CN111494599B - AcSDKP在制备炎症性肠病治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种活性成分的用途，其特征在于：所述活性成分选自一种内源性四肽化合物、或其类似物或衍生物；所述内源性四肽化合物为N‑乙酰基‑丝氨酰‑天门冬酰‑赖氨酰‑脯氨酸(AcSDKP)；所述活性成分用于制备治疗、预防或缓解肠道炎症的药物。

Description

AcSDKP在制备炎症性肠病治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及活性因子，具体地，涉及AcSDKP在制备炎症性肠病治疗药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(IBD)主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，是一类慢性非特异性消化道炎性疾病。21世纪以来，IBD已经成为一种全球性疾病，在北美洲、大洋洲和欧洲等西方国家其患病率已经超过0.3％，在亚洲、南美洲和非洲等新兴工业化国家其发病率正在快速增长。IBD的发病机制复杂且尚不明确，与遗传、环境、微生物、免疫等多因素有关。在IBD的治疗方面，不论是传统的氨基水杨酸类药物、糖皮质激素和免疫抑制剂，还是新型的生物制剂(已获FDA批准的肿瘤坏死因子拮抗剂和整合素拮抗剂)，均无法对所有的IBD患者实现诱导缓解及维持缓解，部分患者对目前所有可使用的临床药物无反应。此外，上述药物也有不可忽视的缺点，如长期用药后患者可能发生继发性无反应，可能产生强烈副作用，可能增加机会性感染的风险等。因此，寻找新的IBD防治靶点和治疗药物，具有重要意义。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，对N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，AcSDKP)的作用和机制进行了研究，发现AcSDKP可在肠道中发挥抗炎作用，能够减轻肠道炎症，减缓疾病发展。
本发明提供了一种活性成分的用途，其特征在于：
所述活性成分选自一种内源性四肽化合物、或其类似物或衍生物；
所述内源性四肽化合物为N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)；
所述活性成分用于制备治疗、预防或缓解肠道炎症的药物。
上述活性成分为有效量的用量标准，一般来说根据药物的制剂形式可在常规配方量上进行调整。如：占总制剂用量的10-8-100％。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：所述药物为经胃肠道给药剂型或经胃肠道以外给药途径剂型。
上述经胃肠道给药剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂；
上述经胃肠道以外给药途径剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：所述活性成分还用于抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞炎性因子的表达。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：所述活性成分还用于抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞p-ERK和p-MEK表达，同时，不影响TNF-α诱导的Caco-2细胞的p-JNK、p-p38、p-p65和p-IKKα/β的表达。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：所述活性成分还用于减轻结肠组织损伤、炎性细胞浸润、炎性因子表达、MEK-ERK通路激活及胶原蛋白沉积。
即、该活性成分可用于制备减轻结肠组织损伤、炎性细胞浸润、炎性因子表达、MEK-ERK通路激活及胶原蛋白沉积的药物中去。
上述活性成分为有效量的用量标准，一般来说根据药物的制剂形式可在常规配方量上进行调整。如：占总制剂用量的10-8-100％。
进一步地，本发明提供的一种活性成分的用途，其特征还在于：所述活性成分还用于减轻结肠内中性粒细胞和巨噬细胞浸润。
即、该活性成分可用于制备减轻结肠内中性粒细胞和巨噬细胞浸润的药物中去。
上述活性成分为有效量的用量标准，一般来说根据药物的制剂形式可在常规配方量上进行调整。如：占总制剂用量的10-8-100％。
