CN114460301A - 一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒 - Google Patents

一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测定肌酸激酶同工酶浓度的试剂盒。本发明的试剂盒包括试剂R1、试剂R2及校准品；所述试剂R1为缓冲体系；所述试剂R2为交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒溶液；校准品包括肌酸激酶同工酶、磷酸缓冲液，保护剂，防腐剂。本发明的测定肌酸激酶同工酶浓度的试剂盒,采用脂质体微球连接鼠抗人肌酸激酶同工酶单克隆抗体，该检测试剂盒解决了目前市场上免疫抑制法试剂精密度差、特异性低、稳定性差的问题。

Description

一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒。
背景技术
肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes)别名为血清肌酸激酶同工酶是一种酶类成分，它有有四种同功酶形式：肌肉型、脑型、杂化型和线粒体型。
肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基组成的二聚体。根据已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43kDa左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。大熊猫肌肉型肌酸激酶也是二聚体酶，每个亚基由376个氨基酸残基组成，分子量为42KDa。
肌酸激酶的同工酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，认为在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。心肌梗死时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB诊断的特异性最高。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
目前，检测肌酸激酶的同工酶CK-MB的方法主要有免疫抑制法，但是在临床应用过程中出现了低端灵敏度比较差，精密度不好，受CK-BB巨型CK及CK-Mt的干扰，有时会出现CKMB>CK的现象。而本发明试剂采用单克隆抗体直接结合CK-MB,不受CK-BB巨型CK及CK-Mt的干扰，对于微小心肌梗死的诊断价值优于传统活性检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒，它操作简便、灵敏度高、特异性好，能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及校准品；
所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系；
所述试剂R2为交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒溶液；
所述校准品包括肌酸激酶同工酶、缓冲液，保护剂，防腐剂。
所述试剂R1包括的组分及含量如下：
Figure BDA0003439280620000021
所述试剂R2包括的组分及含量如下：
Figure BDA0003439280620000022
所述标准品包括的组分及含量如下：
Figure BDA0003439280620000023
所述的校准品包含肌酸激酶同工酶浓度分别为0，10，30，60，120ng/mL的5支校准品。
按体积比，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为10-15:150-200:30-50。
优选地，按体积比，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为10:150:50。
试剂R2中，所述交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒包括：鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1交联到纳米脂质体颗粒一的表面形成的单抗1致敏颗粒；以及鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2交联到纳米脂质体颗粒二的表面形成的单抗2致敏颗粒；所述纳米脂质体颗粒一的直径为60-86nm，所述纳米脂质体颗粒二的直径为350-480nm。
其中：
鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2：来自罗氏诊断公司Roche Diagnostics GmbH。
鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1：来自罗氏诊断公司Roche Diagnostics GmbH。
鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1相较于鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2与抗原具有更高的亲和性，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1包被大粒径的微球可以先参与反应，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2包被小粒径的微球后参与反应，可以通过控制抗体反应的先后顺序来达到控制大小致敏颗粒的反应顺序，从而使得试剂同时具备高灵敏度和高线性。
试剂R2中单抗1致敏颗粒与单抗2致敏颗粒的体积比例为1：3-2：3。
所述纳米脂质体颗粒一的制备方法包括如下步骤：
A、将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的悬浮液膜材，悬浮液膜材中卵磷脂浓度为30-50mg/L；
B、PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液和/或季胺盐形成混合缓冲液；
C、将步骤A悬浮液膜材注入混合缓冲液，超声处理并过滤，获得所述纳米脂质体颗粒一。
