CN114452408A - 靶向枯否细胞用于治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。将质粒DNA编码的CRISPR/Cas基因编辑系统通过该重组载体递送到枯否细胞中，可对枯否细胞进行原位基因编辑和修饰。通过此方法敲除枯否细胞c‑Maf和MafB基因表达，可以显著增强枯否细胞对转移性肝脏肿瘤的杀伤力，达到治疗肝转移癌的目的。

Description

靶向枯否细胞用于治疗癌症的药物组合物
技术领域
本发明属于药物递送领域，特别是涉及靶向枯否细胞用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物。
背景技术
肝脏独特的双重血供和免疫耐受特性使得肝脏成为肿瘤转移的主要场所。肝转移癌不但易发难治，且对当前以T细胞为主的肿瘤免疫疗法响应较差，因而亟需开发新型治疗方法。
Kupffer细胞(枯否细胞)作为肝脏驻留的巨噬细胞，占肝脏细胞总数的15％，是机体中数目最多的一群组织巨噬细胞，对肝脏的免疫耐受微环境起着关键的调控作用。Kupffer细胞在肿瘤肝转移早期可以通过大量吞噬清除循环肿瘤细胞行使免疫监视功能，而在肿瘤肝转移后期发生两种截然不同的功能极化：M1(经典)型和M2(替代)型。M1型Kupffer细胞有促进炎症和杀肿瘤的特性；M2型Kupffer细胞有抑制炎症和促肿瘤的特性。因此，靶向枯否细胞进行基因编辑，重塑其免疫功能，对肝转移癌治疗具有广阔前景。
当前研究主要通过病毒、脂质体、纳米材料或者真菌葡聚糖壳等物质作为载体，靶向递送siRNA、mRNA或质粒DNA等分子对肝脏巨噬细胞实现原位基因编辑。然而，这些方案普遍制备成本较高，操作流程较繁琐，大规模工业化生产难度较大；尤为重要的是体内作用机制复杂，靶向Kupffer细胞的特异性并不高。
因此，迫切需要研发特异性靶向枯否细胞并可高效实现基因编辑修饰的递送方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供用于递送药物组合物至枯否细胞的载体，其特征在于，所述载体为细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli。
在一些实施方案中，所述药物组合物选自用于编辑c-Maf和MafB基因的含有CRISPR/Cas9或CRISPR/CasΦ系统的质粒DNA。
另一方面，本发明提供特异性靶向枯否细胞的递送载体，其特征在于，所述载体为细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli。
另一方面，本发明提供用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述重组载体选自用于基因编辑目的的CRISPR载体，如pX459和pPP441；或用于RNA干扰目的的shRNA载体，如pLKO.1，以及用于基因过表达的真核或原核表达载体，如pEGFPC3或pCM29。
在一些实施方案中，所述目标基因为c-Maf和MafB。
在一些实施方案中，所述重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框。
在一些实施方案中，所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子。
在一些实施方案中，所述重组载体上还含有CRE酶的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述重组载体上还含有多克隆位点。
另一方面，本发明提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备促进枯否细胞由M2到M1功能转化的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备递送药物组合物至枯否细胞的载体中的用途。
另一方面，本发明提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌菌株，如Clearcoli在制备用于促进枯否细胞的增殖的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变的大肠杆菌菌株，如Clearcoli，在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明提供治疗癌症特别是癌症肝转移的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的大肠杆菌，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肺癌和结肠癌。
另一方面，本发明提供对枯否细胞进行原位基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括向枯否细胞施用有效量的大肠杆菌，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌表达红色荧光蛋白tdTomato和绿色荧光蛋白zsGreen1。
定义
枯否细胞：即Kupffer细胞，是肝脏中的数目最多的驻留型巨噬细胞，占肝脏总细胞数的15％，具有选择性捕获、吞噬和清除血液中冗余毒害物质，特别是细菌等病原微生物的功能。
CRIg：Complement receptor of the immunoglobulin family，又名V-set andimmunoglobulin domain-containing protein 4(VSIG4)，在肝脏枯否细胞上特异性高表达。具有补体受体、微生物模式识别和T细胞负调控等多重功能。
F4/80：又名Adhesion G protein-coupled receptor E1，基因名adgre1。是巨噬细胞表面表达的一种糖蛋白。一般作为标记巨噬细胞的分子标记。
TIM4：是英文T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein4的缩写。磷脂酰丝氨酸的受体，可参与T细胞的激活调控。在肝脏中特异性地表达在枯否细胞表面，可作为区分胚胎来源的枯否细胞和骨髓来源巨噬细胞的标志。
普通大肠杆菌：在本发明中指应用于基因工程中的非致病性大肠杆菌，如Top10等。
