CN114457167B - 一种荧光定量pcr检测双壳贝类源性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法，首先称取样品，对样品进行DNA提取，并通过引物进行PCR扩增，再将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到电泳条带，将目的条带切割回收送测序公司测序，测序结果输入NCBI网站进行BLAST比对，得到物种信息和相关目的基因序列，将每个双壳贝类的目的基因序列下载，利用DNAMAN软件进行比对得到已获得贝类品种的相同基因序列，针对上述目的序列设计引物和Taqman探针，送公司合成引物和探针，利用市售贝类样品进行引物探针验证，双壳贝类可检出。本发明对样品进行DNA提取，利用特异性引物探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线和CT值判定样品中是否含有双壳贝类成分，能够有效对食品中的贝类成分进行种类检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品种类检测技术领域,更具体的说是涉及一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法。
背景技术
近年来，随着水产品消费市场持续扩大，水产制品的食品安全问题层出不穷，水产品错误标识误导消费者，加工食品掺杂掺假现象屡有发生。利用实时荧光PCR技术国家已制定了针对部分水产品源性成分的检测标准，如SN/T 3589-2013《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法实时荧光PCR法》、SN/T 1961.10-2013《出口食品过敏原成分检测第10部分：实时荧光PCR方法检测虾蟹成分》等，这些标准只能鉴别水产制品中是否含有鱼、虾、蟹的成分，对于贝类成分尚无有效的检测手段。
本研究旨在利用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定双壳帘蛤科贝类成分，也可以为商业双壳贝类的物种识别和真实性测试提供强有力的评估方法，解决源性成分掺杂掺假和标签错误标识问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够有效检测贝壳种类的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，检测步骤如下：
1)称选样品；
2)对样品进行DNA提取：称取0.3g已制备好的样品于2mL离心管中，加入1000μLCTAB缓冲液和40μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；12000g离心10min，转移1mL上清液于2mL离心管中；加500μL酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25：24:1，强烈振荡，12000g离心15min；吸取上清液到新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min；去除上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；加入5μLRNA酶溶液，37℃30min。加入200μL三氯甲烷-异戊醇(24:1)，强烈振荡，12000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min；弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12000g离心1min。弃上清液，晾干；加入50μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀；
3)利用通用引物对DNA提取液进行PCR扩增，得到扩增产物；
4)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳得到电泳条带，并选择目的条带；
5)将目的条带切割回收送测序公司测序；
6)测序结果输入NCBI网站进行BLAST比对，得到物种信息和相关目的基因序列，将每个双壳贝类的目的基因序列下载；
7)利用DNAMAN软件进行比对得到已获得贝类品种的相同基因序列，此序列为检测双壳贝类的目的序列；
8)针对上述目的序列设计引物和Taqman探针，送公司合成引物和探针；
9)利用市售贝类样品进行引物探针验证，双壳贝类可检出双壳贝类特异序列。
优选的，在上述一种一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法，所述步骤9)中的双壳贝类特异序列CTGAGACAACTCTATGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACACACTGAACATCGACACCTTGAACGCACATTGCGGCTCTGGCTCACTGCCAGAGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCGAACAAGTCATCG。
优选的，在上述一种一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法，所述步骤9)中的引物探针序列为：
F：5’CTATGCGGTGGATCACTCGG 3’；
R：5’CGCAATGTGCGTTCAAGGTG3’；
P：FAM-5’ATGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGA3’-TAMRA。
优选的，在上述一种一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法，所述所述步骤9)中引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下：引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下：
1)样品DNA提取，测定DNA的浓度和纯度。DNA纯度A260/A280在1.7～1.9之间为适宜，将DNA浓度稀释到10～100ng/μL；
2)荧光定量PCR体系和程序如下：
体系：2×PCR缓冲液，12.5μL；正向引物(10μM)，0.75μL；反向引物(10μM)，0.75μL；荧光探针(10μM)，0.5μL；DNA模板，2μL；RNase-Free ddH2O，补足至25μL；
程序：为95℃15min预变性；95℃变性1sec，60℃退火30sec，40个循环；
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照，样品及对照均设两个重复，Ct值取两个重复的平均值作为最终结果；
3)结果判断：
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0；
(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0；
(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；
(d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；
在符合上述的情况下，被检样品进行检测时：
如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性；
如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性；
如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值仍≥40.0，则判定被检样品阴性。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法，本发明对样品进行DNA提取，利用特异性引物探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线和CT值判定样品中是否含有双壳贝类成分，能够有效对食品中的贝类成分进行种类检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明，检测步骤如下：
1)称选样品，样品为扇贝、花蛤(两种)、黄蛤、蛏子、青蛤等；
2)对样品进行DNA提取：称取0.3g已制备好的样品于2mL离心管中，加入1000μLCTAB缓冲液和40μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；12000g离心10min，转移1mL上清液于2mL离心管中；加500μL酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25：24:1，强烈振荡，12000g离心15min；吸取上清液到新的2mL离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min；去除上清液，用预热至65℃的TE缓冲液溶解DNA；加入5μLRNA酶溶液，37℃30min。加入200μL三氯甲烷-异戊醇(24:1)，强烈振荡，12000g离心15min；吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000g离心10min；弃去上清液，70％乙醇洗涤一次，12000g离心1min。弃上清液，晾干；加入50μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀；