另外，本发明还提供了一种防止如权利要求上述活性成分被血清中ACE降解的方法，其特征在于：在使用活性成分处理前，将培养基换成不含血清的新的培养基；
另外，本发明还提供了一种防止如权利要求上述活性成分被血清中ACE降解的方法，其特征在于：通过微型胶囊泵输出活性成分。
另外，本发明还提供了一种溃疡性结肠炎动物模型，其特征在于：其包含用经修饰的，经DSS诱导的溃疡性结肠炎感染的啮齿类动物。
进一步地，本发明提供的一种溃疡性结肠炎动物模型，其特征还在于：所述啮齿类动物包含敲除PREP基因的啮齿类动物。
本发明的作用和效果：
AcSDKP是一种内源性四肽化合物，广泛分布于哺乳动物组织和体液内，是一种安全的内源性小分子物质，在人体和动物体内均无毒性，其中，在脾脏、胸腺等淋巴组织和睾丸中含量较高。研究认为，AcSDKP主要由其前体胸腺素β4(Tβ4)经金属蛋白酶meprin-α和脯氨酰内肽酶(PREP)逐级水解产生，经血管紧张素转化酶(ACE)介导降解。过去20年来，大量涉及心脏、肾脏疾病和脑损伤的研究发现，AcSDKP可以通过抑制炎症反应、抗纤维化、促进血管生成等作用减轻终末器官损伤。临床研究显示，低水平的AcSDKP可能是一种反映心包炎症和肾脏功能的潜在标志物。但是，目前尚未见AcSDKP与消化系统疾病关系的报道，AcSDKP在胃肠道中的生理或病理作用仍不明确。
通过本发明的研究发现，AcSDKP在肠道中发挥抗炎作用，能够减轻IBD模型小鼠的肠道炎症，减缓疾病发展，这一作用与其对MEK-ERK通路的抑制紧密相关。
附图说明
图1A、Caco-2细胞炎症因子和趋化因子的表达情况。
图1B、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK在Caco-2细胞中的蛋白水平表达。
图2A、各组别的AcSDKP水平；
图2B、各组别的体重变化；
图2C、各组别的动态DAI评分；
图2D、各组别的结肠长度；
图2E、各组别的HE图。
图3A、反映各组别结肠内中性粒细胞浸润的IHC图；
图3B、反映各组别结肠内巨噬细胞浸润的IHC图。
图4A、各组别结肠内炎症因子的mRNA水平；
图4B、各组别结肠内MEK-ERK通路的激活程度；
图4C、各组别结肠内胶原蛋白含量。
图5A、各组别的AcSDKP水平；
图5B、各组别的体重变化；
图5C、各组别的动态DAI评分；
图5D、各组别的结肠长度；
图5E、各组别的HE图。
图6A、反映各组别结肠内中性粒细胞浸润的IHC图；
图6B、反映各组别结肠内巨噬细胞浸润的IHC图。
图7A、各组别结肠内炎症因子的mRNA水平；
图7B、各组别结肠内MEK-ERK通路的激活程度；
图7C、各组别结肠内胶原蛋白含量。
图8A、UC患者肠道组织中Tβ4的表达；
图8B、UC患者肠道组织中meprin-α的表达；
图8C、UC患者肠道黏膜中ACE的表达。
具体实施方式
1.细胞学实验方案
(1)AcSDKP(实验所用AcSDKP来源：购于瑞士Bachem公司，货号：H-1156.0005)对肠上皮细胞炎性损伤的影响：以TNF-α诱导Caco-2建立肠上皮细胞损伤模型，实验分为正常对照组、TNF-α组、TNF-α加不同浓度的AcSDKP(1nM、10nM、100nM、1uM)处理组。为防止AcSDKP被血清中ACE降解，在AcSDKP处理前将各组培养基均换成含1％非必需氨基酸、不含血清的新的培养基。通过qRT-PCR方法检测炎症因子和趋化因子的表达情况。
如图1A所示，AcSDKP抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞炎性因子的表达(MCP-1、IL-8、TNF-α和IL-6)，并且此抑制效应在一定范围内具有浓度依赖性。
(2)AcSDKP对肠上皮细胞炎症相关信号通路的作用：利用TNF-α诱导Caco-2细胞(5min-1h)，以激活NF-κB和MAPK通路，给予100nM的AcSDKP干预(同样，在AcSDKP处理前将各组培养基均换成含1％非必需氨基酸、不含血清的新的培养基)，通过Westernblot方法检测MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK、p65、p-p65、IKKα/β及p-IKKα/β的蛋白表达变化。
如图1B所示，AcSDKP抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞p-ERK和p-MEK表达，但是不影响p-JNK和p-p38的表达。
2.动物模型实验方案
