CN114480254A - HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用 - Google Patents
HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法,本模型是以将两种人肝细胞在常规条件下培养、分化所得。经过分化后,HepaRG细胞对于化合物的代谢能力提高,敏感度增加。建立的模型可用于多种肝毒性化合物的检测,还可用于对已知肝毒性药物的毒性机制进行探索。经过体外验证后,显示本发明筛选出的肝毒性标志物适用食品污染物的肝毒性评测,其表达量可用于肝毒性等级划分。本发明HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型能在肝毒性药物的安全性评测中进行应用。本发明与传统肝功能指标相比测定结果更加稳定,并经过了动物实验的验证,弥补了以往对于食品污染物肝毒性体外研究的空白。
Description
技术领域
本发明涉及替代毒理学技术领域。更具体地说,本发明涉及食品污染物肝毒性评测用细胞替代模型及其构建方法与其具体在真菌毒素、重金属、稀土元素评测中的应用。
背景技术
肝脏参与多种外来化合物的代谢和清除功能,是重要的代谢器官。外源性的食品污染物经过消化道吸收进入人体后,第一个重要的代谢器官便是肝脏。因此,肝脏是食品污染物毒性作用最重要的靶器官之一,对肝毒性的评价与检测至关重要。
长期以来,动物毒性试验是食品污染物肝毒性研究的主要方法。然而,传统的动物毒性试验要求大量的动物,且实验周期长、花费大,常被认为在伦理学和经济学方面不合理。同时,由于存在种属差异,动物研究结果外推到人的时候需要考虑污染物的代谢、靶标和病理生物学的不同,在预测人体毒性风险时会存在较大的不确定性。因此,近年来的研究将试验对象从动物转至细胞、体外三维培养的组织、离体组织等。体外肝细胞培养模型被认为是最主要和有效的替代体内模型评价肝毒性的方法。
由于具有天然完整的代谢酶家族以及转运蛋白,能够很好的预测人体内物质的代谢情况,并且方法相对快速方便,可信度高,人源性原代肝细胞培养模型(primaryhepatocytes, PHH)被认为是外源性物质代谢和细胞毒性研究的金标准。例如,欧洲替代方法验证中心 (ECVAM)的一项预验证实验显示,在3个独立的实验室的实验中,人源性原代肝细胞均对典型的细胞色素450酶系(CYP450)毒性诱导剂反应灵敏,结果重复性高,表明人源性肝细胞对于污染物的肝毒性是一种良好的评价模型。然而,由于人源性原代肝细胞来源极其有限,且生存周期较短,因此更适合短期的研究应用,不适合大规模的推广。相比较而言,人肝癌细胞系则拥有更长的生存期,细胞稳定性好,且拥有几乎和人源性原代肝细胞相同的代谢酶家族及转运蛋白,易获取也易大规模培养,更适合于大规模推广的体外肝毒性替代模型。
目前,国内外研究多利用人肝癌细胞系建立肝毒性体外替代模型,并研究各个指标作为检测终点时模型的诊断效能。其中,通过MTT、CCK-8法检测细胞活力,传统肝功能指标ALT、AST及氧化应激指标GSH、SOD、MDA等检测指标仍是体外肝毒性替代模型的经典指标。尽管上述生物标志物已应用于临床,然而国内外其他研究多只使用了传统肝功能指标ALT、AST及氧化应激指标GSH、SOD、MDA等指标的变化来说明肝毒性的强弱,但在多研究之间比较发现,不同毒性干预物和不同的毒理学方法检测较难检测到同样的指标变化,不能作为稳定的肝毒性标志物,因此有待进一步研究。
由此可知,目前缺乏适用于食品污染物的体外肝毒性测试模型,同时缺乏干预后能同时进行改变的标志物及其对靶标的动物实验验证。
发明内容
本发明的一个目的是提供HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用,通过广靶蛋白组学,筛选出新的肝毒性标志物,与传统肝功能指标相比,测定结果更加稳定,并经过了动物实验的验证,弥补了以往对于食品污染物肝毒性体外研究的空白。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型,以HepaRG细胞与HepG2细胞建立一个用于食品污染物肝毒性评测的体外肝毒性替代模型。
本发明还提供了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,具体包括如下步骤:
1)细胞培养:将HepaRG细胞和HepG2细胞分别进行细胞培养;其中,HepaRG细胞培养选择William's E细胞培养基,其含有2-20%胎牛血清;HepG2细胞培养选择含4.5g/L 葡萄糖的DMEM高糖细胞培养基,其含有2-20%胎牛血清;
2)细胞诱导:将HepaRG细胞接种于细胞培养皿内培养,将设定数量的HepaRG细胞以完全培养基贴壁生长3天后,更换为诱导培养基进行诱导培养,得到分化HepaRG细胞;
