧张素II(Angiotensin II, AngII)、Sodiumdodecylsulfate (SDS) 、Tris-Base等为Sigma美国，Tris-Buffered Saline(TBS)、Tween-20、 phosphate-Buffered Saline (PBS)等为生工生物中国，化学发光HRP底物ECL发光液为Millipore美国，异氟烷为鲁南贝特中国，兔抗β-actin为Cell Signaling Technology美国。

实施例1，小鼠腹主动脉瘤模型的建立与给药处理：

(1)配制Ang II微量泵：选用微量泵型号为Osmotic minipumps(Model 2004，体积为200μM，给药速率0 .25μL/h，给药总时长为28天)，按1000ng/kg/min计算出每组小鼠所需Ang II总量，溶解于生理盐水（质量百分比浓度为0.9%的氯化钠， Saline）溶液中，注满微量泵。Vehicle组的微量泵中仅注入Saline溶液。

(2)微量泵植入手术：8-10周龄小鼠经麻醉机持续吸入体积百分比浓度为2％的异氟烷进行麻醉(通气速率2L/min)。使用小动物剃毛刀去除小鼠背部毛发后，用酒精清洁、消毒背部手术区域，铺无菌巾。在背部一侧皮肤做一长约1cm切口，钝性分离背部皮肤和皮下组织。将配制好的微量泵植入皮下后，缝合皮肤切口。关闭麻醉机，将小鼠放置于恒温加热毯上直至其从麻醉中苏醒。手术过程约10分钟。

在第一部分实验中，C57BL/6J背景的ApoE^-/-小鼠，共分4个实验组：

(1)Vehicle组：行Saline微量泵植入术后予以每日一次腹腔注射Saline溶剂，持续4周；

(2)DM-αKG组：行Saline微量泵植入术后予以每日一次腹腔注射溶解有DM-αKG的溶液(简称DM-αKG溶液)，持续4周；

(3)Ang II组：行Ang II微量泵植入术后予以每日一次腹腔注射Saline溶剂，持续4周；

(4)Ang II+DM-αKG组：行Ang II微量泵植入术后予以每日一次腹腔注射DM-αKG溶液，持续4周。

术后DM-αKG给药：按体积比1:19的比例配制DMSO/Saline溶剂，将DM-αKG按100mg/kg/d的剂量每天上午10点皮下注射，持续4周。对照组注射相应体积的Saline溶剂。

小动物主动脉超声评价：将小鼠用体积百分比浓度为2％异氟烷持续吸入麻醉并仰卧位固定于自带加热功能的超声检查台上，先用脱毛膏脱去其胸腹部鼠毛，涂抹上超声耦合剂。使用VisualSonics公司的VeVo 770超声诊断仪和30MHz高频探头探查小鼠下腔静脉、腹主动脉及其各分支走行。在肾动脉下方及髂动脉分支上方探查腹主动脉大小横径变化，取最大处测量三次，记录数据。各组小鼠检查的仪器参数设置保持相同，并由同一人进行图像采集和计算，测量期间注意观察小鼠体征和心率变化。

小动物主动脉磁共振评价：将小鼠用2％异氟烷持续吸入麻醉并俯卧位固定于自带加热功能的磁共振检查台上。使用bruker公司磁共振探查小鼠腹主动脉及其各分支走行。各组小鼠检查的仪器参数设置保持相同，并由同一人进行图像采集和计算，测量期间注意观察小鼠体征和心率变化。

C57BL/6J背景的ApoE^-/-小鼠行Ang II微量泵植入术后，使用小动物超声和磁共振检查对小鼠腹主动脉血管内径进行检测，发现Ang II+DM-αKG组小鼠的血管内径较Ang II组内径显著降低。

进一步统计小鼠的腹主动脉瘤的发生率，发现Ang II+DM-αKG组小鼠的腹主动脉瘤的发生率较的Ang II组显著降低。

图1A为各组小鼠腹主动脉大体形态照片。Ang II组小鼠的腹主动脉瘤较Ang II+DM-αKG组小鼠显著扩张。

图1B为各组小鼠磁共振图，可见Ang II组小鼠的腹主动脉内径较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增粗。

图1C为各组小鼠的AAA的发生率统计柱形图。可见Ang II组小鼠的腹主动脉瘤的发生率较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增加。

图1D为各组小鼠的腹主动脉的最粗管腔直径统计柱形图。可见Ang II组小鼠的腹主动脉的直径较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增加。

图1E为各组小鼠的血管/体重比值统计柱形图。可见Ang II组小鼠的血管/体重比值较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增加。

图1F为各组小鼠的超声图。可见Ang II组小鼠的腹主动脉内径较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增粗。

图1G为各组小鼠的组化染色（HE/Masson/EVG染色）。形态学可见Ang II组小鼠的腹主动脉瘤的严重程度较Ang II+DM-αKG组小鼠显著增加。

实施例2

在第二部分实验中，将C57BL/6J背景小鼠主动脉提取原代平滑肌细胞，分为四组：

(1) Saline+Vehicle组：将Saline处理后的原代平滑肌细胞加PBS处理；

(2) Ang II+Vehicle组：将Ang II处理后的原代平滑肌细胞加PBS处理。

(3)Saline+DM-αKG组：将Saline处理后的原代平滑肌细胞加DM-αKG处理。

(4)Ang II+DM-αKG组：将Ang II处理后的原代平滑肌细胞加DM-αKG处理。

图2A为血管平滑肌细胞Mito-tracker Red检测：培养皿/板内加入适量的培养基覆盖盖玻片进行爬片培养。当细胞长至所需密度，吸除培养液，加入37℃预热的MitoTracker Red CMXRos染色工作液。在所使用细胞正常培养条件下孵育15-45 min（最佳孵育时间需优化）。染色结束后，使用新鲜培养液或缓冲液替换上述染色液，即可将其置于荧光显微镜下观察。证明DM-αKG能够改善Ang II诱导的VSMCs线粒体膜电位的失衡。

图2B为血管平滑肌细胞JC-1检测：对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。证明DM-αKG能够抑制Ang II诱导的VSMCs线粒体凋亡。 图2C为 WB检测血管平滑肌细胞凋亡指标：可见经DM-αKG处理的VSMCs中，凋亡蛋白的与对照组相比显著下降。

图2D为WB检测的凋亡相关蛋白统计柱形图，通过半定量统计显示DM-αKG可以降低平滑肌细胞的凋亡。

Claims (3)

1.α-酮戊二酸在制备用于预防或者治疗腹主动脉瘤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的α-酮戊二酸由α-酮戊二酸盐转变而来，所述的α-酮戊二酸盐为α-酮戊二酸钠、α-酮戊二酸钙、α-酮戊二酸镁或者精氨酸-α-酮戊二酸。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：α-酮戊二酸的药物剂型为颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。

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