CN1143897C - 小麦叶片直接用于聚合酶链式和随机扩增长度多态性反应 - Google Patents
小麦叶片直接用于聚合酶链式和随机扩增长度多态性反应 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种小麦叶片经碱处理后直接作为模板用于PCR反应和RAPD反应的方法。该方法是取小麦叶片1-2cm经碱处理后直接作为PCR反应和RAPD反应的模板，并结合特定的扩增反应成份和反应程序，从而获得清晰的反应结果。该方法具有快速、简便、重复性好、对待测植株的损伤小等优点。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种小麦叶片经碱处理后直接作为模板用于聚合酶链式反应和随机引物多态性扩增反应的方法。
二、背景技术
随着分子生物学技术的不断发展，产生了多种基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记技术，如随机扩增长度多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)以及简单重复序列(SSR)分析等。这些标记技术可以用于种属特异性鉴定、外源导入基因的追踪、基因定位、遗传作图及基因分离等方面。这些标记技术的第一步即需提取待检样品的基因组DNA，用核酸定量分析确定提取的DNA浓度，取适量的DNA作为模板，再进行相应的聚合酶链式反应。常规的植物叶片提取DNA需相关的生化试剂和冷冻高速离心机等较昂贵的仪器设备，且提取一份样品的时间较长、工作量较大，尤其是进行特定基因的跟踪检测及多态性分析时，因检测的样品量多，用常规方法提取基因组DNA更显得费时费力且成本高。
三、发明内容
本发明应用碱处理小麦叶片直接作为PCR和RAPD反应模板，并结合改进反应条件和反应程序，其目的在于创立一种快速、有效、简便地进行植物DNA扩增的新方法。
本发明的具体内容是：
1、叶片的碱处理
剪取若干片小麦叶片(后称叶片)，每片长1～2cm，将叶片投入盛有0.2～0.3mol/LNaOH的离心管中，于沸水中煮20～35秒；取出离心管并向离心管内加入等当量的HCl和一定量的0.5mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)，摇匀后再于沸水中孵育1～3分钟。取出叶片，便可作为模板直接用于PCR反应和RAPD反应。
2、以碱处理叶片直接作为模板的PCR反应和RAPD反应
本PCR反应和RAPD反应同样需要在DNA扩增仪上进行设置的变性、退火、延伸若干个循环，反应产物经琼脂糖凝胶电泳、染色、观察及拍照记录。所不同的是鉴于模板不一样，反应时所使用的反应缓冲液有别于常规使用的缓冲液。本发明所使用的反应缓冲液为：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/LMgCl2、50～80mmol/LTris-HCl(pH8.8)。
3、以碱处理叶片直接作为模板的PCR反应和RAPD反应
①PCR反应。每20μl加入2μl上述反应缓冲液，并加入200mmol/L dNTP，各10pmol的PCR正、反方向引物，2U的Taq DNA聚合酶及约2mm2碱处理叶片，最后用无菌双蒸馏水定置至20μl。在PE9600型DNA扩增仪(美国产)上进行扩增。反应程序为：95℃ 1分钟变性后，按94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟设置进行40个循环。
②RAPD反应。每35μl加入3.5μl上述反应缓冲液，并加入100mmol/L dNTP，200pmol的10聚体随机引物，2U的Taq DNA聚合酶及约2mm2碱处理叶片，最后用无菌双蒸馏水定量至35μl。在PE9600型DNA扩增仪(美国产)上进行扩增。反应程序为：94℃ 5分钟变性后，按94℃ 1分钟、36℃ 1分钟、72℃ 2分钟的设置进行35个循环，循环结束后在72℃下延伸5分钟。
PCR反应及RAPD反应产物1.4％琼脂糖凝胶上电泳1.5小时(5v/cm)，以λDNA+EcoRI+HindIII为DNA标准分子量，溴化乙锭染色，紫外光下观察、拍照记录。
本发明用碱处理叶片替代提取待测植株叶基因组DNA作为PCR反应和RAPD反应的模板，在作物品种种性和纯度鉴定以及辅助田间育种材料的选育中，使检测所需的时间大大缩短、实验成本大幅度降低。例如：300份待测样品的检测工作一名技术人员在一天内即可完成。本方法不仅快速、简便，而且结果清晰、重复性好、准确可靠、对待测植株的损伤较小，是育种工作者所希望的，也是可以接受的一种分子标记的分析体系。
本发明应用于小麦目的基因的追踪检测、多态性分析等方面，使检测的时间大大缩短、实验成本大幅度降低。
四、附图说明
图1、图2是PCR反应扩增结果。
图3是RAPD反应扩增结果。
五、具体实施方式
非限定实施例：
一、小麦叶片的碱处理
1、剪取小麦叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.2mol/L NaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl 0.2mol/L HCl和100μl 0.5mol/LTris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Nonidet P40)，再次将该管放入沸水中孵育3分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR反应和RAPD反应的模板。