低毒大肠杆菌：本发明中指，相较于基因工程大肠杆菌，能够引起更低的免疫应答反应和肝损伤的非致病性大肠杆菌，如Clearcoli等。
sgRNA：是英文small guide RNA的缩写。在CRISPR/Cas基因编辑系统中，能够引导Cas9切割特定的含有PAM系列(NGG)的双链DNA，从而引发真核生物双链DNA损伤修复，实现基因编辑。
Cas9酶：是CRISPR/Cas系统中的核心成分，本发明中所用Cas9为SpCas9(化脓性链球菌Cas9)，能够在37℃的真核生物细胞环境中实现双链DNA切割，其可以与sgRNA的发卡结构结合，在特定含有PAM序列的DNA目标序列实现切割。
CRE酶：即Cre重组酶，是英文Cyclization Recombination Enzyme的缩写，CRE是噬菌体P1的I型拓扑异构酶，可识别并催化两个LoxP位点发生同源重组。广泛应用于基因诱导敲除小鼠的制备中。
CasΦ酶：CRIPSR/CasΦ基因编辑系统的DNA切割酶。相比Cas9，体积更小(一半大小)，PAM序列更广泛(TBN，B为除A之外的任意脱氧核糖核苷酸，N为任意脱氧核糖核苷酸)。主要包括CasΦ-1，CasΦ-2和CasΦ-3，本发明中应用的是CasΦ-2。
Clearcoli：以非致病性大肠杆菌BL21为蓝本，其LPS(细菌脂多糖)的两个侧链被删除，导致Clearcoli激活TLR4/MD-2信号通路的能力下降，不能引起强免疫应答反应，因此具有很低的毒性。
pX459载体：该载体为sgRNA与spCas9共表达质粒。采用U6启动子表达sgRNA序列；采用鸡的β-肌动蛋白启动子表达spCas9；可在哺乳动物细胞中实现基因编辑。
pPP441载体：该载体为sgRNA和CasΦ-2共表达质粒。采用U6启动子表达sgRNA序列；采用鸡的β-肌动蛋白启动子表达CasΦ-2；可在哺乳动物细胞中实现基因编辑。
pLKO.1载体：用于在哺乳动物细胞中表达shRNA的载体。该载体以U6启动子表达shRNA，并且带有慢病毒组装元件，可以用于慢病毒包装体系。该载体同时还有嘌呤霉素抗性，可以用于表达筛选。
pEGFPC3载体：用于在哺乳动物细胞内表达目的基因的载体。该载体上带有CMV的启动子和GFP绿色荧光蛋白基因，可以在哺乳动物细胞中表达GFP标签的融合蛋白，可用于体内追踪目标蛋白。
pCM29载体:该载体含有sfGFP绿色荧光蛋白基因和pSarA启动子，可在大肠杆菌表达sfGFP标签的融合蛋白，也可替换sfGFP基因表达目的蛋白。
c-Maf和MafB：两者同属于Maf转录因子家族，能够促进巨噬细胞M2型极化，从而抑制炎症的发生与发展。c-Maf和MafB双基因缺失的巨噬细胞可以在M-CSF等细胞因子刺激下大量增殖，并且不改变巨噬细胞原本的功能表型。一般情况下，肿瘤组织会表达和分泌一些细胞因子，如M-CSF等来形成特定的微环境，维持自身的生存。如果能在肝脏原位实现对c-Maf和MafB基因的敲除/敲低，不仅可以促进枯否细胞的M1极化，增强其对肿瘤的杀伤；而且在M-CSF的作用下，还可以刺激M1极化的枯否细胞增殖，从而进一步增强对肿瘤的杀伤效果。
有益效果
细菌容易培养，成本低廉，可操作性强，非常适合大规模操作。本发明利用血液循环的大肠杆菌主要被肝脏枯否细胞捕获并清除的特性，应用低毒的大肠杆菌作为载体，将质粒DNA编码的CRISPR/Cas基因编辑系统递送到枯否细胞中，可对该细胞进行原位基因编辑和修饰。通过此方法敲除枯否细胞c-Maf和MafB基因表达，可以显著增强枯否细胞对转移性肝脏肿瘤的杀伤，达到治疗肝转移癌的目的。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1示出肝脏活体成像检测本发明中细菌递送DNA质粒在活体肝脏枯否细胞的表达情况，其中：图1A，不同剂量大肠杆菌递送DNA质粒，在活体肝脏枯否细胞的情况；图1B，对A中表达zsGreen蛋白枯否细胞比例的统计，***P<0.001。
图2示出本发明中对比血液感染普通大肠杆菌和低毒大肠杆菌对小鼠的毒性，其中：图2A，检测低毒大肠杆菌和普通大肠杆菌尾静脉感染1×109剂量下的七天生存率；图2B，对比低毒大肠杆菌和普通大肠杆菌感染招募肝脏中性粒细胞的情况，***P<0.001；图2C，感染普通大肠杆菌(Top10)和低毒大肠杆菌(Clearcoli)的小鼠血清中ALT水平，***P<0.001；图2D，感染普通大肠杆菌(Top10)和低毒大肠杆菌(Clearcoli)的小鼠血清中和AST水平，**P<0.01；图2E，感染Top10和Clearcoli的小鼠肝脏白介素6(Il6)的表达情况，**P<0.01；图2F，感染Top10和Clearcoli的小鼠肝脏肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达情况，***P<0.001；图2G，感染Top10和Clearcoli的小鼠肝脏趋化因子CCL2的表达情况，***P<0.001。
图3示出本发明改造的用于肝脏枯否细胞靶向基因编辑的双sgRNA表达框载体pX459-2U6-SapI-BsaI-CRE(图3A)和pPP441-2U6-SapI-BsaI-CRE(图3B)图谱。
图4示出应用本发明递送CRISPR-Cas质粒编辑肝脏枯否细胞基因的效果(CRIg、TIM4和F4/80)，其中：图4A，应用CRISPR-Cas质粒递送编辑肝脏枯否细胞CRIg蛋白基因的效果(1×109CFU/只)；图4B，应用CRISPR-Cas质粒递送分别编辑肝脏枯否细胞TIM4和F4/80蛋白基因的效果(1×109CFU/只)；图4C，对CRIg基因的编辑效率的统计学分析，***P<0.001；图4D，对TIM4基因编辑效率的统计学分析，***P<0.001；图4E，对F4/80基因编辑效率的统计学分析，***P<0.001。
图5示出编辑CRIg的时间维持效果，其中：图5A，CRIg在第7天、第30天和第45天的编辑效果检测(1×109CFU/只)；图5B，对A中CRIg蛋白基因的编辑效率的统计学分析，***P<0.001，ns：无显著差异。
图6示出应用本发明递送CRISPR-Cas质粒同时编辑枯否细胞多个基因的效果检测，其中：图6A，CRIg和F4/80两个基因同时编辑的效果，(TIM4标记枯否细胞，1×109CFU/只)；图6B，对A中CRIg蛋白基因编辑效率的统计学分析，***P<0.001；图6C，对A中F4/80蛋白基因编辑效率的统计学分析，***P<0.001。
