CN116296705A - 一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒及其制备方法，包括：中性红染料和10×PBS缓冲液，所述中性红染料通过以下方法制备得到：1)将氯化钠、二水合氯化钙、氯化钾、六水合氯化镁在蒸馏水中充分溶解；2)将中性红粉末溶解于步骤1)得到的溶液中，充分溶解，4℃保存，即得所述中性红染料，本发明使用一种酸碱指示剂中性红，对活体斑马鱼幼鱼体内巨噬细胞染色，通过观察巨噬细胞染色成像，可检测巨噬细胞分布情况，该试剂盒具有简便，快速，成功率高，重复性好且稳定可靠等优点，便于实现定性分析与定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，特别涉及一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒及其制备方法。
背景技术
中性红是一种酸碱指示剂，并且可以在活体斑马鱼中着色，中性红可通过渗透进入斑马鱼幼鱼体内，在体内被巨噬细胞捕获后大量聚积，由于巨噬细胞内具有酸性环境，因此中性红能使斑马鱼巨噬细胞显示深红色，通过观察红色染料的分布，进而鉴别及分析巨噬细胞的分布情况。
斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，由于它具有体积小、繁殖周期快、胚胎透明、发育迅速、与人类相关基因和信号通路有高度同源性等特点，而逐渐被应用于疾病模型的研究。
现阶段，对斑马鱼巨噬细胞染色的实验繁琐，操作复杂。
因此，现在有必要提供一种能够快速、高效地提高斑马鱼巨噬细胞染色效果，便于直接观察到巨噬细胞具体情况的方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供了一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒，包括中性红染料和10×PBS缓冲液。
一种巨噬细胞染色试剂盒的制备方法，所述中性红染料通过以下方法制备得到：
1)将氯化钠、二水合氯化钙、氯化钾、六水合氯化镁在蒸馏水中充分溶解；
2)将中性红粉末溶解于步骤1)得到的溶液中，充分溶解，4℃保存，即得所述中性红染料；
3)将中性红染料和10×PBS缓冲液进行混合。
3、根据权利要求2所述的巨噬细胞染色试剂盒的制备方法，其特征在于，所述10×PBS缓冲液的pH值为7.4，该10×PBS缓冲液包括：氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾以及磷酸二氢钾。
一种使用巨噬细胞染色试剂盒进行巨噬细胞检测的方法，包括以下步骤：
1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；
2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；
3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵，随后放入恒温培养室培养；(恒温孵育的温度为28.5℃，时间为4天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育)；
4)取步骤3)中受精卵培养4天后的斑马鱼，用1×PBS缓冲液洗涤2-3次，吸干净溶液；
5)按照1:1000用1×PBS缓冲液稀释中性红染料(2.5mg/mL)，使其终浓度为2.5μg/mL，将1mL稀释好的中性红染色液加入装有待染色斑马鱼的EP管中，28.5-30℃避光孵育8-24小时(视染色情况而定)；
6)弃去管内中性红染色稀释液，加入1mL1×PBS缓冲液，洗涤2-3次；
7)保存：用1×PBS缓冲液浸泡保存；
8)拍照：鱼体放入3％甲基纤维素中，在显微镜下拍照。
一种巨噬细胞染色试剂盒的使用方法的用途，该方法用于在斑马鱼幼鱼体内分析巨噬细胞的分布情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明能够直接观察检测巨噬细胞，本发明进一步提供了一种斑马鱼中性红染色方法，其能用于评价斑马鱼体内巨噬细胞分布情况。
与现有技术相比，本发明具有简便，快速，高效，成功率高，重复性好且稳定等优点，能实现定性分析与定量分析。
附图说明
图1为斑马鱼幼鱼的巨噬细胞染色图像示意图；
图2为本发明的主视图；
图3为本发明的右视图
图4为本发明的立体图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例作详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
本发明提供了一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒，包括中性红染料和10×PBS缓冲液；巨噬细胞可通过染色在显微镜下观察到。