3)模型构建:将HepG2细胞与经诱导的HepaRG细胞分别接种于预定载体上培养,得到体外肝毒性替代模型。
优选的是,HepaRG细胞和HepG2细胞培养的培养基均含10%胎牛血清。
优选的是,建立的肝毒性评测模型对食品污染物进行评测,具体包括如下评测:
1)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于96孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,进行CCK8实验;
2)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,使用荧光探针二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)对细胞进行染色,在荧光显微镜下进行细胞ROS的含量测定;
3)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)对细胞进行染色,在荧光显微镜下检测细胞的线粒体损伤;
4)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种10cm培养皿内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,超声破碎细胞,检测细胞氧化应激相关酶活力水平和肝功能酶活力水平;
5)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6cm培养皿内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,通过LC-MS进行细胞广靶蛋白组学测定;
6)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,根据组学结果,通过western blot对细胞筛选出的蛋白进行验证。
优选的是,食品污染物包括:真菌毒素、重金属、稀土元素。
优选的是,肝毒性评测模型对食品污染物进行评测后,还包括通过动物实验进行体内验证,具体包括如下步骤:
1)将C57BL/6雄性小鼠分为对照组和多组不同剂量的化合物组,使用真菌毒素、重金属、稀土元素;分别经口染毒一个月;
2)每隔3日对小鼠进行称重,处死小鼠时记录小鼠的肝体比;
3)将染毒后小鼠的肝脏进行HE染色,检测小鼠的肝脏病理形态;
4)收集小鼠血清,进行肝功能酶活力水平的检测;匀浆小鼠肝脏组织进行氧化应激相关酶活力水平的检测;
5)提取小鼠线粒体,通过JC-1荧光探针对小鼠线粒体进行染色,在荧光显微镜下检测线粒体损伤。
6)收集小鼠肝脏组织,制作肝脏冰冻切片,使用ROS活性氧检测试剂盒进行免疫染色,荧光显微镜下拍照。
7)选取重金属;染毒后的小鼠肝脏,通过LC-MS进行广靶蛋白组学测定。
优选的是,肝毒性评测模型对食品污染物的评测具体包括以下步骤:
1)细胞进行常规处理消化后,制成单细胞悬液后需进行细胞计数,需根据所需实验目的用培养基将细胞悬液稀释至不同的浓度范围;
2)称取DON、Hgcl2、La(NO3)3受试物,选择高压后的超纯水作为水溶性受试物Hgcl2和La(NO3)3的溶剂,选取二甲基亚砜DMSO作为难溶于水受试物DON的溶剂;配置三种受试物的母液浓度为16M、100M、100M;
3)用细胞培养基将三种受试物的母液浓度稀释,稀释至浓度为1M,向96孔细胞板中每孔加入一定量含受试物的培养基,使最终每孔内受试物的含量分别为DON为0-3.2μM,Hgcl2为0-80μM,La(NO3)3为0-4μM;
4)将细胞板置于37℃、5%CO2条件下,进行3、6、24、48小时染毒,染毒完成后加入每孔加入10ul CCK8试剂,得到用于之后实验的最佳干预时间和最佳干预剂量。
优选的是,具体步骤1)中的细胞数量根据培养皿面积的不同而调整,96孔板需稀释细胞至2-5×104个细胞/孔;24孔板需稀释细胞至10-15×104个细胞/孔;6cm培养皿需稀释细胞至2-8×105个细胞/孔;10cm培养皿需稀释细胞至1-3×106个细胞/孔。
优选的是,具体步骤3)中最终每孔内受试物的含量分别为DON为0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2μM,Hgcl2为0,70,72,74,76,78,80μM,La(NO3)3为0,1,1.5,2, 2.5,3,3.5,4μM。
本发明还提供一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型在肝毒性药物的安全性评测中的应用。
本发明至少包括以下有益效果:
1、本发明提供了一种用于食品化合物肝毒性评测的模型及其构建方法。本模型是以将两种人肝细胞在常规条件下培养、分化所得。经过分化后,HepaRG细胞对于化合物的代谢能力提高,敏感度增加。建立的模型可用于多种肝毒性化合物的检测,还可用于对已知肝毒性药物的毒性机制进行探索。经过体外验证后,显示本发明筛选出的肝毒性标志物适用食品污染物的肝毒性评测,其表达量可用于肝毒性等级划分。