图7示出本发明中检测黑色素瘤肝转移小鼠模型中低毒大肠杆菌递送c-Maf和MafB编辑工具对两个分子基因的剪切效果，其中：图7A：黑色素瘤肝转移小鼠模型中细菌同样可作为递送质粒到枯否细胞的载体；图7B，实时RT PCR检测c-Maf和MafB在黑色素瘤肝转移小鼠模型中基因编辑效果的策略模式图；图7C，按照图7B中的策略检测c-Maf和MafB的编辑效果的统计学分析，**P<0.01；***P<0.001。
图8示出本发明预防黑色素瘤肝转移的效果和对其早期肝转移灶的治疗效果，其中：图8A，本发明预防黑色素瘤肝转移的效果检测；图8B，对图8A中小鼠肝重和肿瘤面积的统计学分析，***P<0.001；图8C，本发明对黑色素瘤早期肝转移灶的治疗效果；图8D，对图8C中小鼠肝重和肿瘤面积的统计学分析，***P<0.001。
图9示出本发明对晚期黑色素瘤肝脏转移灶的治疗效果检测，其中：图9A，本发明治疗晚期黑色素瘤肝脏转移灶的效果；图9B，对A中对照组(空载体)和治疗组(c-Maf&MafB基因编辑)小鼠肝重的统计学分析，***P<0.001；图9C，利用本发明治疗黑色素瘤的肝转移灶，对小鼠生存率的影响，***P<0.001。
图10示出本发明对晚期结肠癌肝脏转移灶的治疗效果检测，其中：图10A，本发明治疗晚期结肠癌肝脏转移灶的效果；图10B，对A中对照组(空载体)和治疗组(c-Maf&MafB基因编辑)小鼠肝重的统计学分析，*P<0.05；图10C，利用本发明治疗结肠癌的肝转移灶，对小鼠生存率的影响，*P<0.05。
图11示出本发明对晚期肺癌肝脏转移灶的治疗效果检测，其中：图11A，本发明治疗晚期肺癌肝脏转移灶的效果；图11B，对图11A中对照组(空载体)和治疗组(c-Maf&MafB基因编辑)小鼠肝重和肿瘤面积的统计学分析，**P<0.01，***P<0.001。
图12示出利用本发明治疗肿瘤肝转移灶，对肝脏枯否细胞数量和增殖情况的检测，其中：图12A，肝脏活体成像检测本发明治疗肿瘤肝转移灶所引起的枯否细胞(TIM4+F4/80+)对肿瘤组织的浸润及其数量变化；图12B，对图12A中枯否细胞数量的统计学分析，***P<0.001；图12C，流式细胞术检测利用本发明治疗肿瘤肝转移灶时，肝脏枯否细胞(TIM4+F4/80+)的比例变化情况；图12D，对图12C中枯否细胞数量的统计学分析，*P<0.05；图12E，流式细胞术检测利用本发明治疗肿瘤肝转移灶时，肝脏驻留枯否细胞的增殖情况(KI67表达)。
图13示出利用本发明治疗肿瘤肝转移灶，对肝脏枯否细胞M1/M2极化状态的检测，其中：图13A，流式细胞术检测利用本发明治疗肿瘤肝转移灶时，肝脏枯否细胞(TIM4+F4/80+)的M1(CD80表达)和M2(CD206表达)极化情况；图13B，图13A中CD80和CD206表达量的统计学分析，**P<0.01；图13C，实时RT PCR检测其他M1极化状态分子标志[iNOS、MCP1(又名CCL2)、TNFα]的统计学分析，*P<0.05，**P<0.01；图13D，实时RT PCR检测其他M2极化状态分子标志(FIZZ1、ARG1、MRC2)的统计学分析，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：细菌递送DNA质粒在活体肝脏枯否细胞中的表达检测
1.pX459-zsGreen质粒的构建
以pX459载体(addgene，#78623)为蓝本，用限制性内切酶AgeI(NEB，#R0552S)对载体进行切割，使载体线性化；然后，利用大肠杆菌重组酶Exnase II(Vazyme，#C214)将含有起始密码子ATG和终止密码子TGA的zsGreen1编码DNA序列(如SEQ ID NO:39所示)重组到载体上，得到zsGreen1替代Cas9表达的pX459-zsGreen质粒，从而可以以zsGreen1为报告基因探究pX459载体及其编码蛋白是否能在枯否细胞内表达。其原理是：pX459-zsGreen质粒由真核启动子驱动，在细菌中不会表达，通过对小鼠注射含有该质粒的细菌，如果质粒DNA被成功递送到枯否细胞内并获得表达，则zsGreen1作为报告基因可在枯否细胞中检测到，在显微镜下可以看到枯否细胞中有绿色荧光出现。
2.小鼠肝脏活体成像检测zsGreen1的表达情况
将pX459-zsGreen质粒转化到大肠杆菌Top10(TransGen Biotech，CD101-01)中，然后分别将1×108和1×109CFU剂量的大肠杆菌通过尾静脉注射到小鼠的血液中。24小时后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma，T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma，721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg的Alexa
Figure BDA0003505704370000081
647荧光基团偶联的F4/80抗体(Biolegend，克隆号BM8)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞。接着，沿小鼠腹中线剪开皮肤与肌肉，暴露出肝脏并剪断肝脏与胸隔膜之间的连接，将小鼠侧卧在带有光学成像窗口的托盘上，游离出肝脏左叶，用无尘纸吸附至其表面，轻轻拖曳并固定肝脏左叶到光学成像窗口上，将托盘置于显微镜的载物台上，调整好视野、激光强度、曝光度和物镜的倍数，进行活体肝脏成像。结果如图1A和1B所示，结果显示细菌成功将质粒DNA递送至活体小鼠肝脏的枯否细胞中并获得表达：低剂量细菌注射(108CFU)时有约30％的枯否细胞表达zsGreen1荧光蛋白；细菌剂量增加至109CFU，可使约65％的枯否细胞表达zsGreen1。
实施例2：对比使用普通大肠杆菌(Top10)和低毒大肠杆菌(Clearcoli)的安全性
1.对比低毒大肠杆菌与普通大肠杆菌血液注射7天生存率
为了降低细菌注射所引起的免疫应答反应，我们选取了LPS(lipopolysaccharide，细菌磷酸脂多糖)突变的低毒大肠杆菌替代普通大肠杆菌作为质粒DNA的递送载体。通过小鼠的尾静脉，分别将1×109CFU的大肠杆菌Top10或Clearcoli(Lucigen，#60810-1)(或称为
