CN114487224A - 一种果蔬中酸性农药的检测方法 - Google Patents

一种果蔬中酸性农药的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种果蔬中酸性农药的检测方法。本发明采用甲酸‑乙腈混合溶剂作为提取剂，采用硫酸镁和氯化钠作为脱水盐析，通过分散固相萃取‑高效相色谱‑串联质谱对果蔬中的12种酸性农药残留进行定性和定量检测分析，能够弥补目前针对部分酸性农药检测技术的缺失，本发明提供的分析检测方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可满足国内外相关法律规范的要求，适合于果蔬中酸性农药残留的定性定量分析。

Description

一种果蔬中酸性农药的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种果蔬中酸性农药的检测方法。
背景技术
近年来，酸性农药作为除草剂、杀菌剂和杀虫剂在果蔬中的使用日益增多，因其使用范围广泛，残留期较长，不仅造成环境污染也给消费者带来安全隐患。酸性农药中的二氯吡啶酸在环境中转化形成的中间体比母体展现出更高的毒性，欧洲食品安全局研究表明氯氨吡啶酸对动物具有神经毒性(级别2或3)。目前，许多国家都针对此类农药制定了最高残留限量标准(MRLs)，2021年我国新制定的GB2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》与2019年相比也新增加了消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氯酞酸等酸性农药的残留限量标准，但尚未形成与之配套的检测技术标准。
发明内容
本发明的目的在于提供一种果蔬中酸性农药的检测方法，采用本发明提供的方法能够快速、准确的实现待测样品中二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸12种酸性农药的同时定性与定量检测，灵敏度高和精确度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种果蔬中酸性农药的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品、甲酸-乙腈混合溶剂、硫酸镁和氯化钠混合，进行提取分离，得到提取液；
将所述提取液进行分散固相萃取，得到待测样品液；
采用高效液相色谱-串联质谱法检测所述待测样品液中的酸性农药；
所述酸性农药包括二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸中的一种或几种；
所述高效液相色谱-串联质谱法包括高效液相色谱检测和质谱检测；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈，所述流动相B为水；洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：0～3.0min，所述流动相A的体积分数为25％； 3.0～7.0min，所述流动相A的体积分数由25％匀速增加到95％；7.0～12.0min，所述流动相A的体积分数为95％；12.0～12.5min，所述流动相A的体积分数由95％匀速降低至25％；12.5～15.0min，所述流动相A的体积分数为25％；
所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250～300℃；加热模块温度为400～450℃。
优选的，所述高效液相色谱检测的色谱柱为waters HSS T3色谱柱；柱温为40℃；进样量为2μL.所述流动相体系的流速为0.2～0.3mL/min。
优选的，所述甲酸-乙腈混合溶剂中甲酸的体积分数为0.2％。
优选的，所述待测样品的质量和甲酸-乙腈混合溶剂的体积之比为1g： 1～2mL。
优选的，所述待测样品、硫酸镁和氯化钠的质量比为1：0.4～0.6：0.1～0.2。
优选的，所述提取分离包括依次进行混合、涡旋振荡和离心分离。
优选的，所述混合的温度为4～10℃，时间为3～5min；
所述涡旋振荡的温度为15～25℃，时间为3～5min；
所述离心分离的温度为4～10℃，速度为8000～10000r/min，时间为 5～10min。
优选的，分散固相萃取用分散固相材料包括十八烷基键合硅胶；
所述提取液的体积与分散固相材料的质量之比为1mL：15～20mg；
优选的，所述分散固相萃取为涡旋振荡分散固相萃取，所述分散固相萃取的温度为15～25℃，时间为3～5min。
本发明提供了一种果蔬中酸性农药的检测方法，包括以下步骤：将待测样品、甲酸-乙腈混合溶剂、硫酸镁和氯化钠混合，进行提取分离，得到提取液；将所述提取液进行分散固相萃取，得到待测样品液；采用高效液相色谱-串联质谱法检测所述待测样品液中的酸性农药；所述酸性农药包括二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸中的一种或几种；
