CN114478331A - 一种蒜氨酸的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然产物的分离纯化领域，具体涉及一种蒜氨酸的分离纯化方法。前期通过双水相处理，后采用醇沉除去多糖、无机盐；然后采用30%磷酸二氢钠‑乙醇‑丙酮为溶剂体系，通过高速逆流色谱（HSCCC）对蒜氨酸进行分离纯化，该方法具有操作简便对样品的前处理要求低，耗时短，处理量大、不存在吸附、降解和污染回收率高等优势。

Description

一种蒜氨酸的分离纯化方法
技术领域
本发明属于天然产物的分离纯化领域，具体涉及一种蒜氨酸的分离纯化方法。
背景技术
通过天然提取的方式获得的蒜氨酸粗提液中会掺杂大量的大蒜多糖物质及少量水溶性蛋白质。因此，对蒜氨酸进行分离纯化和精制显得很有必要，目前研究较多是离子交换柱色谱法分离纯化蒜氨酸。但作为固定相的离子交换树脂具有传质较慢、柱效低离子、易溶胀和收缩、不耐高压等缺点。这些问题限制了蒜氨酸的高效制备，开发新型高效的制备技术意义深远。
发明内容
本专利采用的高速逆流色谱（HSCCC）技术是一种较新型的液—液分配色谱，具有操作简便对样品的前处理要求低，耗时短，处理量大、不存在吸附、降解和污染回收率高等优势。
本发明的技术方案如下：
一种蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用硫酸铵、氯化钠、正丙醇、pH 为2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系，处理灭酶蒜粉，下相即为粗提液；
（2）向步骤（1）的粗提液通过醇沉除去多糖、无机盐，离心，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末；
（3）采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮为溶剂体系，取步骤（2）的固体粉末加入到已达到平衡之后的溶剂系统中，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，采用高速逆流色谱仪进行纯化。
优选地，步骤（3）溶剂体系的30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮的体积比为6:3:1.5。
优选地，步骤（3）的溶剂体系平衡后分为上下两相，上相作为高速逆流色谱仪的固定相，下相为高速逆流色谱仪的流动相。
优选地，步骤（2）的固体粉末加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统，并超声使其完全溶解；所述的固体粉末与上、下两相溶剂的加入量比值为400mg:10mL:10mL。
上述蒜氨酸的分离纯化方法，所述步骤（3）中高速逆流色谱仪的具体参数为：将固定相以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，待固定相充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为 1050 rpm，同时流动相以 1.8 m L/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡：然后将备好的样品溶液从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30min 收集到目标馏分。
优选地，所述步骤（1）中双水相体系为：19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠/20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系。
高速逆流色谱（HSCCC）原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，可以达到几千个理论塔板数。将HSCCC用于蒜氨酸的分离，不仅实现了蒜氨酸分离的方法创新，而且对于降低分离成本，提高分离效率，推动蒜氨酸规模化生产具有重要意义。
本发明的有益效果：
与普通色谱技术相比，本方案无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，蒜氨酸回收率高，纯度高,浓缩后可直接进行结晶制备高纯度蒜氨酸产品。
2、加入丙酮后溶剂体系作为一种双水相溶液，两相极性改变体系分层时间缩短至原来的一半左右（约30s），处于 HSCCC合适分层时间范围内，可以获得良好的固定相保留率（保留率为60%）。
具体实施方式
实施例1
一种蒜氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠 /20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系1L中加入40g灭酶蒜粉，在 30℃下振荡器中震荡提取40 min。
（2）取提取液下相加入乙醇，酒精度达到 73 度时室温下静置1 h，通过醇沉的方法除去多糖，大量的大蒜多糖醇沉、无机盐结晶析出后，经 3000 rpm 下离心 15 min，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末，备用。
(3) 采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（6:3:1.5，v/v/v）为溶剂体系，将固定相（溶剂体系平衡后的上相）以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相（溶剂体系平衡后的上相）充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为1050 rpm，同时流动相（溶剂体系平衡后的下相）以 1.8 mL/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。
(4)取步骤（2）的固体粉末400mg加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统各10mL，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分，采用 HPLC 测定蒜氨酸含量，其纯度为 63.5%，固定相保留率为 60%。
实施例2
一种蒜氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠 /20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系1L中加入30g灭酶蒜粉，在 30℃下振荡器中震荡提取40 min。
（2）取提取液下相加入乙醇，酒精度达到 75 度时室温下静置1 h，通过醇沉的方法除去多糖，大量的大蒜多糖醇沉、无机盐结晶析出后，经 3000 rpm 下离心 15 min，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末，备用。
(3) 采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（6:3:1.5，v/v/v）为溶剂体系，将固定相（上相）以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相（上相）充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为 1050 rpm，同时流动相（下相）以 1.8 mL/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。
(4) 取步骤（2）的固体粉末400mg加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统各10mL，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分，采用 HPLC 测定蒜氨酸含量，其纯度为 63.3%，固定相保留率为 60%。
实施例3
一种蒜氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠 /20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系1L中加入50g灭酶蒜粉，在 30℃下振荡器中震荡提取40 min。
（2）取提取液下相加入乙醇，酒精度达到 70 度时室温下静置1 h，通过醇沉的方法除去多糖，大量的大蒜多糖醇沉、无机盐结晶析出后，经 3000 rpm 下离心 15 min，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末，备用。
(3) 采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（6:3:1.5，v/v/v）为溶剂体系，将固定相（上相）以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相（上相）充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为1050 rpm，同时流动相（下相）以 1.8 mL/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。
(4) 取步骤（2）的固体粉末400mg加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统各10mL，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分，采用 HPLC 测定蒜氨酸含量，其纯度为 62.8%，固定相保留率为60%。
对比例1
一种蒜氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)在19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠 /20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系1L中加入30g灭酶蒜粉，在 30℃下振荡器中震荡提取40 min。
（2）取提取液下相加入乙醇，酒精度达到 73 度时室温下静置1 h，通过醇沉的方法除去多糖，大量的大蒜多糖醇沉、无机盐结晶析出后，经 3000 rpm 下离心 15 min，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末，备用。
(3) 采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（5:3:1，v/v/v）为溶剂体系，将固定相（溶剂体系平衡后的上相）以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相（溶剂体系平衡后的上相）充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为 1050rpm，同时流动相（溶剂体系平衡后的下相）以 1.8 m L/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。
(4)取步骤（2）的固体粉末400mg加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统各10mL，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分，采用 HPLC 测定蒜氨酸含量，其纯度为 55.7%，固定相保留率为 53%。
对比例2
一种蒜氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)灭酶蒜粉溶于水，然后过滤，得到粗提液。
（2）取粗提液加入乙醇，酒精度达到 75 度时室温下静置1 h，通过醇沉的方法除去多糖，大量的大蒜多糖醇沉、无机盐结晶析出后，经 3000 rpm 下离心 15 min，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末，备用。
(3) 采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（6:3:1.5，v/v/v）为溶剂体系，将固定相（上相）以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的聚四氟乙烯螺旋管中，待固定相（上相）充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为 1050 rpm，同时流动相（下相）以 1.8 mL/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡。
(4) 取步骤（1）的固体粉末400mg加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统各10mL，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分，采用 HPLC 测定蒜氨酸含量，其纯度为 45%，固定相保留率为 60%。