Figure BDA0003505704370000091
BL21(DE3))注射到小鼠的血液中，观察并记录七天内小鼠的生存情况，如图2A所示：Top10尾静脉注射的小鼠七天生存率为80％左右，而Clearcoli尾静脉注射的小鼠七天生存率则提高到100％。
2.对比低毒大肠杆菌与普通大肠杆菌血液注射所激发的炎症细胞因子表达
分别取Top10和Clearcoli血液感染24小时后的小鼠肝组织，每100mg组织加入1mLTrizol(Vazyme，R401-01)用匀浆器(Homogenizer)将组织分散为匀浆状，冰上放置5min。向匀浆液中加入200μL氯仿，震荡混匀，冰上放置5min。12000g，4℃离心15min。吸取上层水相，并加入500μL异丙醇，冰上放置10min后，12000g，4℃离心10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇，7500g，4℃离心5min。弃上清晾干后，加入100μL DEPC水(生工生物，B501005)，55℃溶解5min，并测定RNA纯度和浓度。取1μg纯化的RNA加入4μL的4×gDNA wiper Mix(Vazyme，R323-01)，加DEPC水至总体积16μL，42℃反应2min。再加入4μL 5×HiScript III qRTSuperMix(Vazyme，R323-01)，37℃反应15min，在85℃反应5sec，得到RNA的逆转录产物。取2μL逆转录产物，分别加入0.5μL正向和反向引物(浓度10μM)，10μL 2×SYBR Mix(Vazyme，Q711-02)，加水至总体积20μL，按照说明书设置荧光定量PCR仪程序(罗氏LightCycle 96)，进行PCR反应，得到反应的Ct值，计算相对表达量，如图2E、2F和2G所示：相较于Top10注射，相同剂量Clearcoli注射使得白介素6(IL-6)(检测引物如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示)水平降低了约2.25倍；肿瘤坏死因子α(TNF-α)(检测引物如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示)降低了5倍；炎性趋化因子CCL2水平降低了约13倍(检测引物如SEQ ID NO:23和SEQID NO:24所示)。鉴于IL-6、TNF-α和CCL2是最经典的炎症相关细胞因子，这些结果说明Clearcoli注射激发的炎症应答远低于普通大肠杆菌。
3.流式细胞术对比低毒大肠杆菌与普通大肠杆菌血液感染肝脏中中性粒细胞的水平
分别取Top10和Clearcoli血液感染24小时后的小鼠肝组织，放入GentleMACs C管(Miltenyi Biotec,货号130096334)中，用手术剪将肝脏组织剪碎(碎片接近1mm3，剪100次左右)，每管加入提前预热的10mL胶原酶(0.5mg/mL，Sigma，C0130)混合液，然后将C管置于GentleMACs dissociation上，选择lung-02程序，运行1次，接着放入37℃摇床，200rpm，20min。消化完成之后，涡旋振荡使其均匀分散，用100μm滤膜过滤至50mL离心管中，400g×5min，4℃离心。弃上清，加入1mL红细胞裂解液(Biolegend，货号420302)重悬，冰上避光裂解5min，加入冰冷1×PBS至10mL终止裂解，400g×5min，4℃离心。弃上清，加入1mL冰冷1×PBS重悬，轻轻吹打为单细胞悬液，并于显微镜下血球计数板计数。取1×106的细胞加入0.5μg鼠的CD16/32抗体(Biolegend，克隆号93)封闭，冰上放置20min。加入抗体混合液：AC7-CD45(Biolegend，克隆号30-F11)，PC7-CD11b(Biolegend，克隆号M1/70)，488-Ly6G(Biolegend，克隆号1A8)，避光冰上放置30min。加入100μL PBS，400g，4℃离心5min，并重复一次。弃上清，加入200μL PBS重悬细胞，过200目的筛网后转移到流式上样管中，上机前用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)(100ng/mL，Biosharp，BL105A)标记5min，以区分活细胞和死细胞。上机(BD或BECKMAN流式仪)，调好电压和补偿，并收集数据。如图2B所示：24小时后，Top10的尾静脉注射引起肝脏中性粒细胞的水平升高了25倍左右(与正常的对照组相比)；而Clearcoli的尾静脉注射仅使肝脏中性粒的水平升高了8倍左右，提示Clearcoli招募的中性粒细胞的水平远小于普通大肠杆菌，进一步说明Clearcoli比普通大肠杆菌所激发的炎症应答更低。
4.对比低毒大肠杆菌与普通大肠杆菌血液感染所引起的肝损伤情况(AST/ALT测试)
分别将1×109CFU的Top10和Clearcoli注射到小鼠的血液中，24小时后，取小鼠血液100μL，室温静置2小时，6500g，室温离心5min。取上层的血清5μL，加入20μL的AST(谷草转氨酶)基质(南京建成，C010-2-1)或ALT(谷丙转氨酶)基质(南京建成，C009-2-1)，以5μL双蒸水作为空白对照，混匀后放入37℃反应30min。反应结束后，加入20μL的显色液(南京建成，C009-2-1)，混匀后放入37℃反应20min。加入200μL终止液(南京建成，C009-2-1)，室温反应15min，终止反应。在波长510nm用酶标仪测定OD值，计算绝对OD值(样品OD值-对照OD值)，然后根据标准曲线(根据说明书提前测定)计算出样品AST或ALT的水平，如图2C、2D所示：Top10尾静脉注射，血清中的AST水平为125U/L，ALT水平为120U/L；而Clearcoli尾静脉注射，血清中的AST水平为25U/L，ALT水平为27U/L。鉴于血清中ALT和AST水平上升是肝细胞死亡和肝损伤的重要指标，这些结果说明Clearcoli相对于Top10几乎不会诱发肝脏组织损伤。
实施例3：pX459-2U6-SapI-BsaI-CRE和pPP441-2U6-SapI-BsaI-CRE载体构建
1.pX459(CRISPR/Ca9系统)改造：
