CN114377154B - 一种基于同步辐射光源的x射线荧光及荧光的双模态成像探针、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于同步辐射光源的X射线荧光及荧光的双模态成像探针、制备方法及应用。所述双模态成像探针是一种藻红B‑免疫球蛋白G复合物，通过免疫球蛋白G的酪氨酸氨基与藻红B的活化羧基共价偶联而成，所述藻红B‑免疫球蛋白G复合物同时具有荧光信号和X射线荧光信号。针对现有技术一直缺乏特异性同步辐射X射线荧光成像探针的问题，本发明首次创造性地提出这样一种藻红B‑免疫球蛋白G复合物及其制备方法，并由此提供了一种目标神经元双模态成像方法，对神经元成像以及同步辐射光源在生物医学领域的研究都具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物成像技术领域，更具体地涉及一种基于同步辐射光源的X射线荧光及荧光的双模态成像探针、制备方法及应用。
背景技术
脑成像技术和方法的发展对研究大脑的精细结构及理解大脑是如何工作起着非常重要的作用，荧光成像因其方便、亚微米分辨率而被广泛应用，但由于组织的散射和吸收，其成像深度和覆盖范围有限，而X射线具有较好的穿透深度，可以提供极好的能量分辨率，允许精细的光谱识别，这使得生物靶标的高度特异性成像成为可能。尤其同步辐射X射线的成像技术已经成为生物医学成像的重要手段。然而，目前缺乏针对某种神经元的同步辐射脑成像探针来研究神经元的结构和功能，如果能够开发高特异性X射线成像及荧光的双模态成像探针，就可以兼具两种成像的优势，从而更好的认识和理解脑的结构和功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于同步辐射光源的X射线荧光及荧光的双模态成像探针、制备方法及应用，从而解决同步辐射光源进行脑成像缺乏神经元特异性的探针，因此很难实现高度特异性神经元成像的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种基于同步辐射光源的X射线荧光及荧光的双模态成像探针，所述双模态成像探针是一种藻红B-免疫球蛋白G复合物，通过免疫球蛋白G的酪氨酸氨基与藻红B的活化羧基共价偶联而成，所述藻红B-免疫球蛋白G复合物同时具有荧光信号和X射线荧光信号，从而可以利用同步辐射X射线荧光进行成像，实现对某类神经元的特异性成像。
本发明中，对于所述免疫球蛋白G选择：为可与目标神经元一抗的特异性一抗结合的免疫球蛋白G，可以是羊抗兔、羊抗鼠、兔抗鼠、鼠抗鼠等免疫球蛋白G；所述的荧光染料分子藻红B结构中具有碘元素和羧基。
根据本发明的第二方面，还提供一种如上面所述的双模态成像探针的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：S1：在-30℃～-10℃条件下，在反应溶剂二氧六环中，以三乙胺作为敷酸剂，采用氯甲酸异丁酯对藻红B中的羧基进行活化；S2：将免疫球蛋白G溶解到磷酸盐与碳酸盐缓冲液中，然后将其加入步骤S1中的藻红B中，进行酰胺化反应，即可获得一种藻红B-免疫球蛋白G复合物；其中，所述免疫球蛋白G与所述藻红B的用量摩尔比为1∶10～1∶20。
根据本发明提供的藻红B-免疫球蛋白G复合物的制备方法，其反应原理为：采用酰胺化方法使所述免疫球蛋白G大分子的表面氨基与所述荧光染料分子中的羧基反应形成酰胺键，从而制备出藻红B-免疫球蛋白G复合物。
步骤S1中，所述藻红B与反应溶剂二氧六环的用量为10～20mg藻红B/mL二氧六环；所述藻红B与氯甲酸异丁酯的摩尔比为1∶1～1∶2；所述活化的时间为4～8小时。
