CN114409610B - 噁二唑衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噁二唑衍生物及其制备方法和用途。所述噁二唑衍生物结构式如（Ⅰ）所述，可用于治疗缺血性脑血管疾病，尤其是缺血性脑中风，针对脑缺血再灌注损伤急性期或慢性期患者，可有效增加脑血流量，降低脑血管通透性，减少死亡率，促进损伤神经功能恢复。

Description

噁二唑衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类噁二唑衍生物及其制备方法和用途，更具体地涉及式（Ⅰ）化合物及其在制备用于预防或治疗缺血性脑中风的药物中的应用。

背景技术

吲哚胺-2,3-双加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO)是1967 年Hayaishi 小组首次在细胞内发现的一种含有亚铁血红素的单体酶，cDNA 编码蛋白由403氨基酸组成，分子量为455kDa，它是延着色氨酸-犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶，并且在多种哺乳动物的组织中具有广泛的表达（Hayaishi O, et al. Science, 1969, 164,389-396）。在肿瘤患者的细胞中，IDO 常作为诱导肿瘤微环境免疫耐受产生重要的生理作用，其介导的色氨酸 (Tryptophan, Trp）犬尿氨酸(Kynurenine, Kyn) 代谢途径参与了肿瘤免疫逃逸，而IDO 作为诱导肿瘤微环境免疫耐受也产生重要的作用。

L-色氨酸是人体8种必需氨基酸（婴儿为9种）之一，只可通过外界食物摄取而无法自身合成，约占氨基酸总量的1%，在人体血浆中的浓度为40~80 μmol/L，是当前已知与人体免疫系统功能失调有关的关键氨基酸。在人体内，约 5% 的 L-色氨酸用于蛋白质合成或通过 5-羟色胺途径代谢为 5-羟色胺与褪黑素，其余 95% L-色氨酸均通过犬尿氨酸（Kyn）途径代谢为色氨酸代谢产物即系列犬尿氨酸衍生物。多种研究表明，经犬尿氨酸途径代谢生成的色氨酸代谢产物可诱导免疫抑制，促进免疫系统效应细胞的凋亡，在自身免疫性疾病、炎症、感染和妊娠期间对免疫系统的调节起着关键作用。

多项研究发现 IDO 参与并介导了多种免疫逃逸机制，因而其小分子抑制剂的开发是解除肿瘤微环境免疫抑制的研发热点。虽然当前仍未有成功上市的药物，但多种抑制剂的临床前及初步临床数据表明，IDO抑制剂的单独用药及与其他免疫检查点抑制剂、疫苗等的联合使用均呈现出较好的抗肿瘤疗效。

同时，许多研究者正在探索拓展IDO抑制剂更为广泛的应用范围。据文献报道，命名为PCC0208009的IDO抑制剂能够入脑，显示出镇痛作用（Wang Y, et al. BiochemPharmacol. 2020 Jul;177:113926.），提示该化合物对于某些中枢神经系统疾病可能有一定作用。但也有研究显示IDO抑制剂并不能有效改善脑缺血损伤（Jackman KA, et al.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2011 ;383(5):471-81）。

发明内容

本发明经过不断深入研究，提供了一种全新的噁二唑衍生物及其制备方法和在制备用于预防或治疗缺血性脑中风的药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物：

本发明第二方面涉及式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物的制备方法，其中包括以下步骤：

。

本发明第三方面涉及一种药物组合物，包括式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物，和药学上可接受的载体。

进一步的，所述的药物组合物包括治疗有效量的式（I）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物，和药学上可接受的载体。所述载体，包括本领域中常规的辅料成分，例如，填充剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂和润湿剂等。

本发明第四方面涉及式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物，或包括式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物的药物组合物在制备预防或治疗缺血性脑血管疾病药物中的应用。