以pX459(addgene，#78623)为蓝本，首先用限制性内切酶BsiWI(NEB，R0553S)和BsaI(NEB，R3733S)(两个位点在嘌呤霉素抗性基因上)对载体进行双酶切，切除嘌呤霉素抗性基因，再利用大肠杆菌重组酶Exnase II(Vazyme，C214)将CRE酶(用以消除载体上多余的BsaI酶切位点，其序列如SEQ ID NO：40所示)重组到载体上，从而得到嘌呤霉素被替换成CRE酶的载体；然后，在CMV增强子前的限制性内切酶位点XbaI(NEB,R0145S)和KpnI(NEB,R0142S)之间利用T4DNA连接酶(TIANGEN，NG201)插入多克隆位点(HindIII/XhoI/BamHI/SalI，其序列如SEQ ID NO：41所示)，再在XhoI(NEB，R0146S)和KpnI之间插入U6-BsaI-gDNA支架的sgRNA表达框(其序列如SEQ ID NO：42所示)；接着，用BbsI(NEB，R0539S)和XbaI双酶切，使得载体由环状变为线性，利用大肠杆菌重组酶Exnase II将另一U6-SapI-gDNA支架的sgRNA表达框(其序列如SEQ ID NO：44所示)重组到载体上，从而得到可以同时表达两个独立sgRNA、Cas9酶和CRE酶的表达体系。该体系可以同时表达两个针对同一目的基因不同外显子的sgRNA，进而可以显著提高CRISPR/Cas系统基因编辑的效率。
2.pPP441(CRISPR/CasФ系统)改造：
以pPP441(addgene，#158801)为蓝本，首先用限制性内切酶BsiWI和BsaI(两个位点在嘌呤霉素抗性基因上)对载体进行双酶切，切除嘌呤霉素抗性基因，再利用大肠杆菌重组酶Exnase II将CRE酶重组到载体上，从而得到嘌呤霉素被替换成CRE酶的载体；然后，用限制性内切酶Acc65I(NEB，R0599S)切割载体，使得载体线性化，再利用大肠杆菌重组酶Exnase II将U6-BsaI-gDNA支架的sgRNA表达框(其序列如SEQ ID NO：43所示)重组到载体上(该载体本身有一个SapI的表达框)，从而得到可以同时表达两个独立sgRNA、CasΦ酶和CRE酶的表达体系。CRISPR/CasΦ为新的基因编辑体系，该体系相比于CRISPR/Cas9体系体积更小(一半左右)，更有利于通过核孔进入细胞核对目的基因进行编辑。
以上所得表达载体图谱如图3A和3B所示。
实施例4：应用本发明递送CRISPR-Cas质粒编辑肝脏枯否细胞基因的效果(CRIg、TIM4和F4/80，三者均为肝脏枯否细胞表面高表达的分子标志，便于通过活体显微成像进行单细胞水平检测)
1.选取CRIg蛋白基因作为报告基因，检测本发明对枯否细胞的原位基因编辑效果：
将CRIg基因(Gene ID:278180，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)编辑质粒(pX459-CRIg sgRNA，含两条分别针对CRIg外显子1和外显子2的sgRNA，其序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示，CRISPR/Cas9系统)转化到大肠杆菌Top10中，然后将1×109CFU剂量的大肠杆菌通过尾静脉注射到小鼠的血液中。七天后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma，T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma，721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg的Alexa
Figure BDA0003505704370000131
647荧光基团偶联的F4/80抗体(Biolegend，克隆号BM8)和Alexa
Figure BDA0003505704370000132
488荧光基团偶联的CRIg抗体(eBioscience，克隆号NLA14)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞。如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图4A和4C所示：应用本发明编辑枯否细胞表面分子标志CRIg基因七天后，CRIg蛋白的表达量下降了65％左右，提示本发明成功实现了对CRIg蛋白基因的原位编辑。
2.分别选取TIM4和F4/80蛋白基因作为报告基因，检测本发明对枯否细胞的原位基因编辑效果：
将TIM4基因(Gene ID:276891，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)和F4/80基因(Gene ID:13733，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)编辑质粒(pX459-TIM4sgRNA，含两条分别针对TIM4外显子1和外显子2的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，CRISPR/Cas9系统；pX459-F4/80sgRNA，含两条分别针对F4/80外显子3和外显子4的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，CRISPR/Cas9系统)分别转化到大肠杆菌Top10中，然后将1×109CFU剂量的大肠杆菌通过尾静脉注射到小鼠的血液中。七天后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma,T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma,721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg的Alexa
Figure BDA0003505704370000133
647荧光基团偶联的F4/80抗体(Biolegend，克隆号BM8)，Alexa
Figure BDA0003505704370000134