2、本发明建立的肝毒性体外替代模型,极大的减少了实验动物的使用,符合“3R”原则。相对于实验动物来说,操作更为简便,试验周期短。本模型所采用的细胞均属人细胞系,避免了使用实验动物所带来的物种差异。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为显微镜下HepaRG细胞分化过程;
图2为HepaRG细胞分化前后分泌的白蛋白分泌量检测结果柱图以及分化后PAS(过碘酸雪夫)染色结果;
图3为HepaRG细胞和HepG2细胞DON处理后不同时间下细胞毒性检测结果曲线;
图4为HepaRG细胞和HepG2细胞Hgcl2处理后不同时间下细胞毒性检测结果曲线;
图5为HepaRG细胞和HepG2细胞La(NO3)3处理后不同时间下细胞毒性检测结果曲线;
图6为Hgcl2干预后小鼠体重变化情况;
图7为DON干预后小鼠体重变化情况;
图8为La(NO3)3干预后小鼠体重变化情况;
图9为食品污染物干预后肝脏HE染色结果;
图10为HepaRG细胞和HepG2细胞DON、Hgcl2、La(NO3)3食品污染物干预后细胞 ROS损伤情况;
图11为HepaRG细胞和HepG2细胞DON、Hgcl2、La(NO3)3食品污染物干预后细胞线粒体膜电位MMP变化情况;
图12为DON、Hgcl2、La(NO3)3食品污染物干预后小鼠肝脏ROS损伤情况;
图13为DON、Hgcl2、La(NO3)3食品污染物干预后小鼠线粒体膜电位MMP变化情况;
图14为HepaRG细胞和HepG2细胞DON、Hgcl2、La(NO3)3食品污染物干预后细胞 GST表达量的变化情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得;在本发明的描述中,术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
本发明的第一个目的是提供一种以HepaRG细胞与HepG2细胞建立一个用于食品污染物肝毒性评测的体外模型并提供具体的构建方法。通过对细胞培养、细胞分化的优化,使得改造后的细胞比现有细胞更加接近人原代细胞的代谢酶系。
具体包括以下步骤:
细胞培养:
将HepaRG细胞和HepG2细胞分别进行细胞培养。HepaRG细胞培养选择William's E细胞培养基,需含有2-20%胎牛血清,优选含10%胎牛血清。HepG2细胞培养选择DMEM 高糖细胞培养基(含4.5g/L葡萄糖),需含有2-20%胎牛血清,优选含10%胎牛血清。使用上述培养基后,两种细胞系均生长良好、边界清晰。
细胞诱导:
HepaRG细胞是一种潜能祖细胞,经诱导可分化为两种不同形态学特征的细胞,一种为准肝细胞样的粒状上皮细胞,一种仍为扁平的胞质透明细胞。融合分化后的HepaRG细胞尿素清除、白蛋白及糖原合成水平逐渐增加,更加接近肝原细胞功能。具体过程需将HepaRG细胞接种于细胞培养皿内进行培养,将一定数量的细胞以完全培养基贴壁生长3 天后,更换为诱导培养基进行诱导培养,得到分化HepaRG细胞。
模型构建:将HepG2细胞与经诱导的HepaRG细胞分别接种于预定载体上培养,得到体外替代模型。
本发明的第二个目的是根据建立的肝毒性评测模型对食品污染物(真菌毒素、重金属、稀土元素)进行评测,筛选出三者通用的毒性标志物并通过动物实验进行体内验证。具体包括以下步骤:
肝毒性模型测试:
1)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于96孔板内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,进行CCK8实验;
2)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,使用荧光探针二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)对细胞进行染色,在荧光显微镜下进行细胞ROS的含量测定。
3)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)对细胞进行染色,在荧光显微镜下检测细胞的线粒体损伤。
4)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种10cm培养皿内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,收集细胞,超声破碎细胞,检测细胞氧化应激相关酶活力水平和肝功能酶活力水平。
5)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6cm培养皿内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,收集细胞,通过LC-MS进行细胞广靶蛋白组学测定。