所述纳米脂质体颗粒二的制备方法包括如下步骤：
1)、将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的悬浮液膜材，悬浮液膜材中卵磷脂浓度为70-100mg/L；
2)、PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液和/或季胺盐形成混合缓冲液；
3)、将步骤1)悬浮液膜材注入混合缓冲液，超声处理并过滤，获得所述纳米脂质体颗粒一。
9、根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述单抗1致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、取纳米脂质体颗粒一离心，弃上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；
S2、复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后搅拌，然后离心，弃上清，离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗1致敏颗粒。
10、根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单抗2致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、取纳米脂质体颗粒一离心，弃上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；
S2、复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后搅拌，然后离心，弃上清，离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗2致敏颗粒。
试剂R2中单抗1致敏颗粒与单抗2致敏颗粒的含量比例为1：3-2：3。
试剂R1中，所述聚合物选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖10000-40000Kd，其中一种或几种。
两株鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体在不同的化学交联的条件下分别交联到大小不同的两个纳米脂质体颗粒表面。
鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1最适交联条件为甘氨酸缓冲液(O.1mol/L，pH5.2)，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2最适交联条件为MES缓冲液(O.1mol/L，pH6.1)，抗体的加入量与脂质体颗粒的比为12-20mg/10mL。
制备直径为60-86nm脂质体时，亚硫酸钠浓度为2.5mol/L，加入体积为5-8ml，季胺盐浓度为0.05mol/L，加入体积为1-3ml；其中制备直径为350-480nm脂质体时，亚硫酸钠浓度为2.5mol/L，加入体积为3-6ml，季胺盐浓度为0.05mol/L，加入体积为2-4ml。
所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300或苯酚中的一种或多种，浓度范围为10-500mM。
亚硫酸钠和季胺盐浓度的高低决定了脂质体颗粒表面电荷高低，其中制备直径为60-86nm脂质体时，亚硫酸钠浓度为2.5mol/L，加入体积为5-8ml，季胺盐浓度为0.05mol/L，加入体积为1-3ml；其中制备直径为350-480nm脂质体时，亚硫酸钠浓度为2.5mol/L，加入体积为3-6ml，季胺盐浓度为0.05mol/L，加入体积为2-4ml。
本发明添加了胆固醇，微球制备更加可控，长期保存球体更稳定，采用了添加了亚硫酸钠用于增加微球表面电荷，试剂的稳定性会更好。并通过控制大小球亚硫酸钠和季胺盐浓度来控制脂质体表面的电荷数量，从而可以控制大小球参与反应的顺序，大球由于带有较少的电荷先参与反应，小球有较多的电荷，后参与反应。达到了大球先参与反应提高了试剂的灵敏度，小球后参与反应提升了试剂的线性范围。
所述的致敏颗粒封闭液组分如下：MOPSO 0.2mol/L pH7.8、氯化钠0.8mol/L，海藻糖5％，牛血清白蛋白1-2％，防腐剂0.1％。致敏颗粒的含量为0.1-0.5g/L
所述防腐剂选自叠氮化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫柳汞、Proclin-300或苯酚中的一种或多种，浓度范围为10-500mM.
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)通过添加胆固醇，解决了脂质体微球韧性不够而易变性沉淀的问题，实现了提高脂质体微球制备成功率；实现了提高试剂反应稳定性的有益效果；
(2)通过控制添加亚硫酸钠的浓度，解决了脂质体表面电荷不够而易积聚的问题，实现了提高试剂稳定性的有益效果；
(3)通过控制亚硫酸钠和季胺盐浓度来控制脂质体表面电荷量的技术特征，解决抗体对反应先后顺序，实现了试剂同时提高了灵敏度和线性范围的有益效果；
(4)通过筛选不同反应亲和性的一对单抗分别包被大小微球，从而可以控制大小球的反应顺序，实现了试剂同时提高了灵敏度和线性范围的有益效果；
(5)本发明通过CKMB抗原抗体反应直接检测样本中的CKMB含量，相对于现有常规的免疫抑制法试剂，解决了现有技术低端试剂检测精密度差，试剂假阳性率高的问题。
(6)鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1相较于鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2与抗原具有更高的亲和性，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1包被大粒径的微球可以先参与反应，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2包被小粒径的微球后参与反应，可以通过控制抗体反应的先后顺序来达到控制大小致敏颗粒的反应顺序，从而使得试剂同时具备高灵敏度和高线性。本发明的试剂盒操作简便、灵敏度高、特异性好，能快速的测定结果、且测定结果准确性高。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为验证例1中检测试剂的相关性检验结果；