488荧光基团偶联的CRIg抗体(eBioscience，克隆号NLA14)和PE(Phycoerythrin，藻红蛋白)偶联的TIM4抗体(Biolegend，克隆号RMT4-54)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞，并如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图4B、4D和4E所示：应用本发明编辑枯否细胞表面分子标志TIM4基因七天后，TIM4蛋白的表达量下降了40％左右；编辑F4/80基因七天后，F4/80蛋白的表达量下降了45％左右。提示本发明成功实现了对TIM4和F4/80蛋白基因的原位编辑。
实施例5：利用本发明编辑CRIg的时间维持效果
将CRIg基因编辑质粒(pPP441-CRIg sgRNA，含两条分别针对CRIg外显子1和外显子2的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，CRISPR/CasФ系统)转化到大肠杆菌Clearcoli中，在37℃细菌培养箱中培养过夜，然后用细胞刮刀将菌体刮到无菌50ml离心管中。称量菌的质量(M，单位g)，按照公式CFU＝30×M×1010计算总的CFU。然后将1×109CFU剂量的菌通过尾静脉注射到小鼠的血液中。分别在第七天和第30天，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma,T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma,721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg的Alexa
Figure BDA0003505704370000141
647荧光基团偶联的F4/80抗体(Biolegend，克隆号BM8)和Alexa
Figure BDA0003505704370000142
488荧光基团偶联的CRIg抗体(eBioscience，克隆号NLA14)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞，如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图5A和5B所示：在应用本发明编辑CRIg分子基因时，编辑后第七天可以看到CRIg蛋白表达下降了66％左右；在第30天，CRIg蛋白的表达量下降了68％左右；在第45天，CRIg蛋白的表达量下降了75％左右，提示本发明对CRIg蛋白基因的编辑效果至少可以维持45天。
实施例6：应用本发明同时编辑枯否细胞多个基因的效果
将CRIg和F4/80基因编辑质粒(pX459-F4/80sgRNA，含两条分别针对F4/80外显子3和外显子4的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，CRISPR/Cas9系统；pX459-CRIg sgRNA，含两条分别针对CRIg外显子1和外显子2的sgRNA，其序列如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示，CRISPR/Cas9系统)一起共转染到大肠杆菌TOP10中，然后将1×109CFU剂量的菌通过尾静脉注射到小鼠的血液中。第七天后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma,T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma,721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg的Alexa
Figure BDA0003505704370000152
647荧光基团偶联的F4/80抗体(Biolegend，克隆号BM8)，Alexa
Figure BDA0003505704370000153
488荧光基团偶联的CRIg抗体(eBioscience，克隆号NLA14)和PE偶联的TIM4抗体(Biolegend，克隆号RMT4-54)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞(在同时编辑F4/80和CRIg基因表达时，需用TIM4表达来指示肝脏枯否细胞)。接着，如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图6A、6B和6C所示：在应用本发明同时编辑CRIg和F4/80分子基因七天后，CRIg蛋白表达下降了63％左右；F4/80蛋白表达下降了45％左右，提示本发明可以同时实现对CRIg和F4/80分子基因的原位编辑，且对不同途径的分子均可编辑。
实施例7：在黑色素瘤肝转移小鼠模型中检测c-Maf和MafB的原位编辑效果
1.黑色素瘤肝转移小鼠模型中细菌同样可作为递送质粒到枯否细胞的载体
将3×105的带有绿色荧光的B16F10(小鼠皮肤黑色素瘤细胞，来自ATCC，货号CRL-6475)注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。7天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有红色荧光的Clearcoli[电转pBAD-tdTomato质粒(addgene，货号#54856)到Clearcoli中，使其表达红色荧光蛋白tdTomato]。1小时后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma，T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma，721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg Alexa
Figure BDA0003505704370000151
647荧光基团偶联的TIM4抗体(Biolegend，克隆号RMT4-54)注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞。接着如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图7A所示：在有肿瘤转移灶的小鼠肝脏中，注射1×109CFU剂量的Clearcoli，细菌并没有进入肿瘤组织内部，95％左右的枯否细胞均捕获了Clearcoli，提示即使在长有肿瘤转移灶的肝脏组织中，Clearcoli仍然主要由枯否细胞捕获。