所述高效液相色谱-串联质谱法包括高效液相色谱检测和质谱检测；所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈，所述流动相B为水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序优选为：0～3.0min，所述流动相A的体积分数为25％；3.0～7.0min，所述流动相A的体积分数由25％匀速增加到95％；7.0～12.0min，所述流动相A的体积分数为95％；12.0～12.5min，所述流动相A的体积分数由95％匀速降低至25％；12.5～15.0min，所述流动相A的体积分数为25％；
所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250℃；加热模块温度为400℃。
样品前处理是酸性农药分析过程中的关键环节，酸性农药因多含羧基基团，且不同酸性农药极性与常规农药相差较大，在普通农药提取中常使用 PSA作为吸附剂，易对目标农药造成吸附，常规的农药的前处理方式不适用于酸性农药，在实际样品分析中酸性农药回收率较低。而本发明采用甲酸- 乙腈混合溶剂作为提取剂，采用硫酸镁和氯化钠作为脱水盐析，通过分散固相萃取进行净化，采用的前处理方式简单快速、净化效果好、灵敏度高、重复性好，可满足国内外相关法律规范的要求，适合于果蔬中农药残留的定性定量分析。而且，本发明采用的高效相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)条件能够在15min内分析12种酸性农药，弥补了酸性农药检测目标物单一，部分目标物无相应检测方法的空白。本发明提供的检测方法检测限低，检测准确度高，对于果蔬中酸性农药的方法定量限可达到0.005～0.01mg/kg。
基质效应是与目标物共同洗脱并干扰质谱仪电离过程的基质物质引起的，增强或抑制目标物的检测信号，可影响仪器的灵敏度和分析结果的准确性。本发明采用空白基质提取液配制混合工作液并绘制相应标准曲线对相应样品中12种酸性农药进行检测分析，配制的标准曲线与实际样品中农药目标物的基质增强或抑制效应结果一致，可较好的抑制基质效应，可提高定量准确性。
附图说明
图1为12中农药的总离子流图；
图2为实施例3中不同提取溶剂对芹菜中12种农药提取回收率的影响；
图3为实施例4中不同分散固相萃取吸附剂对12种农药提取回收率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种果蔬中酸性农药的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品、甲酸-乙腈混合溶剂、硫酸镁和氯化钠混合，进行提取分离，得到提取液；
将所述提取液进行分散固相萃取，得到待测样品液；
采用高效液相色谱-串联质谱法检测所述待测样品液中的酸性农药；
所述酸性农药包括二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸中的一种或几种；
所述高效液相色谱-串联质谱法包括高效液相色谱检测和质谱检测；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈，所述流动相B为水；洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：0～3.0min，所述流动相A的体积分数为25％； 3.0～7.0min，所述流动相A的体积分数由25％匀速增加到95％；7.0～12.0min，所述流动相A的体积分数为95％；12.0～12.5min，所述流动相A的体积分数由95％匀速降低至25％；12.5～15.0min，所述流动相A的体积分数为25％；
所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250～300℃；加热模块温度为400～450℃。
在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。
本发明将待测样品、甲酸-乙腈混合溶剂、硫酸镁和氯化钠混合，进行提取分离，得到提取液。
在本发明中，所述甲酸-乙腈混合溶剂中甲酸的体积分数优选为0.2％。在本发明中，所述待测样品的质量和甲酸-乙腈混合溶剂的体积之比优选为 1g：1～2mL，更优选为1g：1～1.5mL。在本发明中，所述待测样品、硫酸镁和氯化钠的质量比优选为1：0.4～0.6：0.1～0.2，更优选为1：0.4～0.5：0.1～0.15，进一步优选为1:0.4:0.1。
本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的混方式能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。
在本发明中，所述提取分离优选包括依次进行混合、涡旋振荡和离心分离。在本发明中，所述混合的温度优选为4～10℃，更优选为5～8℃；所述混合的时间优选为3～5min，更优选为3～4min；所述混合优选为摇荡混合。在本发明中，所述涡旋振荡的温度优选为15～25℃，更优选为20～25℃；所述涡旋振荡的时间优选为3～5min，更优选为3～4min。在本发明中，所述离心分离的温度优选为4～10℃，更优选为5～8℃；所述离心分离的速度优选为 8000～10000r/min，更优选为9000～10000r/min；所述离心分离的时间优选为 5～10min，更优选为6～8min；所述离心分离得到的上清液即为提取液。
得到提取液后，本发明将所述提取液进行分散固相萃取，得到待测样品液。