本发明的一个实施方式中，所述缺血性脑血管疾病为缺血性脑中风。

本发明的一个实施方式中，所述缺血性脑血管疾病为脑缺血再灌注损伤急性期或慢性期。

进一步地，本发明提供的式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物，或包括式（Ⅰ）所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或溶剂合物的药物组合物可降低急性期或慢性期缺血再灌注损伤患者的脑梗死面积、脑水肿、增加脑血流量、降低脑血管通透性和/或促进神经功能的恢复。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括（但不限于）：口服、肠胃外（静脉、肌肉内或皮下）、或局部用药等。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂或载体介质代表性的载体，包括但不限于：粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、增溶剂、助悬剂等。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行清楚、完整的描述，本领域技术人员将会理解，下述实施例是本发明部分实施方式，而不是全部实施方式，仅用于说明本发明，而不应视为对本发明保护范围的限制。

本发明中，未注明具体试验条件的，按照常规试验条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得常规产品。

本发明中，试验结果以平均值±标准差（

±SD）表示，采用 PASW Statistics18.0软件进行正态性检验，如符合正态分布，数据用单因素方差分析（One-Way ANOVA），若方差齐，采用最小显著差法（Least significant difference，LSD）进行两两比较，若方差不齐则采用Dunnett's T3检验进行两两比较；如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计。当P<0.05被认为有显著统计学差异。

本发明中的检测指标为：

神经功能：

大鼠神经功能评分采用mNSS评分法，该方法采用18分计算法。mNSS方法包括运动试验测试、感觉试验测试、平衡木试验测试、反射丧失和不正常运动测试。具体的评分方法如下：

运动试验（6分）：

（1）提尾试验：提尾并悬空大鼠约1米高，观察头部和前后肢偏离和屈曲情况。正常大鼠的头与身体垂直轴在短时间内无夹角或夹角小于等于10度、四肢向地面伸展，均计为0分；如大鼠有向前肢屈曲、后肢屈曲或头部在30秒内偏离垂直轴大于10度则分别计1分。

（2）行走试验：大鼠放在平整地面上，观察大鼠的自由行走行为。正常行走记0分，不直线行走、向轻瘫侧转圈、向轻瘫侧倾倒则分别计1分。

感觉试验（2分）：

（1）视觉实验：把大鼠握于手中，前爪悬空，并使大鼠前爪向桌面倾斜约45度靠近，正常大鼠反应为前肢即刻抓向桌面计0分，若大鼠表现为前爪反应延迟计1分。

（2）本体感觉实验：大鼠放于桌面上，从后轻轻把大鼠推向桌子边缘，正常情况下大鼠会抓住桌子的边缘计0分，而若大鼠侧肢体掉下桌面计1分。

平衡木试验（6分）：

将大鼠在平衡木上观察，按表1的评分标准进行评分。

反射丧失和不正常运动（4分）：

（1）耳廓反射：大鼠放于地面上，手放于外耳道上，若大鼠有摇头反应计0分，无摇头反应则计为1分。

（2）角膜反射：大鼠放地面，用棉棒轻触角膜时若大鼠眨眼计0分，若大鼠无眨眼反应则计为1分。

（3）惊恐反射：将大鼠放地面，用硬纸板靠近耳朵快速弹动并发出噪音，若大鼠出现逃避计0分，若大鼠未出现逃避运动则计1分。

（4）癫痫、肌陈挛、肌张力障碍异常出现任意一种即计1分。

本发明中，大鼠脑含水量的测定方法为：MCAO大鼠分组给药后24 h，测定进行完神经功能评分后，脱臼处死大鼠，迅速取脑并称重，在100℃烘箱中干燥除水10 h以上（至达到恒重），以干湿重法计算脑含水量（%）。

脑含水量（%）=（大脑湿重-大脑干重）/大脑湿重×100%。

本发明中，TTC染色测定脑梗死面积的方法为：脱臼处死大鼠，打开胸腔暴露心脏，同时剪开右心耳，用4°C预冷生理盐水通过左心室进行心脏灌流。灌流完后取脑并剥离嗅球、小脑和低位脑干，生理盐水漂洗后置-20°C冰箱冷冻30 min，然后以3 mm厚对脑组织进行冠状切片，然后放入2% TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液中，37°C避光孵育染色10-20min。TTC可被正常组织细胞内的线粒体脱氢酶还原生成红色光敏脂溶性的甲臜物（Formazen），使组织呈现红色；而梗死组织的细胞内，脱氢酶活性下降，TTC不能与之发生反应，组织呈现白色。染色后，将切片脑组织排列整齐并拍照记录。使用Image Plus分析软件对梗死面积进行统计，计算每个脑片的梗死面积。最终脑梗死面积以占总面积的百分率表示。

