CN114409608B - 一种麦角硫因的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种麦角硫因的合成方法。该合成方法，包括以下步骤：(1)将组氨酸溶解在第一溶剂中，加入氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯后用甲酸调节pH，加水析出固体，过滤干燥得到Boc保护的组氨酸；(2)将Boc保护的组氨酸溶解在第二溶剂中，加入溴化钠和醋酸碘苯搅拌反应，反应后加入硫化钠反应，调节溶液pH，析出固体，过滤干燥得到硫代的Boc组氨酸；(3)将硫代的Boc组氨酸溶解搅拌反应，减压抽干溶剂，将浓缩后的液体滴加到甲基叔丁基醚中析晶，过滤干燥得到硫代组氨酸；(4)甲基化：化学催化或生物酶法进行甲基化得到纯化的麦角硫因。本发明提出的合成方法的合成路线短，一锅法实现高效硫代，同时得到的产物麦角硫因的产率高。

Description

一种麦角硫因的合成方法
技术领域
本发明属于化合物合成技术领域，具体涉及一种麦角硫因的合成方法。
背景技术
麦角硫因(巯基组氨酸三甲基内盐，ergothioneine，EGT)是1909年发现的一种天然抗氧化剂，最初在一种真菌Claviceps purpurea中被发现，纯品是白色晶体，水溶性，(室温下可溶解0.9mol/L)，在生理pH值下和强碱溶液中不会自身氧化。在人体内可以对细胞起到保护作用，是机体内的重要活性物质。天然抗氧化剂安全，无毒，已经成为研究的热点。麦角硫因作为一种天然抗氧化剂，已经走入人们的视野，它具有清除自由基，解毒，维持DNA的生物合成，细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。
目前麦角硫因的制备技术有三种：天然生物提取法、生物合成制备法以及化学合成法。从动物组织和食用菌中提取麦角硫因的产量低，成本高，限制了麦角硫因的应用。以蕈菌菌丝体深层发酵技术生物合成制备麦角硫因，可以通过代谢调控等发酵过程控制手段有效地提高麦角硫因的产率，降低生产成本，但是该方法得到产物的产率低。化学合成法制备麦角硫因困难，并且合成的试剂昂贵，安全性难以得到保障。亟待解决该问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种麦角硫因的合成方法，本发明提出的合成方法步骤简单，产率高，易于大规模推广。
本发明所采取的的技术方案是：一种麦角硫因的合成方法，包括以下步骤：
(1)组氨酸的Boc保护：将组氨酸溶解在第一溶剂中得到组氨酸溶液，依次加入氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯，待二碳酸二叔丁酯加入后搅拌反应，反应完成后用甲酸调节pH到3-5，加水析出固体，过滤干燥得到Boc保护的组氨酸；其反应方程式如式1所示：
Figure BDA0003486031570000021
(2)一锅法硫代：将Boc保护的组氨酸溶解在第二溶剂中得到Boc保护的组氨酸溶液，依次加入溴化钠和醋酸碘苯，搅拌反应2-4小时，控制温度低于40℃，反应完成后加入硫化钠，升温到70℃-100℃反应4-6小时，反应完成后，降到室温，加入水，再加入硫酸调节溶液pH到3-5，析出固体，过滤干燥得到硫代的Boc组氨酸；其反应方程式如式2所示：
Figure BDA0003486031570000022
(3)Boc的脱除：室温下将硫代的Boc组氨酸溶解在第三溶剂中得到硫代的Boc组氨酸溶液，室温搅拌反应0.5-1.5小时，反应完成后减压抽干第三溶剂，将浓缩后的粘稠液体滴加到甲基叔丁基醚中析晶，过滤干燥得到硫代组氨酸；其反应方程式如式3所示：
Figure BDA0003486031570000023
(4)甲基化：将硫代组氨酸溶解在水中得到硫代组氨酸溶液，加入氢氧化钠，之后于零度下加入硫酸二甲酯0℃搅拌反应0.5-1.5小时，再室温反应0.5-1.5小时，反应完成后调节pH到5-7，产物经后处理得到纯化的麦角硫因；其反应方程式如式4所示：
Figure BDA0003486031570000031
或者将硫代组氨酸溶解在水中，依次加入S-腺苷甲硫氨酸和麦角硫因甲基转移酶，35℃-40℃反应1.5-2.5小时，生成产物麦角硫因，用葡萄糖凝胶柱除去酶，产物减压浓缩后用硅胶柱纯化得到纯化的麦角硫因；其反应方程式如式5所示：
Figure BDA0003486031570000032
优选地，步骤(1)第一溶剂为体积比1:1的四氢呋喃和水的混合溶剂，组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L。
优选地，步骤(1)中组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1-2，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:0.9-1.1，搅拌反应的反应温度为10℃-40℃，反应时间为8-12小时。
优选地，步骤(2)中第二溶剂为体积比1:1的乙腈和水的混合溶剂，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L，Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:1-2，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:0.9-1.1，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:2-10。