6)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6孔板内。接种24h后,分别使用三种食品污染物进行染毒,收集细胞,根据组学结果,通过western blot对细胞筛选出的蛋白进行验证。
动物实验验证:
1)将C57BL/6雄性小鼠分为对照组、低剂量化合物组、中剂量化合物组(或中低剂量化合物组、中高剂量化合物组)、高剂量化合物组,使用真菌毒素DON、重金属Hgcl2、稀土元素La(NO3)3分别经口染毒一个月。
2)每隔3日对小鼠进行称重,处死小鼠时记录小鼠的肝体比。
3)将染毒后小鼠的肝脏进行HE染色,检测小鼠的肝脏病理形态。
4)收集小鼠血清,进行肝功能酶活力水平的检测;匀浆小鼠肝脏组织进行氧化应激相关酶活力水平的检测。
5)提取小鼠线粒体,通过JC-1荧光探针对小鼠线粒体进行染色,在荧光显微镜下检测线粒体损伤。
6)收集小鼠肝脏组织,制作肝脏冰冻切片,使用ROS活性氧检测试剂盒进行免疫染色,荧光显微镜下拍照。
7)选取重金属Hgcl2染毒后的小鼠肝脏,通过LC-MS进行广靶蛋白组学测定。
更具体的,以上模型对食品污染物(真菌毒素、重金属、稀土元素)的评测包括以下步骤:
1)细胞进行常规处理消化后,制成单细胞悬液后需进行细胞计数,需根据所需实验目的用培养基将细胞悬液稀释至不同的浓度范围。
2)称取SigmaTMDON、Hgcl2、La(NO3)3受试物,选择高压后的超纯水作为水溶性受试物(Hgcl2、La(NO3)3)的溶剂,选取二甲基亚砜(DMSO)作为难溶于水受试物(DON) 的溶剂。配置三种受试物的母液浓度为16M、100M、100M。
3)用细胞培养基将三种受试物的母液浓度稀释,稀释至浓度为1M,向96孔细胞板(购自Corning)中每孔加入一定量含受试物的培养基,使最终每孔内受试物的含量分别为DON (0-3.2μM),Hgcl2(0-80μM),La(NO3)3(0-4μM)。
4)将细胞板置于37℃、5%CO2条件下,进行3、6、24、48小时染毒,染毒完成后加入每孔加入10ul CCK8试剂,得到用于之后实验的最佳干预时间和最佳干预剂量。
所述具体步骤1)中的细胞数量可根据培养皿面积的不同而调整,96孔板需稀释细胞至2-5×104个细胞/孔;24孔板需稀释细胞至10-15×104个细胞/孔;6cm培养皿需稀释细胞至2-8×105个细胞/孔;10cm培养皿需稀释细胞至1-3×106个细胞/孔。
所述具体步骤3)中最终每孔内受试物的含量分别为DON(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6, 3.2μM),Hgcl2(0,70,72,74,76,78,80μM),La(NO3)3(0,1,1.5,2,2.5,3,3.5, 4μM)
体外肝毒性替代模型在其他肝毒性药物的安全性评测中的应用也属于本发明。
实施例1
一种体外替代肝毒性替代模型的建立,包括以下步骤:
1.细胞模型建立
一、细胞培养
将HepaRG细胞(来源:ATCC,由上海冠导生物工程有限公司代购)和HepG2细胞(来源:ATCC,由北京中原合聚经贸有限公司代购)分别以William's E细胞培养基(含10%FBS)和DMEM高糖细胞培养基(含4.5g/L葡萄糖、10%FBS))进行细胞培养,细胞生长良好,备用。
上述细胞在37℃,含5%CO2和相对湿度为85%-90%的培养箱内培养,培养基隔天更换,每2天~3天细胞贴壁生长覆盖瓶底80%~90%后传代培。
二、细胞诱导分化
使用培养皿,在6孔板中每孔接种0.25×10^6个HepaRG细胞,用含10%FBS和1%Glut max(来自GibcoTM)的1640完全培养基中在37℃,含5%CO2和相对湿度为90%的培养箱内培养,培养2天后隔天更换为分化培养基,分化培养基需每天更换一次,。分化培养基的成分主要包括:10%FBS+1%Glut max+HepaRG诱导培养基添加剂(来自GibcoTM),整个分化过程如图1所示。
图示1显示未经诱导的HepaRG细胞间分辨明显,在HepaRG细胞分化培养基中培养3天后,逐渐分化成扁平状和颗粒状。
2.细胞模型评价
2.1白蛋白分泌量检测
使用白蛋白检测试剂盒在HepaRG细胞分化前后进行分泌量的测定,检测结果柱状图如图2所示,分化后白蛋白的分泌量约是对照组的4倍;
2.2PAS(过碘酸雪夫)染色结果
使用南京建成的过碘酸雪夫染色试剂盒对HepaRG细胞分化组与对照组进行染色,如图2所示,箭头所指部分为糖原,结果显示,分化后细胞糖原含量增加。
3.动物验证模型建立
一、动物分组及处理