本发明中，伊文思蓝通透性检测的方法为：在缺血再灌损伤大鼠长期给药研究给药第1d和6 d，大鼠尾静脉注射4%的伊文思蓝溶液，注射体积0.1 mL/100 g，注射24 h后，大鼠脱臼处理，迅速取脑后用生理盐水清洗掉血迹，称重后用按比例加入50%的三氯乙酸匀浆，匀浆液在400 g离心20 min，取上清液610 nm下测定吸光度值。脑组织伊文思蓝含量以µg/g脑湿重表示。

本发明中，血流检测的方法为：在制备MCAO模型前以及MACO制备后，所有动物水合氯醛麻醉后用激光散斑血流仪（moorFLPI-2）检测缺血区及半暗带脑区血流。MCAO大鼠在给药后24 h或7 d，水合氯醛麻醉后再次进行缺血区及半暗带区血流检测。

实施例1 式 ( I ) 化合物的合成

步骤1：化合物l的合成

将化合物SM-1，即3-（4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基）-4-（3-溴-4-氟苯基）-1,2,4-恶二唑-5 (4H)-酮（SM-1）(120.00 g, 350.8 mmol, 1.00 eq)加入烧瓶中，装温度计，加入冰醋酸(2.4 L)和浓盐酸(766 mL)搅拌10分钟，用滴液漏斗滴加入亚硝酸钠(29.05 g,420.96 mmol, 1.20 eq)的水(90.00 mL)溶液，冰水浴5°C继续反应3小时，用恒压漏斗滴加入氯化亚铜(3.47 g, 35.08 mmol)浓盐酸(134 mL)溶液，加完氯化亚铜后逐渐升温至室温，反应23小时，反应液逐渐变为草绿色。向反应液中缓慢加入3.6 L水稀释，在此过程中有白色固体析出，加完后冰水浴下继续搅拌30分钟，然后将反应液抽滤得到的固体水洗(300mL*10)，将此固体溶于400 mL乙酸乙酯，分相，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液于减压蒸馏下旋干得产品。旋干后即得化合物l (白色固体，110.0 g，收率：86.74%，纯度：100%)。MS(ESI) m/z：361.0 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 8.05 - 8.01 (m, 1H), 7.26 -7.21 (m, 1H), 7.18 - 7.16 (m, 1H)。

步骤2：化合物2的合成

将化合物l (8.90 g, 24.62 mmol, 1.00 eq)加入到单口烧瓶中，加入乙腈(80.00 mL)使其溶解，再加入化合物2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇(4.36 g, 24.62 mmol,1.00 eq)，然后加入化合物碳酸铯(8.82 g, 27.08 mmol, 1.10 eq)，反应1小时，反应液逐渐变为浅灰色，将反应液过滤，滤饼乙酸乙酯洗(15 mL*4)，滤液于减压蒸馏下旋干得浅褐色固体粗品，溶于15 mL乙酸乙酯，缓慢加入80 mL石油醚打浆，在此期间有白色固体析出，冰水浴下继续搅拌30分钟，抽滤，得到的白色固体石油醚淋洗(15 mL*3)，收集得到的白色固体，将此白色粉末状固体晾干，即得化合物2 (白色粉末状固体，11.24 g，收率，90.89%，纯度：100%)。MS (ESI) m/z：502.0 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.34 (s,1H), 7.98 - 7.96 (m, 1H), 7.31 - 7.28 (m, 1H), 7.17 - 7.13 (m, 1H), 3.49 -3.46 (m, 2H), 3.28 - 3.25 (m, 2H), 1.31 - 1.34 (s, 9H)。

步骤3：化合物3的合成

将化合物2 (130 g, 258.8 mmol, 1.00 eq)加入到单口烧瓶中，加入二氯甲烷(200.00 mL)搅拌，再分批加入氯化氢/1,4-二氧六环(4 M, 750.00 mL, 11.59 eq)，该反应液于20°C下反应1小时，有大量的白色固体析出，用布氏漏斗抽滤，滤饼用二氯甲烷(30mL*3)洗涤，将滤饼刮出并于减压蒸馏下旋干，即为化合物3(白色粉末状固体，109 g，收率：96.01%，纯度：100%，盐酸盐)。MS (ESI) m/z：401.9 [M+H]⁺。