在本发明中，分散固相萃取用分散固相材料优选包括十八烷基键合硅胶 (C18)。在本发明中，所述提取液的体积与分散固相材料的质量之比优选为1mL：15～20mg，更优选为1mL：16～18mg。
在本发明中，所述分散固相萃取的方式优选为涡旋振荡分散固相萃取，所述分散固相萃取的温度优选为15～25℃，更优选为20～25℃；所述分散固相萃取的时间优选为3～5min，更优选为3～4min。
所述分散固相萃取后，本发明优选还包括将所述分散固相萃取得到的体系进行离心分离，将得到的上清液过滤，得到待测样品液。在本发明中，所述离心分离的温度优选为4～10℃，更优选为4～8℃；所述离心分离的速度优选为8000～10000r/min，更优选为9000～10000r/min；所述离心分离的时间优选为3～5min，更优选为3～4min。本发明中，所述过滤的滤膜的孔径优选为 0.22μm；在本发明的实施例中优选采用孔径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜。
得到待测样品液后，本发明采用高效液相色谱-串联质谱法检测所述待测样品液中的酸性农药；
所述酸性农药包括二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸中的一种或几种；
在本发明中，所述高效液相色谱-串联质谱法包括高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件；所述高效液相色谱-串联质谱法检测优选利用高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪进行。
在本发明中，所述液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为水，所述水为超纯水；所述流动相体系的流速为0.2～0.3mL/min，优选为0.2～0.25mL/min；洗脱方式为梯度洗脱。
在本发明中，所述梯度洗脱的程序如表1所示：
表1梯度洗脱的程序
Figure BDA0003479287490000061
即，0～3.0min，所述流动相A的体积分数为25％；3.0～7.0min，所述流动相A的体积分数由25％匀速增加到95％；7.0～12.0min，所述流动相A的体积分数为95％；12.0～12.5min，所述流动相A的体积分数由95％匀速降低至25％；12.5～15.0min，所述流动相A的体积分数为25％。在本发明中，所述液相色谱检测的色谱柱优选为waters HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；柱温优选为40℃；进样量优选为2μL。
在本发明中，所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源(SEI)；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250～300℃，优选为250～280℃；加热模块温度为 400～450℃，优选为400～420℃。
在本发明中，氯丙嘧啶酸和申嗪霉素在ESI正模式下获得较高响应的 [M+H]+峰，其余10种酸性农药化合物均在ESI负模式下获得较高丰度的 [M-H]-峰。每种化合物均选择2个主要特征碎片离子作为定性与定量离子，通过优化碰撞电压等参数，使特征碎片离子强度达到最大，经优化的质谱条件如表2所示。
表2 12种酸性农药的质谱参数
Figure BDA0003479287490000071
Figure BDA0003479287490000081
其中，*代表定量离子。
在本发明中，所述高效液相色谱-串联质谱对所述待测样品液进行检测优选包括定性检测和定量检测。
在本发明中，所述定性检测的步骤优选包括：
将所述待测样品液和混合标准工作溶液按照高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行测定，记录待测样品液和混合标准工作溶液中酸性农药的色谱保留时间，当待测样品液中检出与某标准工作溶液中的酸性农药标准品保留时间一致的色谱峰(变化范围在±2.5％之内)，并且待测样品液色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比(k)的偏差不超过表3规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差
Figure BDA0003479287490000082
在本发明中，所述混合标准工作溶液的配制方法优选包括：
配制1mg/mL酸性农药的标准储备液；
配制10μg/mL酸性农药的标准混合储备溶液；
配制酸性农药的混合标准工作溶液。
在本发明中，所述标准储备液的配置具体为：分别精密称的酸性农药标准品各10.0mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解并稀释定容至10mL，摇匀，得到浓度为1mg/mL的酸性农药的标准储备液，-18℃保存，有效期3个月。
在本发明中，所述酸性农药标准品为二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸标准品。本发明中，所述酸性农药标准品的具体规格优选详见表4，所述酸性农药的纯度优选≥95％。
表4酸性农药标准品的具体规格