Claims (6)

1.一种蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用硫酸铵、氯化钠、正丙醇、pH 为2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系，处理灭酶蒜粉，下相即为粗提液；
（2）向步骤（1）的粗提液通过醇沉除去多糖、无机盐，离心，将上清液减压回收乙醇，烘干，得蒜氨酸粗提物固体粉末；
（3）采取30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮为溶剂体系，取步骤（2）的固体粉末加入到已达到平衡之后的溶剂系统中，并超声使其完全溶解后，从进样阀中注入高速逆流色谱仪，采用高速逆流色谱仪进行纯化。
2.根据权利要求1所述的蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）溶剂体系的30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮的体积比为6:3:1.5。
3.根据权利要求1所述的蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）的溶剂体系平衡后分为上下两相，上相作为高速逆流色谱仪的固定相，下相为高速逆流色谱仪的流动相。
4.根据权利要求3所述的蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，步骤（2）的固体粉末加入到已达到平衡之后的上、下两相溶剂系统，并超声使其完全溶解；所述的固体粉末与上、下两相溶剂的加入量比值为400mg:10mL:10mL。
5. 根据权利要求1-4任一所述的蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤（3）中高速逆流色谱仪的具体参数为：将固定相以 20 m L/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，待固定相充满螺旋管后，开启高速逆流色谱仪，调整转速为 1050 rpm，同时流动相以 1.8 m L/min 的流速泵入充满固定相后的螺旋管中，待末端有流动相流出时，即螺旋管中上下相已达到动态平衡：然后将备好的样品溶液从进样阀中注入高速逆流色谱仪，经过高速逆流色谱分离后，在 25~30 min 收集到目标馏分。
6. 根据权利要求1所述的蒜氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤（1）中双水相体系为：19% (w/w) 硫酸铵/8.54% (w/w) 氯化钠 /20% (w/w)正丙醇/ pH 为 2.4伯瑞坦-罗比森缓冲溶液组成的双水相体系。
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