CN1143896C - 水稻叶片直接用于聚合酶链式反应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种水稻叶片直接用于聚合酶链式反应的方法，包括水稻叶片的碱处理和以碱处理后的水稻叶片直接作为模板的PCR反应。本发明应用于作物品种种性和纯度鉴定以及分子标记辅助田间育种材料的选择中，使检测的时间大大缩短，实验成本大幅度降低。本方法不仅快速、简便，而且结果清晰、重复性好、对待测植株的损伤小。

Description

水稻叶片直接用于聚合酶链式反应的方法
本发明涉及一种水稻叶片经碱处理后直接作为模板用于聚合酶链式反应的方法。
自从1980年Batstein等首次描述限制性片段长度多态性分析(RFLP)作为一种DNA分子标记后，随着分子生物学技术的发展，产生了多种基于聚合酶链式反应的分子标记技术，如随机扩增长度多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)以及简单重复序列(SSR)分析等。这些标记技术可以用于种属特异性鉴定、外源导入基因的追踪、基因定位、遗传作图及基因分离等方面。这些标记技术的第一步即需提取待检样品的基因组DNA，用核酸定量分析确定提取的DNA浓度，取适量的DNA作为模板，再进行相应的聚合酶链式(PCR)反应。常规的水稻叶片提取DNA需相关的有机及生化试剂和冷冻高速离心机等较昂贵的仪器设备，且提取一份样品的时间较长，工作量较大(卢扬江、郑康乐，中国水稻科学，1992，6(1)：47-48)，尤其是在利用聚合酶链式反应进行物种种性鉴定及辅助田间育种时，因检测的样品量多，用常规方法提取基因组DNA更显得费时费力且成本高。
本发明创造性地应用碱处理水稻叶片直接作为PCR反应模板，并结合改进PCR反应条件和反应程序，其目的在于创立一种快速、有效、简便地进行植物DNA扩增的新方法。
本发明的具体内容是：
1.水稻叶片的碱处理
剪取若干片水稻叶片(后称叶片)，每片长1～2cm。将叶片投入盛有0.2～0.3mol/L NaOH的离心管中，于沸水中煮20～35秒；取出离心管并向离心管内加入等当量的HCl和一定量的0.5mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)，摇匀后再于沸水中孵育1～3分钟。取出叶片，便可作为模板直接用于PCR反应。
2.以碱处理叶片直接作为模板的PCR反应
本PCR反应同样需要在DNA扩增仪上进行设置的变性、退火、延伸若干个循环，PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳、染色、观察及拍照记录。所不同的是鉴于模板不一样，反应时所使用的PCR反应缓冲液有别于常规使用的缓冲液。本发明所使用的PCR反应缓冲液为：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/L MgCl2、50～80mmol/L Tris-HCl(pH8.8)。
本发明用碱处理叶片替代提取待测植株叶片基因组DNA作为PCR反应的模板，在作物品种种性和纯度鉴定以及辅助田间育种材料的选育中，使检测所需的时间大大缩短、实验成本大幅度降低，例如，300份待测样品的检测工作一名技术人员在一天内即可完成。本方法不仅快速、简便，而且结果清晰、重复性好、准确可靠、对待测植株的损伤较小，是育种工作者所希望的、也是可以接受的一种分子标记的分析体系。
图1a、图1b是本发明应用于品种种性鉴定结果。图2a、图2b和图2c是本发明应用于转基因材料的追踪和辅助田间育种分析结果。
非限定实施例叙述如下：
一、水稻叶片的碱处理
1.剪取水稻叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.2mol/LNaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl0.2mol/L HCl和100μl0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Non-idet P40)，再次将该管放入沸水中孵育3分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR反应的模板。