优选地，步骤(3)所述的第三溶剂为体积比1:1-9:1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L。
进一步优选，所述的三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为8:2。
优选地，步骤(4)所述的硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:1.5-3.0。
优选地，步骤(4)产物经后处理得到纯化的麦角硫因的具体步骤为：加入乙醇析出无机盐，过滤除去无机盐，母液减压抽干溶剂，用乙醇溶解，之后滴加到甲基叔丁基醚中析出固体，固体用体积比为1:1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂重结晶得纯化的麦角硫因。
优选地，步骤(4)所述的硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:2-4，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.5-0.6。
本发明还保护根据上述合成方法得到的麦角硫因。
与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明提出的合成方法的合成路线短，一锅法实现高效硫代，同时得到的产物麦角硫因的产率高。
附图说明
图1为本发明实施例1制备得到麦角硫因的质谱图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明提出的试剂和设备均为市购。用于质谱分析的仪器是德国布鲁克道尔顿的超高分辨飞行时间质谱仪(bruker maXis)。
一种麦角硫因的合成方法，包括以下步骤：
(1)组氨酸的Boc保护：将组氨酸溶解在第一溶剂中得到组氨酸溶液，依次加入氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯，待二碳酸二叔丁酯加入后搅拌反应，反应完成后用甲酸调节pH到3-5，加水析出固体，过滤干燥得到Boc保护的组氨酸；
(2)一锅法硫代：将Boc保护的组氨酸溶解在第二溶剂中得到Boc保护的组氨酸溶液，依次加入溴化钠和醋酸碘苯，搅拌反应2-4小时，控制温度低于40℃，反应完成后加入硫化钠，升温到70℃-100℃反应4-6小时，反应完成后，降到室温，加入水，再加入硫酸调节溶液pH到3-5，析出固体，过滤干燥得到硫代的Boc组氨酸；
(3)Boc的脱除：室温下将硫代的Boc组氨酸溶解在第三溶剂中得到硫代的Boc组氨酸溶液，室温搅拌反应0.5-1.5小时，反应完成后减压抽干第三溶剂，将浓缩后的粘稠液体滴加到甲基叔丁基醚中析晶，过滤干燥得到硫代组氨酸；
(4)甲基化：(化学催化)将硫代组氨酸溶解在水中得到硫代组氨酸溶液，加入氢氧化钠，之后于零度下慢慢加入硫酸二甲酯，加入后0℃搅拌反应0.5-1.5小时，再室温反应0.5-1.5小时，反应完成后用甲酸调节pH到5-7，加入乙醇析出无机盐，过滤除去无机盐，母液减压抽干溶剂，用乙醇溶解，之后滴加到甲基叔丁基醚中析出固体，固体用体积比为1:1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂重结晶得纯化的麦角硫因；
或者(生物酶法进行甲基化)将硫代组氨酸溶解在水中，依次加入S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和麦角硫因甲基转移酶(EgtD，来源于Mycobacterium smegmatis)催化硫代组氨酸的三甲基化反应，35℃-40℃反应1.5-2.5小时，生成产物麦角硫因，用葡萄糖凝胶柱除去酶，产物减压浓缩后用硅胶柱纯化得到纯化的麦角硫因。
下述实施例优选，步骤(1)第一溶剂为体积比1:1的四氢呋喃和水的混合溶剂，组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L，进一步优选，组氨酸溶液的摩尔浓度为1.0mol/L。
步骤(1)中组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1-2，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:0.9-1.1，搅拌反应的反应温度为10℃-40℃，反应时间为8-12小时；进一步优选，组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1，搅拌反应的反应温度为室温25℃，反应时间为10小时。