2.在黑色素瘤肝转移小鼠模型中检测c-Maf和MafB的原位编辑效果
将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。7天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(sgRNA序列如SEQ ID NO:15、16、17、18所示，CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏，用AC7-CD45和PE-TIM4抗体标记30min，再用PBS洗两次。用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)标记5min，然后将所有的细胞上流式分选仪，分选出CD45+TIM4+的细胞。分选完成后，按照实施例2中第4条中的方法进行实时RT PCR检测c-Maf和MafB的表达情况。检测的引物设计方案如图7B所示，引物设计在被切掉的序列上(引物序列如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQID NO：28所示)，若发生基因切割，则通过该引物RT-PCR检测信号会显著下调。结果如图7C所示：在应用本方法编辑肿瘤转移小鼠模型的c-Maf和MafB的基因七天后，c-Maf分子表达水平下降了97％；MafB分子表达水平下降了46％，提示在肿瘤转移模型小鼠中，本发明成功的实现了对c-Maf和MafB基因的原位编辑。
实施例8：本发明预防黑色素瘤肝转移的效果和对其早期肝转移灶的治疗效果
1.本发明预防黑色素瘤肝转移的效果
将1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/Cas9和CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli由尾静脉注射到小鼠血液中，七天后，将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。在第15天观察肝脏中肿瘤生长情况，并记录肝重和肿瘤的面积。结果如图8A和8B所示：在应用本发明对黑色素瘤肝脏转移进行抑制15天后，相比于不抑制组，小鼠的肝重下降了40％，肿瘤的面积下降了96％，提示本发明有良好的抑制黑色素瘤肝转移的效果。
2.本发明对早期肝转移灶的治疗效果
将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。7天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，观察肝脏中肿瘤生长情况，并记录肝重和肿瘤的面积。得到如图8C和8D的结果：在应用本发明对早期黑色素瘤肝转移灶进行治疗七天后，相比于不治疗组，小鼠的肝重下降了33％，肿瘤的面积下降了99％，提示利用本发明在黑色素瘤肝转移灶发展的早期阶段进行治疗，取得了很好的效果。
实施例9：利用本发明治疗晚期肝转移癌
1.利用本发明治疗黑色素瘤肝转移灶
将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。12天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/Cas9和CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏称量肝重和记录小鼠生存率。得到如图9A、9B和9C的结果：在利用本发明治疗晚期黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，小鼠的肝重下降了56％，小鼠的生存率提高了70％，提示利用本发明在肿瘤发展的晚期治疗黑色素瘤肝转移灶，仍然取得了很好的效果。
2.利用本发明治疗结肠癌肝转移灶
将1×106的MC38细胞(小鼠结肠癌细胞，来自上海BFB生物公司，货号BFN60808402)注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。12天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏称量肝重和记录小鼠生存率。得到如图10A、10B和10C的结果：在利用本发明治疗结肠癌肝脏转移灶七天后，相比于不治疗组，小鼠的肝重下降了57％，小鼠的生存率提高了50％，提示利用本发明治疗结肠癌肝转移灶取得了很好的效果。
3.利用本发明治疗肺癌肝转移灶
将2×106的LLC细胞(小鼠肺癌细胞，来自ATCC，货号CRL-1642)注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。12天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏称量肝重和肿瘤的面积。得到如图11A和11B的结果：在利用本发明治疗肺癌肝脏转移灶七天后，相比于不治疗组，小鼠的肝重下降了47％，肿瘤面积缩小了93％，提示利用本发明治疗肺癌肝转移灶取得了很好的效果。
实施例10：探究本发明治疗肝转移癌的作用机制
1.探究用本发明治疗后，肝脏枯否细胞的增殖和对肿瘤组织的浸润情况
将3×105表达绿色荧光蛋白ZsGreen1的B16F10肿瘤细胞(B16F10-ZsGreen1)注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。7天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，用300mg/kg的2.5％阿佛丁(包含0.25g三溴乙醇，Sigma，T48402-25G；0.25mL叔戊醇，Sigma，721123-1L)麻醉小鼠，然后通过尾静脉将2μg PE偶联的TIM4抗体和Alexa
Figure BDA0003505704370000181
647荧光基团偶联的F4/80抗体注射到小鼠血液中来标记肝脏枯否细胞。如实施例1.2所描述进行活体肝脏显微成像。结果如图12A和12B所示：在利用本发明治疗小鼠黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，枯否细胞的数量增加了2.5倍，并且可以观察到枯否细胞进入到肿瘤组织里，提示经过本发明的治疗枯否细胞发生了增殖并浸润到肿瘤组织中。