步骤4：化合物4的合成

将化合物3(37.00 g, 84.79 mmol, 1.00 eq)加入到500 mL的单口烧瓶中，加入100 mL二氯甲烷使其溶解，用冰水浴将体系冷却至0°C，0°C下用恒压漏斗滴加入N,N'-羰基二咪唑(16.2 g, 101.75 mmol, 1.20 eq)的二氯甲烷溶液(28 mL)，该反应液于0°C下反应1小时，得到二氯甲烷溶液(约128 mL)。将化合物金刚烷胺(12.8 g, 84.79 mmol, 1.00eq)加入到IL的单口烧瓶中，加入170 mL二氯甲烷，在冰水浴体系下分批加入N,N-二异丙基乙胺(23.57 g, 182.36 mmol, 31.85 mL, 4.00 eq),再滴加入上述二氯甲烷溶液(90mL)，然后将反应液升温至室温反应0.5小时。加入200 mL水洗，分相，有机相用200 mL0.5M盐酸水溶液洗，有大量白色固体析出，抽滤，滤饼二氯甲烷淋洗(20 mL*3)，水洗(30 mL*5)，收集得到的白色固体，溶于200 mL乙酸乙酯，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液于减压蒸馏下旋干得到化合物4(白色粉末状固体，38.12 g，收率：77.23%，纯度：100%)。MS (ESI) m/z：579.1 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.69 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 7.85 -7.82 (m, 1H), 7.29 - 7.25 (m, 1H), 7.14 - 7.11 (m, 1H), 3.45 - 3.42 (m, 2H),3.26 - 3.22 (m, 2H), 2.06 (m, 3H), 1.60 - 1.54 (m, 12H)。

步骤5：化合物( I )的合成

将化合物4(17.68 g, 30.54 mmol, 1.00 eq)加入到500 mL的三口烧瓶中，加入四氢呋喃(70.00 mL) 搅拌使其溶解，用冰水浴将反应体系冷却至0°C，0°C下分批缓慢加入氢氧化钠(4.89 g, 122.17 mmol, 4.00 eq)的水溶液(40.00 mL)，加入氢氧化钠溶液过程中有白色固体析出，待加完氢氧化钠溶液后继续搅拌则反应液变为深灰色澄清液，然后将反应液逐渐升温至室温反应2.5小时。将反应液冷却至0°C，用4MHC1调pH=l，加入30 mL水，乙酸乙酯萃取(100 mL*3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液于减压蒸馏下旋干，用130 mL二氯甲烷打浆，有白色固体析出，继续搅拌1小时，抽滤，滤饼二氯甲烷淋洗(20 mL*3)，将抽滤得到的白色固体晾干即得到化合物( I ) (13.4 g，收率：81.99%, 纯度：100%)。MS (ESI)m/z：553.1 [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.57 (s, 1H), 10.21 (s,1H), 7.83 - 7.80 (m, 1H), 7.22 - 7.19 (m, 1H), 7.08 - 7.05 (m, 1H), 3.36 -3.31 (m, 2H), 3.19 - 3.13 (m, 2H), 2.15 (m, 3H), 1.56 - 1.51 (m, 12H)。