(1)DSS诱导的溃疡性结肠炎模型的建立、分组及处理：以C57BL/6雄性小鼠为研究对象，第一部分分组(每组n＝8-10)如下：①WT小鼠对照组、②PREP-/-小鼠对照组、③WT小鼠+DSS组、④PREP-/-小鼠+DSS组。DSS组小鼠给予2.5％DSS水喂养7天诱导实验性结肠炎，对照组小鼠则每天给予正常饮用水。造模期间密切观察小鼠的一般情况、体重、粪便性状和血便等，以动态评估疾病活动指数(DAI)。
其中，野生型小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。PREP-/-小鼠购自上海南方模式生物科技公司。
(2)以C57BL/6雌性小鼠为研究对象，第二部分实验分组(每组n＝8～10)如下：①WT小鼠对照组、②WT小鼠+AcSDKP组、③WT小鼠+DSS组、④WT小鼠+DSS+生理盐水组、⑤WT小鼠+DSS+AcSDKP组。第①②组小鼠每天给予正常饮用水，第③④⑤组小鼠给予3％DSS水喂养7天。于DSS诱导前两天，在第②⑤组小鼠腹腔内植入灌注了AcSDKP溶液的微型胶囊泵(美国健康医疗仪器国际公司，ALZET胶囊渗透压泵，型号1002，剂量：1600μg/kg/day)，同时在第④组小鼠腹腔内植入灌注了生理盐水的微型胶囊泵。造模期间密切观察小鼠的一般情况、体重、粪便性状和血便等，以动态评估疾病活动指数(DAI)。
(3)在第8天处死小鼠，留取小鼠全结直肠组织和血浆标本。观察结直肠组织大体形态并测量结肠长度；取末端结肠组织进行甲醛固定、石蜡包埋、切片及HE染色，根据隐窝消失和炎性细胞浸润程度以及结肠受累范围进行病理组织学评分。
(4)选取各组小鼠相同部位的结肠组织并称重，以每50mg加500ul裂解缓冲液(RIPA加1mmol/L的PMSF和10-5mol/L的卡托普利)，制备匀浆后离心取上清，通过ELISA法检测AcSDKP的含量。
(5)通过qRT-PCR方法检测结肠中TNFα、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达变化，通过免疫组化方法检测中性粒细胞和巨噬细胞浸润程度，通过Western blot检测MEK、p-MEK、ERK、p-ERK的表达水平。
(6)通过IHC检测结肠组织中Collagen I和Collagen III的表达。
实验结果1：如图2A-2E所示，PREP基因敲除显著下调了小鼠结肠内的AcSDKP水平。与野生型小鼠相比，DSS诱导的PREP-/-小鼠发生更为严重的结肠炎，表现为体重下降更显著，DAI评分更高，结肠缩短及组织结构破坏更明显。HE图片放大倍数：100倍。
如图3A、3B和图4A-4C所示，DSS诱导的PREP-/-小鼠结肠炎性细胞浸润更多(包括Ly6G+中性粒细胞和F4/80+巨噬细胞)，炎症因子表达水平更高，MEK-ERK通路激活程度更高，胶原蛋白含量更丰富。IHC图片放大倍数：200倍。
实验结果2：如图5A-5E所示，外源性AcSDKP持续输注显著提高了结肠内AcSDKP含量。在DSS诱导的野生型小鼠中，AcSDKP干预有效减轻了小鼠的结肠炎症状，包括体重下降、结肠缩短及DAI评分上升，并且减轻了小鼠结肠组织的损伤。HE图片放大倍数：100倍。
如图6A、6B和图7A-7C所示，AcSDKP干预减轻DSS诱导小鼠结肠内中性粒细胞和巨噬细胞浸润；AcSDKP干预减轻了DSS诱发的小鼠结肠炎性因子表达、MEK-ERK通路激活及胶原蛋白沉积。IHC图片放大倍数：200倍。
3.IBD患者实验方案
收集活动期UC患者炎症肠粘膜组织与邻近正常黏膜，提取肠粘膜组织总RNA，通过qRT-PCR方法检测Tβ4、meprin-α、ACE的表达水平；收集IBD手术患者的肠道组织标本(正常和炎症)，通过IHC方法检测Tβ4、meprin-α的表达。
实验结果：如图8A-8C所示，与正常黏膜相比，IBD患者肠道炎症部位黏膜中Tβ4、meprin-α的表达水平降低，ACE的表达无显著差异，提示IBD患者肠道炎症部位的AcSDKP水平可能发生下调。IHC图片放大倍数：400倍。
由此，根据上述实验结果可以认为，AcSDKP能在肠道中发挥抗炎作用，能够减轻IBD患者的肠道炎症，减缓疾病的发展。

Claims (2)

1.一种活性成分的用途，其特征在于：
所述活性成分选自一种内源性四肽化合物；
所述内源性四肽化合物为N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)；
所述活性成分，作为唯一有效成分，用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
2.如权利要求1所述的一种活性成分的用途，其特征在于：
所述药物为经胃肠道给药剂型。
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