下述实施例优选，步骤(2)中第二溶剂为体积比1:1的乙腈和水的混合溶剂，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L，进一步优选，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为1.0mol/L。步骤(2)中Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:1-2，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:0.9-1.1，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:2-10；进一步优选，Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:1，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:1，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:3。
下述实施例优选，步骤(2)中搅拌反应3小时，控制温度低于40℃，反应完成后加入硫化钠，升温到90℃反应5小时。
下述实施例优选，步骤(3)第三溶剂为体积比1:1-9:1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L。进一步优选，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为8:2。
下述实施例优选，步骤(4)硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0mol/L，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:1.5-3.0，进一步优选，硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，硫代组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:2.5。
下述实施例优选，步骤(4)中加入后0℃搅拌反应1小时，再室温反应1小时。
下述实施例优选，步骤(4)生物酶法进行甲基化中，硫代组氨酸溶于水中得到的硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.10-0.20mol/L，硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:2-4，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.5-0.6，进一步优选，硫代组氨酸溶于水中得到的硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.15mol/L，硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:3，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.58。
实施例1
一种麦角硫因的合成方法，包括以下步骤：
(1)室温下将组氨酸(1.55kg，10mol，1.0equiv)溶解在10L的四氢呋喃和水的体积比为1:1的混合溶剂中，慢慢加入氢氧化钠(0.4kg，10mol，1.0equiv)，之后慢慢加入二碳酸二叔丁酯(2.18kg，10mol，1.0equiv)，加入后室温搅拌反应10小时，TLC显示反应完成，用甲酸调节pH到4，加入20L水，析出大量固体，过滤干燥得到Boc保护的组氨酸2.32kg，产率91％。
(2)室温下将Boc保护的组氨酸(1.27kg，5mol，1.0equiv)溶解在5L的乙腈和水的体积比为1:1的混合溶剂中，加入溴化钠(0.52kg，5mol，1.0equiv)，之后慢慢加入醋酸碘苯(1.61kg，5mol，1.0equiv)，控制温度低于40℃。加完后室温搅拌反应3小时，TLC显示原料反应完成。再加入硫化钠(1.17kg，15mol，3.0e quiv)，升温到90℃，反应5小时，降到室温，加入10L水，加入硫酸调节溶液pH在4析出大量固体，过滤，干燥的硫代的Boc组氨酸1.1kg，产率77％。
(3)室温下将硫代的Boc组氨酸1.1kg溶解在三氟乙酸和二氯甲烷体积比为8:2的混合液中，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，室温搅拌1小时，TLC显示原料反应完成，减压抽干溶剂，将浓缩后的粘稠液体滴加到甲基叔丁基醚中析晶。过滤干燥得到灰白色固体产物硫代组氨酸。直接用于下一步反应。
(4)室温下将硫代组氨酸(0.93kg，5mol，1.0equiv)溶解在5L的水中，慢慢加入氢氧化钠(0.2kg，5mol，1.0equiv)，之后于零度下慢慢加入硫酸二甲酯(1.6kg，12.5mol，2.5equiv)，加入后0℃搅拌反应1小时，室温反应1小时，TLC显示反应完成，用甲酸调节pH到6，加入乙醇10L，此时会析出无机盐，过滤除去无机盐，母液减压抽干溶剂，用乙醇溶解，之后滴加到甲基叔丁基醚中析出固体，固体用甲醇和甲基叔丁基醚体积比为1:1的混合溶剂重结晶得产物麦角硫因纯品0.7kg，产率61％。
对得到的麦角硫因进行测试，如图1所示，HRMS(ESI，m/z)calcd for C9H16N3O2S[M+H]+：230.0958，found：230.0959.