2、剪取小麦叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.25mol/L NaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮30秒，取出加入200μl 0.25mol/L HCl和100μl 0.5mol/LTris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Nonidet P40)，再次将该管放入沸水中孵育2分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR和RAPD反应的模板。
3、剪取小麦叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.3mol/L NaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl 0.3mol/L HCl和100μl 0.5mol/LTris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Nonidet P40)，再次将该管放入沸水中孵育1分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR反应和RAPD反应的模板。
二、用碱处理的小麦叶片直接作为模板的PCR反应和RAPD反应
1、配制反应缓冲液。反应缓冲液的成份及浓度如下：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/L MgCl2和50～80mmol/L Tris-HCl(pH8.8)。
2、利用碱处理叶片直接作为模板进行PCR反应应用于转基因材料的分析鉴定。
选用小麦转几丁质酶基因和Gus基因的再生植株F2代作为材料进行PCR分析鉴定。取F1代所结种子(即F2代)20～25℃，水培20天左右、剪取1～2cm长的叶片经前述的碱处理后直接作为PCR反应的模板。同时，作为对照，按常规方法对应地提取小麦基因组DNA，定量后取50ng作为PCR反应的模板。
PCR反应使用的引物见表1。PCR反应的其他条件如前述。
表1 PCR反应及RAPD反应所使用的引物及序列
PCR扩增结果见图1和图2。图1为检测几丁质酶基因的结果，图2为检测Gus基因的结果。在图1和图2中，M为DNA标准分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1-7为本发明方法进行PCR反应的结果，8-14为常规方法进行PCR反应的结果，其中，1与8、2与9、3与10、4与11、5与12、6与13、7与14分别是同一单株不同方法进行PCR反应结果。PCR检测分析结果显示，本发明方法和常规方法进行PCR反应的结果完全一致，单位株1与8、2与9的几丁质酶基因和Gus基因已经全部丢失，其余单株均含有这两种基因。几丁质酶基因及Gus基因扩增片段匀以
标示。
| 引物代号 | 引物序列(5’→3’) | 检测基因 |
| 1# | 正向：GGGATCCATCGCAGCGTAATG反向：GCCGACAGCAGCAGTTTCATC | 检测Gus基因 |
| 2# | 正向：GTAACATAGATGACACCGCG反向：GCCTCTGCTGCAGCCAGTACG | 检测几丁质酶基因 |
| 3# | GGACTGGAGT | RAPD多态性分析 |
3、利用碱处理叶片直接作为模板进行RAPD多态性分析
选用4种不同的小麦基因型，成熟种子20-25℃、水培萌发20天左右，剪取1～2cm长的叶片经前述的碱处理后直接作为RAPD反应的模板。同时，作为对照，按常规方法对应提取小麦基因组DNA，定量后取50ng作为RAPD反应使用的模板。RAPD反应的引物见表1，RAPD反应的其它条件如前述。
RAPD扩增结果见图3。在图3中，M为DNA标准分子量(λDNA+EcoRI+HindIII)，1-4为本发明方法进行PCR反应的结果，5-8为常规方法进行RAPD反应的结果，其中1与5、2与6、3与7、4与8分别是同一基因型不同方法进行RAPD分析的结果。RAPD分析结果表明，用本发明方法和常规方法进行RAPD反应的结果完全一致。所分析的4种不同小麦基因型使用3#引物均扩增出3条清晰的主带，未见多态性差异。
Claims (1)
1、一种小麦叶片直接作为模板用于PCR反应及RAPD反应，包括在DNA扩增仪上进行设置的变性、退火、延伸若干循环和反应产物的琼脂糖凝胶电泳、染色和观察，其特征在于：(1)小麦叶片经碱处理后直接作为模板用于PCR反应和RAPD反应，所述的碱处理方法如下：剪取供试小麦叶片1～2cm，放入含200μl 0.2～0.3mol/L NaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮20～35秒，取出加入等当量的HCl和100μl0.5mol/L Tris-HCl，Tris-HCl的pH值为8.0，再将该管放入沸水中孵育1～3分钟，取出叶片；(2)PCR反应和RAPD反应中加入如下组成和浓度的反应缓冲液：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/LMgCl2、50～80mmol/L Tris-HCl，Tris-HCl的pH值为8.8。
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