3)利用通用引物对DNA提取液进行PCR扩增，得到扩增产物；
4)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳得到电泳条带，并选择目的条带；
5)将目的条带切割回收送测序公司测序；
6)测序结果输入NCBI网站进行BLAST比对，得到物种信息和相关目的基因序列，将每个双壳贝类的目的基因序列下载；
7)利用DNAMAN软件进行比对得到已获得贝类品种的相同基因序列，此序列为检测双壳贝类的目的序列；
8)针对上述目的序列设计引物和Taqman探针，送公司合成引物和探针；
9)利用市售贝类样品进行引物探针验证，双壳贝类可检出双壳贝类特异序列。
为了进一步优化上述技术方案，步骤9)中的双壳贝类特异序列CTGAGACAACTCTATGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACACACTGAACATCGACACCTTGAACGCACATTGCGGCTCTGGCTCACTGCCAGAGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCGAACAAGTCATCG。
引物探针序列为：
F：5’CTATGCGGTGGATCACTCGG 3’；
R：5’CGCAATGTGCGTTCAAGGTG3’；
P：FAM-5’ATGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGA3’-TAMRA。
为了进一步优化上述技术方案，引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下：引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下：
1)样品DNA提取，测定DNA的浓度和纯度。DNA纯度A260/A280在1.7～1.9之间为适宜，将DNA浓度稀释到10～100ng/μL；
2)荧光定量PCR体系和程序如下：
体系：2×PCR缓冲液，12.5μL；正向引物(10μM)，0.75μL；反向引物(10μM)，0.75μL；荧光探针(10μM)，0.5μL；DNA模板，2μL；RNase-Free ddH2O，补足至25μL；
程序：为95℃15min预变性；95℃变性1sec，60℃退火30sec，40个循环；
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照，样品及对照均设两个重复，Ct值取两个重复的平均值作为最终结果；
3)结果判断：
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0；
(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0；
(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；
(d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0；
在符合上述的情况下，被检样品进行检测时：
如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性；
如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性；
如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值仍≥40.0，则判定被检样品阴性。
为了进一步优化上述技术方案，利用此Taqman探针可以检测包括硬壳蛤Mercenaria mercenaria、小眼花帘蛤Ruditapes variegatus、菲律宾帘蛤Ruditapesphilippinarum、薄片镜蛤Dosiniacorrugata、青蛤Cyclina sinensis、中国蛤蜊Mactrachinensis、缢蛏Sinonovacula constricta等在内的大部分双壳贝类，关键保护内容上述红色字体标注的引物探针序列，其他如DNA提取步骤、荧光定量PCR程序等为普遍方法步骤已有报道。
为了进一步优化上述技术方案，对样品进行DNA提取，利用特异性引物探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线和CT值判定样品中是否含有双壳贝类成分，能够有效对食品中的贝类成分进行种类检测。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 秦皇岛市食品药品检验中心
<120> 一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctatgcggtg gatcactcgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcaatgtgc gttcaaggtg 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaagagcg cagccagctg cgtga 25
<210> 4
<211> 170
<212> DNA
<213> 双壳贝类
<400> 4
gacaactcta tgcggtggat cactcggctc gtgcgtcgat gaagagcgca gccagctgcg 60
tgaattaatg tgaattgcag gacacactga acatcgacac cttgaacgca cattgcggct 120
ctggctcact gccagagcca cgcctgtccg agggtcggcg aacaagtcat 170
Claims (3)
1.一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法,其特征在于,检测步骤如下:
对市售贝类样品进行DNA提取，利用特异性引物探针进行实时荧光定量PCR扩增，根据扩增曲线和CT值判定样品中是否含有双壳贝类成分；所述引物探针序列为:
F:5’CTATGCGGTGGATCACTCGG3';
R:5' CGCAATGTGCGTTCAAGGTG3';
P:FAM-5’ATGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGA3'-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法,其特征在于,步骤中的双壳贝类特异序列CTGAGACAACTCTATGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGA
TGAAGAGCGCAGCCAGCTGCGTGAATTAATGTGAATTGCAGGACACACTGAACATCGACACCTTGAACGCACATTG
CGGCTCTGGCTCACTGCCAGAGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCGAACAAGTCATCG。
3.根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR检测双壳贝类源性成分的方法,其特征在于，步骤中引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下:引物探针检测双壳贝类成分的具体步骤如下:
1)样品DNA提取,测定DNA的浓度和纯度；DNA纯度A260/A280在1.7～1.9之间为适宜,将DNA浓度稀释到10～100ng/uL;
2)荧光定量PCR体系和程序如下:
体系:2X PCR缓冲液,12.5uL;正向引物(10uM),0.75uL;反向引物(10uM),0.75uL;荧光探针(10uM),0.5uL;DNA模板,2uL;RNase-FreeddH20,补足至25uL;
程序:为95℃15min预变性;95℃变性1sec,60℃退火30sec,40个循环;
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照，样品及对照均设两个重复,ct值取两个重复的平均值作为最终结果;
3)结果判断:
以下条件有一条不满足时,实验视为无效:
(a)空白对照:无荧光对数增长,相应的Ct值>40.0;
(b)阴性对照:无荧光对数增长,相应的Ct值>40.0;
(c)阳性对照:有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0;
(d)内参照:有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0;
在符合上述的情况下,被检样品进行检测时:
如Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;
如Ct值≥40.0,则判定为被检样品阴性;
如35.0<Ct值<40.0,则重复一次；如再次扩增后Ct值仍<40.0,则判定被检样品阳性;如再次扩增后Ct值仍≥40.0,则判定被检样品阴性。
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| 双壳贝类DNA分类：贻贝科和牡蛎科DNA条形码及栉江珧隐存种研究;刘君;中国博士学位论文全文数据库农业科技辑(第01(2013)期);D052-10 * |
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