2.剪取水稻叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.25mol/LNaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮30秒，取出加入200μl0.25mol/L HCl和100μl 0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Nonidet P40)，再次将该管放入沸水中孵育2分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR反应的模板。
3.剪取水稻叶片(3叶期最佳)1～2cm，放入含200μl 0.3mol/LNaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮35秒，取出加入200μl0.3mol/L HCl和100μl0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0，含0.25％(v/v)Non-idet P40)，再次将该管放入沸水中孵育1分钟，最后挑取一片(约2mm2)经过上述碱处理的叶片直接作为PCR反应的模板。
二、用碱处理的水稻叶片直接作为模板的PCR反应
4.配制PCR反应缓冲液。PCR反应缓冲液的成份及浓度如下：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/L MgCl2和50～80mmol/LTris-HCl(pH8.8)。
5.PCR反应。每20μl PCR反应中加入2μl上述缓冲液，并加入200mmol/L dNTP，各10pmol的PCR正、反向引物，2u的Taq DNA聚合酶及约2mm2碱处理叶片，最后用无菌双蒸馏水定量至20μl。在PE9600型DNA扩增仪(美国产)上进行扩增，反应程序为：95℃1分钟变性后按94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟设置40个循环。PCR反应产物在1.4％的琼脂糖凝胶上电泳1.5小时(5v/cm)，以EcoR I+Hind III酶切的λDNA为分子量标记，溴化乙锭染色，紫外光下观察、拍照记录。
三、利用碱处理叶片直接作为模板进行PCR反应用于品种种性的鉴定。
选用水稻杂交组合汕优63及其相应的三系珍汕97A、珍汕97B、明恢63种子(由安徽省农业科学院水稻研究所提供)。供试种子在26℃发芽至三叶期。剪切1～2cm长的叶片经前述的碱处理后直接作为PCR反应的模板。同时，作为对照，按常规方法(卢扬江、郑康乐，中国水稻科学，1992，6(1)：47-48)对应地提取水稻基因组DNA，定量后取50ng作为PCR反应的模板。
PCR反应的引物由本实验自行设计、合成(杨剑波、汪秀峰、李莉等，中华人民共和国发明专利申请公开说明书，专利文献出版社，CN1237328A；向太和、汪秀峰、李莉等，作物学报，2000，26(3)：292-296)，具体见表1。PCR反应如实施例4～5所述。
               表1 PCR引物及检测结果
引物代号 多态性标记大小或基因片段大小(bp) 检测结果
4# 900 汕优63、明恢63有多态性标记，珍汕97A、珍汕97B无。
7# 1700 珍汕97A、汕优63有多态性标记，珍汕97B、明恢63无。
    Pt     1100 含Xa21基因的水稻植株有该基因片段，其余均无。
PCR扩增反应结果见图1a和图1b。图1a为4#引物的PCR扩增结果。M为DNA标准分子量(λDNA+EcoR I+Hind III)，1、2、3、4、5、6、7、8为本发明方法进行PCR反应的结果，其中1、2是珍汕97B，3、4是珍汕97A，5、6是汕优63，7、8是明恢63。9、10、11、12为常规方法进行PCR反应的结果，其中9是珍汕97B，10是珍汕97A，11是汕优63，12是明恢63。多态性标记以“”标示。
图1b为7#引物的PCR扩增结果。M为DNA标准分子量(λDNA+EcoRI+Hind III)，1、2、3、4、5、6、7、8为本发明方法进行PCR反应的结果，其中1、2为珍汕97B，3、4为珍汕97A，5、6为汕优63，7、8为明恢63。9、10、11、12为常规方法进行PCR反应的结果，其中9为珍汕97B，10为珍汕97A，11为汕优63，12为明恢63。多态性标记以“”标示。
结果表明，由本发明方法和常规方法检测品种种性的结果完全一致，且与田间种植结果完全相符。