Figure BDA0003479287490000091
在本发明中，所述标准混合储备溶液的配制方法，优选包括：
分别准确吸取标准储备液各1.0mL，用甲醇稀释定容至100mL，摇匀，制成10μg/mL的标准混合储备溶液。在本发明中，所述的标准混合储备溶液优选现用现配。
在本发明中，混合标准工作溶液的配制方法，优选包括：
提供空白基质提取液；
分别准确吸取标准混合储备溶液，用所述空白基质提取液稀释定容，摇匀，作为混合标准工作溶液，得到浓度为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、 5μg/L的混合标准工作溶液。
在本发明中，所述空白基质提取液是指不含有上述酸性农药的待测样品液；以空白果蔬基质作为原料按照前述待测样品液的制备方法进行制备，在此不再赘述。在本发明的具体实施例中，所述空白基质提取液的制备方法优选包括以下步骤：将空白果蔬基质匀浆均质，得到空白果蔬基质均质浆；将 10g空白果蔬基质均质浆置于50mL离心管中，加入10mL 0.2％(v/v)甲酸 -乙腈溶液、4g无水MgSO4和1gNaCl，将离心管置于恒温振荡器中振荡3min，涡旋振荡3min后，使用离心机在4℃下10000r/min离心5min，取1mL上清液加入装有20.0mg C18固相萃取吸附剂的离心管中，充分涡旋振荡3min，以10000r/min离心3min后取上层清液过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，得到空白基质提取液。
本发明中对吸取标准混合储备溶液的体积以及利用空白基质提取液稀释定容的最终体积没有特殊要求，以最终能够得到相应浓度的混合标准工作溶液为准。本发明中，所述混合标准工作溶液优选现用现配。
本发明中，所述定量检测优选包括标准曲线的制作、待测样品液中酸性农药的测定。
在本发明中，所述标准曲线的制备方法，优选包括以下步骤：
将所述混合标准工作溶液按照高效液相色谱-串联质谱的检测条件进行检测，得到酸性农药的色谱峰面积，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，酸性农药定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
在本发明中，所述酸性农药的标准曲线回归方程如表5所示：
表5酸性农药的标准曲线回归方程
Figure BDA0003479287490000101
本发明中，所述待测样品液中的酸性农药的测定，优选包括以下步骤：
将待测样品液按高效液相色谱-串联质谱的检测条件进行检测，得到待测样品液中酸性农药的色谱峰面积；
根据所述酸性农药的色谱峰面积和标准曲线回归方程得到待测液中组分的浓度。
本发明中所述待测样品液的测定次数优选≥5次。
本发明中，所得计算结果优选以重复性条件下获得的5次独立测定结果的算术平均值表示。本发明中，所述重复性条件下获得的5次独立测定结果的绝对差值优选不得超过算术平均值的20％。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)配制1mg/mL酸性农药的标准储备液：分别精密称的酸性农药标准品各10.0mg(精确至0.01mg)，用甲醇溶解并稀释定容至10mL，摇匀，得到浓度为1mg/mL的酸性农药的标准储备液，-18℃保存；所述酸性农药标准品为二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸标准品。
(2)配制10μg/mL酸性农药的标准混合储备溶液：分别准确吸取标准储备液各1.0mL，用甲醇稀释定容至100mL，摇匀，制成10μg/mL的标准混合储备溶液。
(3)配制空白基质提取液：将空白蔬菜基质匀浆均质，得到空白蔬菜基质均质浆；将10g空白蔬菜基质均质浆置于50mL离心管中，加入10mL 0.2％(v/v)甲酸-乙腈溶液、4g无水MgSO4和1gNaCl，将离心管置于恒温振荡器中振荡3min，涡旋振荡3min后，使用离心机在4℃下10000r/min离心5min，取1mL上清液加入装有20.0mg C18固相萃取吸附剂的离心管中，充分涡旋振荡3min，以10000r/min离心3min后取上层清液过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，得到空白基质提取液。
(4)配制酸性农药的混合标准工作溶液：分别准确吸取标准混合储备溶液，用所述空白基质提取液稀释定容，摇匀，作为混合标准工作溶液，得到浓度为100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L的混合标准工作溶液。
将混合标准工作溶液进行高效液相色谱-串联质谱检测，得到酸性农药的色谱峰面积，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，酸性农药定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程，如表5 所示。
其中，液相色谱检测的条件：色谱柱为waters HSS T3色谱柱(2.1 mm×100mm，1.8μm)，柱温为40℃，流动相体系为流动相A和流动相B，流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，流速为0.2mL/min；进样量为2μL；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如表1所示。