图2为验证例3中实施例4的线性图；
图3为验证例3中对比例1的线性图；
图4为验证例3中对比例2的线性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种纳米脂质体颗粒一的制备方法，包括如下步骤：
称取3g卵磷脂和0.1g胆固醇，溶于10ml无水乙醇，水浴超声处理5min后形成稳定的淡黄色均匀的悬浮液放入酸式滴定管中。用量筒取40mlPBS缓冲液(pH6.8)于100mL烧杯中置于40℃水浴，再加入8ml浓度为2.5mol/L的亚硫酸钠溶液，再加入0.05mol/L的季胺盐2mL，搅拌的同时以每秒1滴的速率将滴定管的膜材注入恒温于40℃的PBS缓冲液中，注入过程持续20min左右。将制备的脂质体悬液装入茄形瓶中水浴超声处理，每进行5s超声暂停5s，超声时间总计30min后得到白色半透明脂质体悬浮液，用微孔滤膜除去大颗粒杂质后，置于2-8℃保存。
本实施例制备的脂质体颗粒的直径为60-86nm。
实施例2
本实施例提供一种纳米脂质体颗粒二的制备方法，包括如下步骤：
称取6g卵磷脂和0.1g胆固醇，溶于10ml无水乙醇，水浴超声处理5min后形成稳定的淡黄色均匀的悬浮液放入酸式滴定管中。用量筒取40mlPBS缓冲液(pH6.8)于100mL烧杯中置于40℃水浴，再加入6ml浓度为2.5mol/L的亚硫酸钠溶液，再加入0.05mol/L的季胺盐4mL，搅拌的同时以每秒1滴的速率将滴定管的膜材注入恒温于40℃的PBS缓冲液中，注入过程持续20min左右。将制备的脂质体悬液装入茄形瓶中水浴超声处理，每进行5s超声暂停5s，超声时间总计30min后得到白色半透明脂质体悬浮液，用微孔滤膜除去大颗粒杂质后，置于2-8℃保存。
本实施例制备的脂质体颗粒的直径为350-480nm。
实施例3
1、单抗2致敏颗粒的制备方法如下：
S1、取实施例2制备的纳米脂质体颗粒二离心，去上清液后，用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)复悬，超声分散，得复悬液；
S2、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；
S3、将经步骤S2离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后加入购买罗氏公司的鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2，室温搅拌后离心；
S4、将经步骤S3离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后离心；
S5、将经步骤S4离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后离心；
S6、将经步骤S5离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗2致敏颗粒。
步骤S3中，所述鼠单抗2的加入量与脂质体颗粒的比为12mg/10ml；所述的致敏颗粒封闭液组分如下：MOPSO 0.2mol/L pH7.8、氯化钠0.8mol/L，海藻糖5％，牛血清白蛋白1-2％，防腐剂0.1％。
2、单抗1致敏颗粒制备方法如下：
S1、取实施例1制备的纳米脂质体颗粒一离心，去上清液后，用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)复悬，超声分散，得复悬液；
S2、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；
S3、将经步骤S2离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后加入购买自罗氏公司的鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1，室温搅拌后离心；
S4、将经步骤S3离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；
S5、将经步骤S4离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；
S6、将经步骤S5离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗1致敏颗粒。
优选地，步骤S3中，所述鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1的加入量与脂质体颗粒的比为12mg/10ml。
所述的致敏颗粒封闭液组分如下：MOPSO 0.2mol/L pH7.8、氯化钠0.8mol/L，海藻糖5％，牛血清白蛋白1-2％，防腐剂0.1％。
3、交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒
取单抗1致敏颗粒和单抗2致敏颗粒混合，体积比为1:2，制备成交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒。
实施例4
本实施例试剂盒配方及含量如下：
R1：配制表
Figure BDA0003439280620000081
R2：配制表
Figure BDA0003439280620000082
校准品：配制表
Figure BDA0003439280620000083
Figure BDA0003439280620000091
其中，百分比为体积百分比。
试剂R2中，交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒为实施3所制备。
试剂盒中，所述试剂R1、R1及标准品的体积比为10:150:50。
对比例1
本对比例提供的试剂盒与实施例4的不同之处在于，在R2试剂中交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒仅包括实施例3所制备的单抗1致敏颗粒。
对比例2
本对比例提供的试剂盒与实施例4的不同之处在于，在R2试剂中交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒仅包括实施例3所制备的单抗2致敏颗粒。
对比例3