五、利用碱处理叶片直接作为模板进行PCR反应应用于转基因材料的追踪和辅助田间育种
选用转Xa21基因恢复系明恢63及其杂交、回交后代(由美国加州Scripps公司提供)。叶片直接取自田间自然生长的植株，剪取1-2cm长的叶片经前述的碱处理后直接作为PCR反应的模板。同时，作为对照，按常规方法对应地提取水稻基因组DNA，定量后取50ng作为PCR反应的模板。
PCR反应的引物Pt参照Zhang等使用的序列(Zhang Shiping，SongWen-Yuan，Chen Lili et al，Molecular Breeding，1998，4：551-558)，由本实验室合成，具体见表1。PCR反应如实施例4～5所述。
PCR扩增反应结果见图2a、图2b和图2c。图2a为转Xa21基因明恢63 F5代株系单株鉴定结果。M为DNA标准分子量(λDNA+EcoRI+Hind III)，1、2、3、4、5、6为本发明方法进行PCR反应的结果，7、8、9、10、11、12为常规方法进行PCR反应的结果。其中，1与7、2与8、3与9、4与10、5与11、6与12分别是同一单株的PCR反应结果。所检测的单株均含有Xa21基因片段，以“”标示。
图2b为转Xa21基因明恢63 F5与不育系057杂交的F2代鉴定结果。M为DNA标准分子量(λDNA+EcoR I+Hind III)，1、2、3、4、5为本发明发明方法进行PCR反应的结果，6、7、8、9、10为常规方法进行PCR反应的结果。其中，1与6、2与7、3与8、4与9、5与10分别是同一单株的PCR反应结果。除3与8不含Xa21基因片段外，其余均含有Xa21基因片段，以“”标示。
图2c为转Xa21基因明恢63 F5与未转Xa21基因明恢63回交的F1代鉴定结果。M为DNA标准分子量(λDNA+EcoR I+Hind III)，1、2、3、4、5、6为本发明方法进行PCR反应的结果，7、8、9、10、11、12为常规方法进行PCR反应的结果。其中，1与7、2与8、3与9、4与10、5与11、6与12分别是同一单株的PCR反应结果。1与7、2与8、6与12含Xa21基因片段，以“”标示。3与9、4与10、5与11不含Xa21基因片段。
结果表明，由本发明方法和常规方法检测转Xa21基因恢复系明恢63后代及其杂交、回交后代的结果完全一致，且与田间种植、接种抗白叶枯病菌株鉴定结果完全相符(含Xa21基因表现为高抗白叶枯病)。

Claims (1)

1、一种水稻叶片直接用于PCR反应的方法，包括在DNA扩增仪上进行设置的变性、退火、延伸若干循环和反应产物的琼脂糖凝胶电泳、染色和观察，其特征在于：(1)水稻叶片经碱处理后直接作为模板用于PCR反应，所述的碱处理方法为：剪取供试水稻叶片1～2cm，放入含200μl0.2～0.3mol/L NaOH的离心管中，将此离心管插入沸水中煮20～35秒，取出加入等当量的HCl和100μl0.5mol/L Tris-HCl(pH8.0)，再将该管放入沸水中孵育1～3分钟，取出叶片；(2)PCR反应中加入如下组成和浓度的反应缓冲液：10～20mmol/L(NH4)2SO4、1.5～3.0mmol/L MgCl2、50～80mmol/L Tris-HCl(pH8.8)。
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CN101429561B (zh) * 2008-12-18 2011-08-10 温州市农业科学研究院 用pcr检测水稻基因的方法及其用于该方法的pcr缓冲液
CN102312000A (zh) * 2011-09-07 2012-01-11 安徽农业大学 一种分子标记辅助选择抗稻瘟病双基因Pi1、Pi2的检测方法
CN103773869A (zh) * 2014-01-17 2014-05-07 兰州大学 紫花苜蓿胚根直接用于pcr反应的制备方法及其试剂盒
CN105002163A (zh) * 2015-08-03 2015-10-28 湖南省农业生物技术研究中心 一种用于提取水稻dna的试剂盒和水稻dna的提取方法
CN109897886A (zh) * 2019-04-16 2019-06-18 安徽省农业科学院水稻研究所 一种用于pcr扩增的水稻胚芽米dna模板获得方法及pcr方法
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