质谱检测的条件：离子源为电喷雾离子源(SEI)；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250℃；加热模块温度为400℃。氯丙嘧啶酸和申嗪霉素在ESI正模式下获得较高响应的[M+H]+峰，其余10种酸性农药化合物均在ESI负模式下获得较高丰度的[M-H]-峰。每种化合物均选择2个主要特征碎片离子作为定性与定量离子，通过优化碰撞电压等参数，使特征碎片离子强度达到最大，经优化的质谱条件如表2所示。
图1为12中农药的总离子流图，由图1可知，在上述检测条件下12种酸性农药峰形及分离度良好，响应值比在采用甲醇作为流动相时高1.1～3.5 倍。
实施例2
新鲜蔬菜(番茄、土豆和芹菜)中12中酸性农药的检测
(1)样品前处理
(1.1)称样：准确称取10g粉碎均质的新鲜蔬菜加入到50mL离心管中；
(1.2)提取：向离心管内加入10mL 0.2％(v/v)甲酸-乙腈混溶剂、4g 无水MgSO4和1gNaCl，将离心管放入到20℃恒温振荡器中振荡3min，涡旋振荡3min，使用离心机在4℃、10000r/min条件下离心5min，上清液为提取液；
(1.3)净化：取1mL提取液加入装有20mg C18的离心管中，涡旋振荡 3min，在4℃、10000r/min条件下离心3min，取上层清液过0.22μm聚四氟乙烯滤膜，得到待测样品液；
(2)采用实施例1的UPLC-MS/MS检测条件检测待测样品液中酸性农药的含量。
(3)基质效应
通过比较基质与溶剂标准曲线斜率来确定12种酸性农药在番茄、土豆和芹菜基质中的基质效应。
基质效应计算式：ME(％)＝斜率基质/斜率溶剂-1；
其中，|ME|≤10％时，基质效应可忽略不计；
|ME|在10～20％之间时，存在较弱的基质效应；
20％＜|ME|＜50％时，基质效应中等；
当|ME|＞50％时，存在强基质效应。
12种酸性农药在不同蔬菜基质中的基质效应如表6所示：
表6 12种酸性农药在不同蔬菜基质中的基质效应
Figure BDA0003479287490000131
Figure BDA0003479287490000141
由表6可知，本发明提供的检测方法的溶剂和基质标样曲线线性良好，相关系数均大于0.99。其中，除草芽畏呈现强基质增强效应外，其它目标物均呈现不同程度的基质抑制效应。因此为降低基质效应，用空白样品提取液配制基质匹配标准曲线进行定量分析。
(4)线性范围和检出限
在0.002～0.4mg/kg质量浓度范围内配制12中酸性农药的混合标准溶液，以浓度为横坐标和定量离子对峰面积为纵坐标绘制标准曲线，根据10倍信噪比(S/N)确定化合物的方法定量限，结果如表7所示。其中二氯吡啶酸、草芽畏和氯丙嘧啶酸的定量限为0.01mg/kg，其它农药定量限均为0.005 mg/kg，所得的相关系数均大于0.99，能够满足现有国际限量的要求。
(5)方法回收率和精密度
方法回收率和精密度实验通过阴性样品添加回收实验(n＝5)进行考察，采用番茄、土豆和芹菜作为阴性样品。12种酸性农药根据国标限量要求各进行3个浓度水平的添加回收实验，每个浓度水平进行5次重复，平均回收率及相对标准偏差结果如表7所示。12种酸性农药在三种蔬菜基质中的平均回收率为71.89％～117.79％，相对标准偏差(RSD))为3.4～10.8％，准确度、精密度均符合农药残留试验准则，表明，本发明提供的检测方法对于12种酸性农药在蔬菜基质中的分析检测方法是可行的。
表7不同蔬菜基质中12种酸性农药的平均回收率、定量限及相对标准偏差
Figure BDA0003479287490000142
Figure BDA0003479287490000151
Figure BDA0003479287490000161
从表7可以看出：本发明提供的检测方法同时可以实现对不同基质、不同浓度12种酸性农药的进行准确测试。
实施例3
提取溶剂的影响
酸性农药在甲醇和乙腈等有机溶剂中溶解度较好，因蔬菜中色素及有机酸等极性物质较多，因此为降低基质干扰，多采用乙腈作为提取剂。分别以乙腈、甲酸-乙腈混合溶剂(0.1/99.9，V/V)和甲酸-乙腈混合溶剂(0.2/99.8， V/V)作为提取剂，通过加标回收法，在空白芹菜基质中加入12中酸性农药标准溶液，按照实施例2步骤(1)～(2)进行样品前处理及检测，不同提取剂对12种酸性农药的提取效果的影响图2和表8所示。
表8不同提取剂对12种酸性农药的提取效果的影响
Figure BDA0003479287490000162
Figure BDA0003479287490000171
由图2和表8可知，以乙腈为提取剂时，消螨酚、特乐酚、戊硝酚和毒菌酚回收率最高，为81.67～88.61％，但氯丙嘧啶酸、氨氯吡啶酸和草芽畏的回收率较低，低于40％，这可能与这些农药中含有羧基、羟基等功能团，酸离解常数较低(pKa＜4.50)有关。以甲酸-乙腈混合溶剂(0.1/99.9，V/V)作为提取剂时，12种酸性农药的回收率为57.56～89.33％，而以甲酸-乙腈混合溶剂(0.2/99.8，V/V)作为提取剂时，12种酸性农药的回收率为75.65～96.98％。本发明以甲酸-乙腈混合溶剂(0.2/99.8，V/V)作为提取剂能够提高12种酸性农药的回收率。
实施例4