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤(4)室温下将硫代组氨酸(9.3g，150mM，1.0equiv)溶解在水中，慢慢加入450mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:3，然后加入0.58mg EgtD(麦角硫因甲基转移酶，来源于Mycobacterium smegmatis)催化硫代组氨酸组氨酸的三甲基化反应，37℃反应2小时，生成麦角硫因，待转化完全后，用葡萄糖凝胶(Sephadex ged)柱除去酶，产物减压浓缩后用硅胶柱纯化得到纯的麦角硫因，可获得纯化的麦角硫因0.84g，产率90.3％。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤(1)中组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:2，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:0.9，搅拌反应的反应温度为10℃，反应时间为12小时。
步骤(2)中室温搅拌反应2小时，控制温度为40℃，反应完成后加入硫化钠，升温到70℃反应6小时，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为2.0mol/L，Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:1，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:0.9，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:2。
步骤(3)中搅拌反应0.5小时，第三溶剂为体积比1:1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L。
步骤(4)中加入后0℃搅拌反应0.5小时，再室温反应1.5小时，反应完成后用甲酸调节pH到5，硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为2.0mol/L，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:1.5。
实施例4
与实施例1相同，不同之处在于：
步骤(1)中组氨酸溶液的摩尔浓度为2.0mol/L，组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1.1，搅拌反应的反应温度为40℃，反应时间为8小时。
步骤(2)中室温搅拌反应4小时，控制温度为10℃，反应完成后加入硫化钠，升温到100℃反应4小时，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:2，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:1.1，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:10。
步骤(3)中搅拌反应1.5小时，第三溶剂为体积比9:1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为2.0mol/L。
步骤(4)中加入后零度搅拌反应1.5小时，再室温反应0.5小时，反应完成后用甲酸调节pH到7，硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:3.0。
实施例5
与实施例2相同，不同之处在于：
步骤(4)中硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:2，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.6。
实施例6
步骤(4)中硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:4，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.5。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种麦角硫因的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）组氨酸的Boc保护：将组氨酸溶解在第一溶剂中得到组氨酸溶液，依次加入氢氧化钠和二碳酸二叔丁酯，待二碳酸二叔丁酯加入后搅拌反应，反应完成后调节pH到3-5，加水析出固体，过滤干燥得到Boc保护的组氨酸；
（2）一锅法硫代：室温下将Boc保护的组氨酸溶解在第二溶剂中得到Boc保护的组氨酸溶液，依次加入溴化钠和醋酸碘苯，搅拌反应2-4小时，控制温度低于40℃，反应完成后加入硫化钠，升温到70℃-100℃反应4-6小时，反应完成后，降到室温，加入水，再加入硫酸调节溶液pH到3-5，析出固体，过滤干燥得到硫代的Boc组氨酸；
（3）Boc的脱除：室温下将硫代的Boc组氨酸溶解在第三溶剂中得到硫代的Boc组氨酸溶液，室温搅拌反应0.5-1.5小时，反应完成后减压抽干第三溶剂，将浓缩后的粘稠液体滴加到甲基叔丁基醚中析晶，过滤干燥得到硫代组氨酸；
（4）甲基化：将硫代组氨酸溶解在水中得到硫代组氨酸溶液，加入氢氧化钠，之后于零度下加入硫酸二甲酯0℃搅拌反应0.5-1.5小时，再室温反应0.5-1.5小时，反应完成后调节pH到5-7，产物经后处理得到纯化的麦角硫因；
或者将硫代组氨酸溶解在水中，依次加入S-腺苷甲硫氨酸和麦角硫因甲基转移酶，35℃-40℃反应1.5-2.5小时，生成产物麦角硫因，用葡萄糖凝胶柱除去酶，产物减压浓缩后用硅胶柱纯化得到纯化的麦角硫因。
2.根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（1）第一溶剂为体积比1:1的四氢呋喃和水的混合溶剂，组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0 mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（1）中组氨酸与氢氧化钠的摩尔比为1:1-2，组氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:0.9-1.1，搅拌反应的反应温度为10℃-40℃，反应时间为8-12小时。
4. 根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（2）中第二溶剂为体积比1:1的乙腈和水的混合溶剂，Boc保护的组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0 mol/L，Boc保护的组氨酸与溴化钠的摩尔比为1:1-2，Boc保护的组氨酸与醋酸碘苯的摩尔比为1:0.9-1.1，Boc保护的组氨酸与硫化钠的摩尔比为1:2-10。
5. 根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（3）所述的第三溶剂为体积比1:1-9:1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，硫代的Boc组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0 mol/L。
6.根据权利要求5所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，所述的三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为8:2。
7. 根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（4）所述的硫代组氨酸溶液的摩尔浓度为0.5-2.0 mol/L，硫代组氨酸与硫酸二甲酯的摩尔比为1:1.5-3.0。
8.根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（4）产物经后处理得到纯化的麦角硫因的具体步骤为：加入乙醇析出无机盐，过滤除去无机盐，母液减压抽干溶剂，用乙醇溶解，之后滴加到甲基叔丁基醚中析出固体，固体用体积比为1:1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂重结晶得纯化的麦角硫因。
9.根据权利要求1所述的麦角硫因的合成方法，其特征在于，步骤（4）所述的硫代组氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的摩尔比为1:2-4，硫代组氨酸与麦角硫因甲基转移酶的质量比为9300:0.5-0.6。
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