将60只6周龄雄性C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和高、中(或中高、中低)、低剂量的受试物组,图6至9中给出了从低至高的不同剂量的受试物组。干预4周。喂养期间,每天记录进食量并观察大鼠有无异常情况,每周称量三次体重并于固定时间给予灌胃干预。
二、动物模型评价
4周后处死小鼠,,收集其血清、肝脏,记录小鼠的肝体比,并进行HE染色,检测小鼠的肝脏病理形态。
小鼠体重变化情况如图6至8显示,肝脏HE染色结果如图9显示,高剂量组的小鼠出现肝小叶结构不清,肝窦受压变狭,肝细胞有的变圆、胞浆空亮,形成气球样变。
实验例2
1.CCK8细胞毒性实验
染毒HepaRG细胞、HepG2细胞不同时间,用CCK8试剂对细胞活力水平进行了测定,结果如图3、4、5所示。
结果显示,HepaRG细胞、HepG2细胞DON处理后最佳干预时间为24h,针对后续实验的干预剂量为HepaRG:0.1,0.2,0.4,0.8μM,HepG2:0.2,0.4,0.8;
HepaRG细胞、HepG2细胞Hgcl2处理后最佳干预时间为12h,针对后续实验的干预剂量为HepaRG:70,72,74μM,HepG2:70,72,74μM;
HepaRG细胞、HepG2细胞La(NO3)3处理后最佳干预时间为24h,针对后续实验的干预剂量为HepaRG:1,3,5,7μM,HepG2:1,1.5,2,2.5μM。
实验例3
2.ROS活性氧实验
分别使用DON干预HepaRG细胞24h、Hgcl2干预HepaRG细胞12h,La(NO3)3干预HepaRG细胞24h后,加入终浓度为10μM的DCFH-DA荧光探针溶液,避光孵育细胞20 分钟,孵育结束后用PBS清洗2-3次。在倒置荧光显微镜下用蓝光激发绿光荧光,观察和拍摄图像。随机选取显微照片区域,使用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行荧光强度半定量分析。
结果如图10显示,三种受试物干预后,肝细胞ROS产生量均上升,因此ROS产生情况可以作为食品污染物的指标。
3.MMP线粒体膜电位实验
分别使用DON干预HepaRG细胞24h、Hgcl2干预HepaRG细胞12h,La(NO3)3干预HepaRG细胞24h后,加入四甲基罗丹明甲酯(TMRM)荧光探针溶液,避光孵育细胞30 分钟,孵育结束后用PBS清洗2-3次。在倒置荧光显微镜下用绿光激发红色荧光,观察和拍摄图像。随机选取显微照片区域,使用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行荧光强度半定量分析。
如图11所示,结果显示,三种受试物干预后,DON和Hgcl2的线粒体膜电位水平明显降低,La(NO3)3的染毒后的膜电位水平未见变化,因此MMP损伤情况有潜力作为食品污染物的肝毒性指标。
3.Western blot检测细胞蛋白表达实验
收集细胞和动物样本,使用Western blot检测了caspase-3凋亡通路蛋白表达的变化情况,结果显示与对照组相比,GST蛋白表达情况明显增加。提示,该凋亡蛋白可作为食品污染物的肝毒性指标。
结合以上所述实验,我们筛选出了ROS、MMP损伤情况及GST作为食品污染物的肝毒性指标,并进行了动物验证,结果如图12-14所示。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型,其特征在于,以HepaRG细胞与HepG2细胞建立一个用于食品污染物肝毒性评测的体外肝毒性替代模型。
2.HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1)细胞培养:将HepaRG细胞和HepG2细胞分别进行细胞培养;其中,HepaRG细胞培养选择William's E细胞培养基,其含有2-20%胎牛血清;HepG2细胞培养选择含4.5g/L葡萄糖的DMEM高糖细胞培养基,其含有2-20%胎牛血清;
2)细胞诱导:将HepaRG细胞接种于细胞培养皿内培养,将设定数量的HepaRG细胞以完全培养基贴壁生长3天后,更换为诱导培养基进行诱导培养,得到分化HepaRG细胞;
3)模型构建:将HepG2细胞与经诱导的HepaRG细胞分别接种于预定载体上培养,得到体外肝毒性替代模型。
3.如权利要求2所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,HepaRG细胞和HepG2细胞培养的培养基均含10%胎牛血清。
4.如权利要求2所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,建立的肝毒性评测模型对食品污染物进行评测,具体包括如下评测:
1)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于96孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,进行CCK8实验;