分散固相萃取吸附剂的影响
分别以PSA、C18、GCB、Z-Sep、Z-Sep+作为分散固相萃取吸附剂，通过加标回收法，在空白芹菜基质中加入12中酸性农药标准溶液，按照实施例2步骤(1)～(2)进行样品前处理及检测，不同提取剂对12种酸性农药的提取效果的影响图3和表9所示。
表9不同分散固相萃取吸附剂对12种酸性农药的提取效果的影响
Figure BDA0003479287490000172
Figure BDA0003479287490000181
由图3和表9可知，以PSA作为分散固相萃取吸附剂，除毒菌酚外其余11种目标物回收率均低于75％；GCB可去除蔬菜中叶绿素和类胡萝卜素等色素，但因GCB对含苯环结构物质有很强的吸附，因此对特乐酚、戊硝酚、毒菌酚和草芽畏等物质保留很强，该部分目标物回收率低于40％；Z-Sep 和Z-Sep+对氨氯吡啶酸、茅草枯和二氯吡啶酸具有较强的吸附，造成该部分目标物未回收；而C18对所有目标物的平均回收率在73.96～103.50％，均无明显吸附作用，符合农药残留分析要求。本发明以C18作为分散固相萃取吸附剂能够提高12种酸性农药的回收率和净化效果。
实施例5
实际样品检测
按照实施例2步骤(1)～(2)的方法对采自北京农贸市场的番茄、土豆芹菜、苹果和橙子各3个样品中12种酸性农药目标物进行检测，其中仅有氨氯吡啶酸和草芽畏在芹菜样品中被检出，氨氯吡啶酸含量为0.012～0.016 mg/kg，草芽畏含量为0.016～0.026mg/kg。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种果蔬中酸性农药的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品、甲酸-乙腈混合溶剂、硫酸镁和氯化钠混合，进行提取分离，得到提取液；
将所述提取液进行分散固相萃取，得到待测样品液；
采用高效液相色谱-串联质谱法检测所述待测样品液中的酸性农药；
所述酸性农药包括二氯吡啶酸、消螨酚、特乐酚、茅草枯、戊硝酚、草芽畏、毒菌酚、氰尿酸、氯丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、申嗪霉素和氨氯吡啶酸中的一种或几种；
所述高效液相色谱-串联质谱法包括高效液相色谱检测和质谱检测；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈，所述流动相B为水；洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：0～3.0min，所述流动相A的体积分数为25％；3.0～7.0min，所述流动相A的体积分数由25％匀速增加到95％；7.0～12.0min，所述流动相A的体积分数为95％；12.0～12.5min，所述流动相A的体积分数由95％匀速降低至25％；12.5～15.0min，所述流动相A的体积分数为25％；
所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应离子监测；扫描方式为正负离子模式；喷雾电压为4.0kV；雾化气为氮气，流速为3.0L/min；干燥气为氮气，流速为10L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度为250～300℃；加热模块温度为400～450℃。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的色谱柱为waters HSS T3色谱柱；柱温为40℃；进样量为2μL.所述流动相体系的流速为0.2～0.3mL/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲酸-乙腈混合溶剂中甲酸的体积分数为0.2％。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品的质量和甲酸-乙腈混合溶剂的体积之比为1g：1～2mL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品、硫酸镁和氯化钠的质量比为1：0.4～0.6：0.1～0.2。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，所述提取分离包括依次进行混合、涡旋振荡和离心分离。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述混合的温度为4～10℃，时间为3～5min；
所述涡旋振荡的温度为15～25℃，时间为3～5min；
所述离心分离的温度为4～10℃，速度为8000～10000r/min，时间为5～10min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，分散固相萃取用分散固相材料包括十八烷基键合硅胶；
所述提取液的体积与分散固相材料的质量之比为1mL：15～20mg。
9.根据权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于，所述分散固相萃取为涡旋振荡分散固相萃取，所述分散固相萃取的温度为15～25℃，时间为3～5min。
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