2.流式细胞术检测枯否细胞数量和增殖情况
将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。12天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏，用流式细胞术检测枯否细胞的数量[抗体：AC7-CD45，PC7-CD11b，647-F4/80(Biolegend，克隆号BM8),P.P-Ly6C(Biolegend，克隆号HK1.4)，488-Ly6G和PE-TIM4]，得到如图12C和12D的结果：在利用本发明治疗小鼠黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，枯否细胞的数量增加了85％。为了进一步检测枯否细胞的增殖情况，我们又进行了Ki67(表征细胞增殖的分子标志)的内标流式分析，取上述肝脏，按照上述方法进行外标染色[抗体：AC7-CD45，PC7-CD11b，BV421-F4/80(Biolegend，克隆号BM8),P.P-Ly6C，700-Ly6G(Biolegend，克隆号1A8)和647-TIM4(Biolegend，克隆号RMT4-54)]。外标染色结束后，再进行内标染色，首先用120μL固定液重悬细胞[固定液包括：Fixation/permeabilization concentrate(eBioscience，00-5123-43)和Fixation/permdiluent(eBioscience，00-5223-56)，按3:1混合]，室温避光固定45min。完成后，用PBS洗两次。然后，加入含5μg CD16/32抗体的穿膜液100μL[穿膜液包括：10×Permeabilization buffer(eBioscience,00-8333-56)，使用时用去离子水稀释成1×]，室温封闭15min。加入FTIC-KI67(Biolegend，克隆号16A8)抗体，室温避光标记30min。然后，用PBS洗两次，200目筛网过滤，上流式仪检测，得到如图12E所示的结果：在利用本发明治疗小鼠黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，枯否细胞中增殖相关抗原Ki67水平表达上升了，提示在经过本方法治疗后，肝脏枯否细胞确如预期发生了显著增殖。
3.探究用本发明治疗后，肝脏枯否细胞的M1/M2极化状态
将3×105的B16F10注射到小鼠脾脏后，切除脾脏并缝合内皮与外皮。12天后，由尾静脉注射1×109CFU的含有Vector或c-Maf&MafB sgRNA(CRISPR/CasФ系统)的Clearcoli。再经过7天后，取小鼠肝脏，分别进行外标[抗体：AC7-CD45,PC7-CD11b，647-F4/80,P.P-Ly6C，700-Ly6G，PE-TIM4和FITC-CD80(Biolegend，克隆号16-10A1)]和内标[AC7-CD45,PC7-CD11b，BV421-F4/80,P.P-Ly6C，700-Ly6G，647-TIM4和PE-CD206(Biolegend，克隆号C068C2)]的流式检测，得到如图13A和13B的结果：在利用本发明治疗小鼠黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，枯否细胞CD80(M1分子标志)的水平上升了72％，CD206(M2分子标志)的水平下降了65％，提示在经过本方法治疗后，抑制了枯否细胞的M2极化，而促进了M1极化。随后我们按照实施例2中第4条中的方法进行实时RT PCR检测了其他M1(iNOS，MCP1(MCP1就是CCL2，两者是同一个细胞因子)和TNFα)和M2(FIZZ1，ARG1和MRC2)相关的基因表达(引物序列如SEQ ID NO:21-24、29-36所示)，GAPDH是内参(引物序列如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示)，得到如图13C和13D的结果：在利用本发明治疗小鼠黑色素瘤肝转移灶七天后，相比于不治疗组，枯否细胞的M1极化分子标志iNOS表达水平上升了6倍，MCP1表达水平上升了3倍，TNFα上升了10倍；而M2极化分子标志FIZZ1下降了14倍，ARG1下降了100倍，MRC2下降了6.25倍，该结果与流式细胞分析结果一致，提示本方法促进枯否细胞发生了M2到M1的功能转化。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.用于治疗癌症特别是癌症肝转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括大肠杆菌和药学上可接受的赋形剂，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组载体上还含有CRE酶的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述目标基因为c-Maf和MafB。
6.细菌，优选大肠杆菌，更优选LPS突变大肠杆菌，如Clearcoli在制备用于治疗癌症优选癌症肝转移的药物组合物中的用途，其特征在于，所述细菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列，优选地，所述癌症选自黑色素瘤、肺癌和结肠癌。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述目标基因为c-Maf和MafB。
10.对枯否细胞进行原位基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括向枯否细胞施用有效量的大肠杆菌，所述大肠杆菌包括重组载体，所述重组载体上连接有靶向目标基因的sgRNA和Cas9蛋白/CasΦ蛋白的核苷酸序列，优选地重组载体上具有两个或以上sgRNA表达框，优选地所述sgRNA靶向同一目标基因的不同外显子，优选地所述目标基因为c-Maf和MafB。
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