本发明还提供了一种基于该试剂盒的巨噬细胞检测方法，可用于检测包括巨噬细胞分布情况在内的多种参数。
以下提供具体的实施例，以对本发明作进一步说明。
实施例1一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒：
本实施例提供一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒，包括：中性红染料，10×PBS缓冲液。
其中，中性红染料，2.5mg/mL；
其中，10×PBS缓冲液的pH为7.4，该缓冲液包括：氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾以及磷酸二氢钾。
实施例2一种斑马鱼巨噬细胞染色方法
本实施例采用实施例1的试剂盒对斑马鱼巨噬细胞进行染色，其方法包括以下步骤：
1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；
2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；
3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵，随后放入恒温培养室培养；(恒温孵育的温度为28.5℃，时间为4天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育)；
4)取步骤3)培养后的样品进行中性红染色。
进一步地，所述中性红染色的方法具体为：
a：取步骤3)中受精卵培养4天后的斑马鱼，用1×PBS缓冲液洗涤2-3次，吸干净溶液；
b：中性红染色：按照1:1000用1×PBS缓冲液稀释中性红染料(2.5mg/mL)，使其终浓度为2.5μg/mL。将1mL稀释好的中性红染色液加入装有待染色斑马鱼的EP管中，28.5-30℃避光孵育8-24小时(视染色情况而定)；
c：弃去管内中性红染色稀释液，加入1mL1×PBS缓冲液，洗涤2-3次；
d：保存：用1×PBS缓冲液浸泡保存；
e：拍照：鱼体放入3％甲基纤维素中，在显微镜下拍照。
综合图1所示，对实施例2染色后的斑马鱼进行显微镜观察拍照，通过软件Image-pro-plus6.0对图像进行分析，计算斑马鱼的巨噬细胞数目。
实施例2成功运用斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒观察到幼鱼巨噬细胞的情况，并且该方法具有简便、快速、高效、成功率高、重复性好且稳定可靠等优点，能实现定性分析与定量分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。
Claims (5)
1.一种斑马鱼巨噬细胞染色试剂盒，其特征在于：包括中性红染料和10×PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞染色试剂盒的制备方法，其特征在于，所述中性红染料通过以下方法制备得到：
1)将氯化钠、二水合氯化钙、氯化钾、六水合氯化镁在蒸馏水中充分溶解；
2)将中性红粉末溶解于步骤1)得到的溶液中，充分溶解，4℃保存，即得所述中性红染料；
3)将中性红染料和10×PBS缓冲液进行混合。
3.根据权利要求2所述的巨噬细胞染色试剂盒的制备方法，其特征在于，所述10×PBS缓冲液的pH值为7.4，该10×PBS缓冲液包括：氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾以及磷酸二氢钾。
4.一种使用根据权利要求1所述巨噬细胞染色试剂盒进行巨噬细胞检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；
2)收集到的鱼卵置于含有亚甲基蓝的培养皿中，挑选受精鱼卵，按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，恒温孵育5小时；
3)恒温孵育后挑出发育状况优良的受精卵，随后放入恒温培养室培养；(恒温孵育的温度为28.5℃，时间为4天，每天以14小时光照/10小时黑暗的条件进行恒温孵育)；
4)取步骤3)中受精卵培养4天后的斑马鱼，用1×PBS缓冲液洗涤2-3次，吸干净溶液；
5)按照1:1000用1×PBS缓冲液稀释中性红染料(2.5mg/mL)，使其终浓度为2.5μg/mL，将1mL稀释好的中性红染色液加入装有待染色斑马鱼的EP管中，28.5-30℃避光孵育8-24小时(视染色情况而定)；
6)弃去管内中性红染色稀释液，加入1mL 1×PBS缓冲液，洗涤2-3次；
7)保存：用1×PBS缓冲液浸泡保存；
8)拍照：鱼体放入3％甲基纤维素中，在显微镜下拍照。
5.根据权利要求4所述的巨噬细胞染色试剂盒的使用方法的用途，其特征在于，该方法用于在斑马鱼幼鱼体内分析巨噬细胞的分布情况。
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