将本公司CKMB检测试剂盒(免疫抑制法)作为对比试剂盒与本申请实施例进行性能比对。
对比例4
选择罗氏诊断公司Roche Diagnostics GmbH提供的CKMB检测试剂盒(化学发光法)作为对比试剂盒与本申请实施例进行性能比对。
对比例5
本对比例提供的试剂盒与实施例4的不同之处在于，将单抗1致敏颗粒和单抗2致敏颗粒替换为单抗1乳胶微球致敏颗粒和单抗2乳胶微球致敏颗粒，即纳米脂质体颗粒一和纳米脂质体颗粒二均采用乳胶微球。
本对比例的单抗1乳胶微球致敏颗粒的制备方法如下：
①、取买自美国Bangslab来的乳胶微球离心，去上清液后，用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)复悬，超声分散，得复悬液；
②、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；
③、将经步骤②离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1，室温搅拌后离心；
④、将经步骤③离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；
⑤、将经步骤④离心后的沉淀用甘氨酸缓冲液(0.1mol/L，pH5.2)溶解悬浮，超声，然后离心；
⑥、将经步骤⑤离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗1乳胶微球致敏颗粒。
本对比例的单抗2乳胶微球致敏颗粒的制备方法如下：
①、取买自美国Bangslab来的乳胶微球离心，去上清液后，用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)复悬，超声分散，得复悬液；
S2、将复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后，室温搅拌，然后离心；
S3、将经步骤s2离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2，室温搅拌后离心；
S4、将经步骤s3离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后离心；
S5、将经步骤s4离心后的沉淀用MES缓冲液(0.1mol/L，pH6.1)溶解悬浮，超声，然后离心；
S6、将经步骤s5离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗2乳胶微球致敏颗粒。
其余方法和参数同实施例4。
对比例6
本对比例提供的试剂盒与实施例4的不同之处在于，制备脂质体颗粒时未加入胆固醇。
效果验证
验证例1：试剂盒的相关性比较
使用本发明试剂(实施例4)和国内某知名公司的CKMB试剂盒(对比例4)，按各自参数同时进行测定对50份人血清(包括正常和异常标本)进行检测，同时对测定值进行相关性分析。
由图1的结果看出，两种试剂盒的相关系为R2＝0.999，回归方程为y＝0.998x+0.01。结果表明本试剂与进口试剂测定人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。结果准确度达到98.7％。
验证例2：试剂盒检测灵敏度比较
本实验目的是检测试剂盒在测临床样本时的最小检出感度。
采用实施例4的试剂盒、对比例1的试剂盒、对比例2的试剂盒、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。
机器：日立7170自动生化分析仪。
操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。
结果解析：如表3所示，根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂盒的最小检出感度。
表1.灵敏度检测(单位:ng/mL)
Figure BDA0003439280620000111
Figure BDA0003439280620000121
实验结果表明，本发明提供的CKMB试剂盒(实施例4)灵敏度可以到达0.25ng/mL，而对比例1提供的只能达到2ng/mL，对比例2提供的能达0.25ng/mL，说明本发明试剂盒和对比例2在灵敏度方面大有提升。
验证例3：试剂盒线性比较
本实验目的是检测本发明提供的试剂盒所能测得线性范围。
取浓度约为120ng/mL的高值样本，用0.9％NaCl作为稀释液。按1/5、2/5、3/5、4/5的比例稀释成4个点，加上空白样本和高值样本，共6个样本按标准实验操作步骤用实验例1和实验例2的方法各测定3次，分别求测定均值(yi)。以7个样本的稀释浓度(xi)为自变量，以测定均值(yi)为因变量求出线性回归方程及相关系数(r)。按公式(1)计算相关系数(r)、样本数量(n)。
Figure BDA0003439280620000122
用上述方法中稀释浓度xi代入线性回归方程，计算yi的估算值及yi与yi估算值的相对偏差或绝对偏差，应符合相关的规定。
实验结果：
表2.实施例4线性范围(单位:ng/mL)
Figure BDA0003439280620000131
表3.对比例1线性范围
Figure BDA0003439280620000132
表4.对比例2线性范围(单位:ng/mL)
Figure BDA0003439280620000133
Figure BDA0003439280620000141
其中图2为验证例3中实施例4的线性图；图3为验证例3中对比例1的线性图；图4为验证例3中对比例2的线性图。
从实验结果看出，对比例1灵敏度不好，线性好，对比例2灵敏度好，但线性不好，实施例4灵敏度和线性均好。
验证例4：
对实施4与对比例3(免疫抑制法CKMB检测试剂盒)性能比较
1.特异性
验证本发明提供的CKMB检测试剂盒(实施例4)和对比例4分析特异性实验效应。
收集50个CKMB阴性样本用实施例4和对比例3以及对比例4提供的CKMB试剂盒进行检测，比较阳性率的结果
表5.特异性评估
Figure BDA0003439280620000142
Figure BDA0003439280620000151
Figure BDA0003439280620000161
实验结果表明本发明提供的试剂盒(实施例4)在检测正常样本出现假阳性的情况为0，而免疫抑制法试剂盒(对比例3)在检测中假阳性的概率达到了6％，说明本发明提供的CKMB试剂在特异性方面性能优良。
2.精密度