实验例1 化合物( I )对SD大鼠缺血再灌注损伤急性损伤的治疗作用

1、制备MCAO（Middle cerebral artery occlusion）试验动物模型

参照Longa等人报道的线栓法（Longa EZ, et al. Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989;20(1):84-91.），制备大鼠中动脉阻塞法（MCAO）脑缺血再灌注损伤模型。选用规格为2636-100的尼龙线栓作为线栓（线长50 mm，线身直径0.26 mm，头端包被多聚赖氨酸，线头直径0.36±0.02 mm，在距离包被末端20 mm处有黑色标记），0.01%洁尔灭溶液清洁后置于生理盐水中备用。大鼠造模前16 h禁食，腹腔注射给予10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。麻醉后的大鼠仰卧固定于手术台上，常规备皮消毒后，于颈部正中开口，然后用钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌肌之间的肌肉间隙，暴露右侧颈总动脉，分离颈内动脉和颈外动脉。夹闭颈内动脉与颈总动脉，结扎颈外动脉近心端及远心端，中间剪断。分离颈内动脉主干至翼颚动脉，并在其起始处用动脉夹结扎。将颈外动脉游离端剪一“V”型微切口，并将颈外动脉拉至与颈内动脉成一条直线，然后将栓线由颈外动脉分叉处沿颈内动脉向颅内方向插入，感觉到阻力时停止，此时插入深度约为20 mm。将线栓固定，结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，将线栓的线头置于皮肤外，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型。假手术组进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离，然后缝合。术后，所有动物均肌肉注射给予青霉素（15万单位/只），1次/d，连续3 d。本研究选择栓塞1.5 h后进行再灌注损伤。大鼠手术前和手术后1 h、3h、6 h监测肛温、实验环境以及脑缺血大鼠饲养环境，温度控制在22-26℃，通过保持环境温度以保证脑温恒定。

2、试验方法

动物随机分为假手术组（生理盐水），模型对照组（生理盐水），尼莫地平12mg/kg组，化合物( I )2.5、5、10、20和40 mg/kg组，每组15只，所有动物均在缺血再灌注后15 min灌胃给药（见表2）。给药24 h后，各组大鼠进行双盲动物神经功能行为能力测试，测试完成后10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉大鼠检测脑血流、取脑进行脑含水量、脑梗死面积（TTC染色）测定。

3、试验结果

3.1 化合物( I )对脑缺血再灌损伤大鼠梗死面积和脑含水量的影响

大鼠急性脑缺血脑梗死面积计算采用TTC染色。量效关系研究结果见表3所示，大鼠局灶性脑缺血后24 h，缺血区的脑组织约有27.1%的区域为脑梗死区，灌胃给予化合物(I )（2.5~40 mg/kg）后剂量依赖性的降低脑梗死面积，其中化合物( I ) 5~40 mg/kg组与模型组相比具差异显著（P< 0.05或P< 0.01）。尼莫地平12 mg/kg组也显著降低缺血后的脑梗死面积（P< 0.01，与模型组相比）。

化合物( I )的2.5~40 mg/kg组可剂量依赖性降低大鼠脑缺血再灌损伤后引起的脑水肿，其中5~40 mg/kg组脑含水量与模型组相比差异显著（P< 0.05或P< 0.01）（表3）。尼莫地平12 mg/kg组也显著降低缺血后的脑水肿（P< 0.05，与模型组相比）。

3.2 化合物( I )对脑缺血再灌损伤大鼠神经功能恢复和生存率的影响

神经功能评分采用mNSS 18分计算法进行评分，大鼠急性脑缺血再灌注后量效研究试验结果表明（表3）：正常大鼠提尾观察双前肢伸向地面，地面行走四肢平衡性好，且前肢抓取有力。模型组大鼠提尾后前肢向左侧肘屈，地面上行走前肢或后肢无力、向一侧倾斜，严重者不停转圈。化合物( I )组剂量依赖性的改善运动神经功能，其中5mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg组可显著改善神经运动功能（P< 0.05或P< 0.01，与模型组相比）。

死亡率是评价抗脑中风药物有效性的重要指标。量效研究试验研究结果表明（表3），给予化合物( I )后可剂量依赖性降低大鼠脑缺血再灌损伤后的死亡率。

3.3 化合物( I )对脑缺血再灌损伤大鼠脑血流的影响

大鼠MCAO造模前和再灌注后用散斑血流仪检测各组动物脑血流，测定血流后按分组情况分别给予生理盐水和含量为2.5、5、10、20和40 mg/kg 的化合物( I )。结果显示，大鼠中动脉栓塞再灌注后，缺血区脑血流显著降低（降低幅度约50%）。给药后24 h，模型组动物缺血区及半暗带区血流量明显高于造模后（0 min）血流（P<0.01）；化合物( I )组在给药后24 h血流量剂量依赖性的升高，其中20和40 mg/kg组血流量明显高于模型组（P<0.05）（表4）。