2)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种于24孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯DCFH-DA对细胞进行染色,在荧光显微镜下进行细胞ROS的含量测定检;
3)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6cm培养皿内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,使用四甲基罗丹明甲酯TMRM对细胞进行染色,在荧光显微镜下检测细胞的线粒体损伤;
4)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种10cm培养皿内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,超声破碎细胞,检测细胞氧化应激相关酶活力水平和肝功能酶活力水平;
5)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6cm培养皿内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,通过LC-MS进行细胞广靶蛋白组学测定;
6)消化处理HepaRG和HepG2细胞,制成单细胞悬液,分别接种6孔板内;接种24h后,分别使用多种食品污染物进行染毒,收集细胞,根据组学结果,通过western blot对细胞筛选出的蛋白进行验证。
5.如权利要求4所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,食品污染物包括:真菌毒素、重金属、稀土元素。
6.如权利要求5所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,肝毒性评测模型对食品污染物进行评测后,还包括通过动物实验进行体内验证,具体包括如下步骤:
1)将C57BL/6雄性小鼠分为对照组和多组不同剂量的化合物组,使用真菌毒素、重金属、稀土元素;分别经口染毒一个月;
2)每隔3日对小鼠进行称重,处死小鼠时记录小鼠的肝体比;
3)将染毒后小鼠的肝脏进行HE染色,检测小鼠的肝脏病理形态;
4)收集小鼠血清,进行肝功能酶活力水平的检测;匀浆小鼠肝脏组织进行氧化应激相关酶活力水平的检测;
5)选取重金属;染毒后的小鼠肝脏,通过LC-MS进行广靶蛋白组学测定。
7.如权利要求5所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,肝毒性评测模型对食品污染物的评测具体包括以下步骤:
1)细胞进行常规处理消化后,制成单细胞悬液后需进行细胞计数,需根据所需实验目的用培养基将细胞悬液稀释至不同的浓度范围;
2)称取DON、Hgcl2、La(NO3)3受试物,选择高压后的超纯水作为水溶性受试物Hgcl2和La(NO3)3的溶剂,选取二甲基亚砜DMSO作为难溶于水受试物DON的溶剂;配置三种受试物的母液浓度为16M、100M、100M;
3)用细胞培养基将三种受试物的母液浓度稀释,稀释至浓度为1M,向96孔细胞板中每孔加入一定量含受试物的培养基,使最终每孔内受试物的含量分别为DON为0-3.2μM,Hgcl2为0-80μM,La(NO3)3为0-4μM;
4)将细胞板置于37℃、5%CO2条件下,进行3、6、24、48小时染毒,染毒完成后加入每孔加入10ul CCK8试剂,得到用于之后实验的最佳干预时间和最佳干预剂量。
8.如权利要求7所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,具体步骤1)中的细胞数量根据培养皿面积的不同而调整,96孔板需稀释细胞至2-5×104个细胞/孔;24孔板需稀释细胞至10-15×104个细胞/孔;6cm培养皿需稀释细胞至2-8×105个细胞/孔;10cm培养皿需稀释细胞至1-3×106个细胞/孔。
9.如权利要求7所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法,其特征在于,具体步骤3)中最终每孔内受试物的含量分别为DON为0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2μM,Hgcl2为0,70,72,74,76,78,80μM,La(NO3)3为0,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4μM。
10.HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型在肝毒性药物的安全性评测中的应用。
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