采用本发明提供的CKMB试剂检测低值样本和高值样本个10次，计算Mean、SD、CV。对该试剂的精密度进行评估，结果如表6、7所示。
表6.实施例4精密度
Figure BDA0003439280620000162
Figure BDA0003439280620000171
表7.对比例3精密度
Figure BDA0003439280620000172
试验结果表明，实施例4提供的CKMB试剂盒在精密度上要优于市场上的免疫抑制法的CKMB试剂盒。
验证例5：
脂质体微球较乳胶微球灵敏度更高。
测试方法同验证例2所述步骤一样，实验结果如下：
表8.灵敏度结果，单位(ng/mL)
Figure BDA0003439280620000173
Figure BDA0003439280620000181
Figure BDA0003439280620000191
实验结果表明，本发明提供的CKMB试剂盒(实施例4)灵敏度可以到达0.25ng/mL，而对比例5提供的只能达到2ng/mL，说明本发明试剂盒和对比例5在灵敏度方面大有提升。
验证实验例7：稳定性
本实验目的是检测本发明提供的试剂盒37℃稳定性。
将实施例4和对比例6提供的试剂盒放置37℃的烘箱3天，三天后取出测量质控。
机器：日立7170自动生化分析仪。
实验结果：
表9. 37℃下L质控结果
Figure BDA0003439280620000192
表10 37℃下H质控结果
Figure BDA0003439280620000193
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种测定血清中肌酸激酶同工酶含量的检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2及校准品；
所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系；
所述试剂R2为交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒溶液；
所述校准品包括肌酸激酶同工酶、缓冲液、保护剂、防腐剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括的组分及含量如下：
Figure FDA0003439280610000011
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括的组分及含量如下：
Figure FDA0003439280610000012
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品包括的组分及含量如下：
Figure FDA0003439280610000013
Figure FDA0003439280610000021
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述交联肌酸激酶同工酶抗体的致敏颗粒包括：鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1交联到纳米脂质体颗粒一的表面形成的单抗1致敏颗粒；以及，鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2交联到纳米脂质体颗粒二的表面形成的单抗2致敏颗粒；所述纳米脂质体颗粒一的直径为60-86nm，所述纳米脂质体颗粒二的直径为350-480nm。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中单抗1致敏颗粒与单抗2致敏颗粒的含量比例为1：3-2：3。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米脂质体颗粒一的制备方法包括如下步骤：
A、将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的悬浮液膜材，悬浮液膜材中卵磷脂浓度为30-50mg/L；
B、PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液和/或季胺盐形成混合缓冲液；
C、将步骤A悬浮液膜材注入混合缓冲液，超声处理并过滤，获得所述纳米脂质体颗粒一。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米脂质体颗粒二的制备方法包括如下步骤：
1)、将卵磷脂和胆固醇溶于无水乙醇，超声处理，形成稳定的悬浮液膜材，悬浮液膜材中卵磷脂浓度为70-100mg/L；
2)、PBS缓冲液置于容器中水浴，加入亚硫酸钠溶液和/或季胺盐形成混合缓冲液；
3)、将步骤1)悬浮液膜材注入混合缓冲液，超声处理并过滤，获得所述纳米脂质体颗粒一。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述单抗1致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、取纳米脂质体颗粒一离心，弃上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；
S2、复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后搅拌，然后离心，弃上清，离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体1，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗1致敏颗粒。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述单抗2致敏颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、取纳米脂质体颗粒二离心，弃上清液后，用缓冲液复悬，超声分散，得复悬液；
S2、复悬液中加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混匀后搅拌，然后离心，弃上清，离心后的沉淀用缓冲液溶解悬浮，超声，加入鼠抗人肌酸激酶同工酶抗体2，搅拌后离心；离心后的沉淀悬浮于封闭液中，超声，即得所述单抗2致敏颗粒。
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