实验例2 化合物( I )连续给药对脑缺血再灌损伤大鼠的治疗作用

1、制备MCAO试验动物模型：采用与试验例1相同的方法。

2、试验方法

缺血再灌SD大鼠随机分5组，分假手术组（15只+12只，其中15只用于神经功能评分和脑血流测定，12只用于伊文思蓝和MMP-9蛋白试验）、模型组（15只+12只）、化合物( I )含量分别为5、10和20 mg/kg组（每组各15只+12只）（表5）。化合物( I )组灌胃给予MCAO大鼠相应剂量的化合物( I )，每天给药1次，连续给药7 d；假手术组和模型组灌胃给予相同体积的生理盐水。在给药后3 d、5 d和7 d对大鼠进行双盲神经功能评分。在给药后第1 d和6d，每组6只大鼠尾静脉注射4%伊文思蓝溶液，24 h后大鼠10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg），腹主动脉取血，3000 rpm/min 离心10min，取血清，-20℃冷冻备用。大鼠取血后用含肝素（10U/mL）的生理盐水经腹主动脉灌注，然后取脑并称重，用50%三氯乙酸匀浆，400 g离心力下离心20 min，在M5酶标仪610 nm下检测吸光度值。剩余存活大鼠在给药后7 d用10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg），进行脑血流测定。

3、试验结果

3.1 化合物( I )连续给药对脑缺血再灌损伤大鼠死亡率和神经功能恢复影响

MCAO大鼠连续灌胃给药后7天，化合物( I ) 的5~20 mg/kg组大鼠降低MCAO大鼠死亡率，并有一定的剂量依赖关系（表6）。

MCAO大鼠在连续给药后第3、5和7天，化合物( I ) 的5~20 mg/kg组剂量依赖性的改善大鼠神经功能，其中10 和20 mg/kg可显著改善神经运动功能（P< 0.05，与模型组相比）（表6）。

3.2 化合物( I )对脑缺血再灌损伤大鼠脑血流的影响

MCAO大鼠连续灌胃给予化合物( I ) 含量为5~20 mg/kg 7天后，缺血区和半暗带区脑血流剂量依赖性升高，其中10和20 mg/kg组血流量明显高于模型组大鼠（P<0.05）（表7）。

3.3 化合物( I )对脑缺血再灌损伤大鼠血管通透性影响

伊文思蓝注射后可检测血管的通透性，完整的血管结构致密，伊文思蓝不易透过，而受损的脑血管或者新生的血管结构不完整，通透性增加，注射伊文思蓝后会透过血管进入周围组织，因此通过测定组织中的伊文思蓝含量可反映出血管结构的完整性。连续灌胃给药大鼠在给药后1d和6 d，尾静脉注射4%伊文思蓝后24 h，取脑匀浆测定吸光度值。试验结果表明大鼠药后2d和7 d，化合物( I )的5~20 mg/kg组剂量依赖性显著降低伊文思蓝的渗出（P<0.05或 P<0.01，与模型组相比）（表8）。

MMP-9蛋白是血管通透性的标志蛋白。Elisa方法检测血清中MMP-9蛋白含量，结果显示药后2 d和7 d，化合物( I )的5~20 mg/kg组MMP-9含量显著低于模型组（P<0.01或P<0.05）(表8)。

上述试验表明，化合物( I )对脑缺血再灌注损伤大鼠在急性期和慢性期均有较好的保护作用。化合物( I )可显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积和脑水肿，增加大鼠脑血流量，降低脑血管通透性，减少动物死亡率，促进损伤大鼠神经功能恢复，从而有效治疗缺血性脑中风。

Claims (10)

1.式(I)所示的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐；

2.权利要求1所述的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐的制备方法，其中包括以下步骤：

3.一种药物组合物，包括权利要求1所述的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐，和药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的噁二唑衍生物或其立体异构体、药学可接受的盐或权利要求3所述药物组合物在制备预防或治疗缺血性脑血管疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述缺血性脑血管疾病为缺血性脑中风。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述缺血性脑血管疾病为脑缺血再灌注损伤急性期或慢性期。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物可降低脑缺血再灌注损伤患者脑梗死面积和/或脑水肿。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物可增加脑血流量。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物可降低脑血管通透性。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物可促进神经功能的恢复。