步骤S2中，所述免疫球蛋白G在磷酸盐与碳酸盐缓冲液中的浓度为2～3mg免疫球蛋白G大分子/mL磷酸盐与碳酸盐缓冲液；所述酰胺化反应的时间为12～24小时。
所述制备方法还包括步骤S3：将完成所述酰胺化反应的溶液装入透析袋中，在PBS溶液中透析以去除反应溶剂，再通过离心去除因聚集形成的大颗粒，然后采用sephadexG25脱盐柱脱盐，最后通过超滤以除去小分子物质，最终获得所述藻红B-免疫球蛋白G复合物。
步骤S1中，所述活化的时间以使藻红B的羧基充分活化为准，较佳地为使反应液呈透明的紫红色为准，一般为0.5～1.5小时。
步骤S2中，所述免疫球蛋白G的用量可根据本领域常规方法进行选择，优选地，所述免疫球蛋白G与所述藻红B的用量摩尔比为1∶10～1∶20，使得最终得到的复合物中所述免疫球蛋白G与所述藻红B的摩尔比为1∶1～1∶15。
更优选地，最终复合物中藻红B与免疫球蛋白G的摩尔比为1∶10～1∶15。
步骤S2中，所述免疫球蛋白G的磷酸盐和碳酸盐混合溶液的浓度为本领域的常规浓度，较佳地为每mL磷酸盐与碳酸盐缓冲液中含2～3mg免疫球蛋白G。
步骤S2中，所述酰胺化反应的时间可根据本领域常规方法进行选择，本反应采用18～24小时。
根据本发明的第三方面，提供一种目标神经元双模态成像方法，包括下述步骤：P1：制备组织样品：提供一种根据权利要求1所述的双模态成像探针，将所述双模态成像探针与孵育完目标神经元一抗的脑组织共同孵育，所述藻红B-免疫球蛋白G复合物与脑部目标神经元特异性识别；P2：采用同步辐射X射线荧光成像技术及荧光成像技术分别对步骤P1制备得到的所述组织样品进行X射线荧光成像及荧光成像，即可。
其中，步骤P1可采用本领域此类样品的常规制备方法进行，本发明中较佳地根据下述工序进行：将组织切片置于24孔板上，4℃条件下与目标抗体共孵育18～24小时，再与所述藻红B-免疫球蛋白G复合物室温共孵育1～3小时，吸掉所述复合物溶液并清洗，将所述组织贴在mylar膜上，室温下风干待用。
其中，所述的目标抗体为待测神经元的免疫荧光染色采用的一抗。
其中，所述目标抗体的稀释比例为1/200～1/400。
其中，所述藻红B-免疫球蛋白G复合物较佳浓度0.001-0.01M。
其中，所述的清洗采用本领域常规方法进行，一般为用0.01M PBS溶液清洗3遍即可。
其中，所述的mylar膜为同步辐射X射线显微微探针技术中常用的用于负载样品的聚酯薄膜。
其中，步骤P2可根据本领域同步辐射X射线显微微探针技术的常规方法进行，本发明优选通过下述工序进行：在同步辐射X射线装置上设定碘元素的k边敏感域，进行区域粗扫描；对单个细胞进行精细扫描，成像即可。
其中，所述的成像是通过该同步辐射X射线装置自带软件进行数据和图像分析后得到的结果，其中涉及的数据分析以及图像分析为本领域对该种检测方法进行分析的常规方法。本发明中涉及的各种软件功能均可以在现有的硬件条件下结合现有的软件编程手段加以实现，故其具体实现过程在此均不做赘述。
其中，所述粗扫描的步长一般为0.01mm，粗扫描的时间一般为0.5s。
其中，所述精细扫描的步长一般为0.002mm，精细扫描的时间一般为2s。
其中，当检测所述碘元素时，所述的k边敏感域为3.78-4.37keV。
本发明所用的原料和试剂均市售可得。
应当知晓的是，藻红B是荧光素的碘化衍生物，由于其显著的光谱发光特性，它被广泛用于光动力疗法，化学和生物学中的荧光探针。此外，由于一个藻红B分子含有四个碘原子，它具有X射线吸收及荧光信号。
本发明的关键发明点在于，针对现有技术一直缺乏特异性同步辐射X射线荧光成像探针的问题，本发明首次提出采用一分子含有4个碘原子的藻红B与免疫球蛋白G通过酰胺化反应制备出一种藻红B-免疫球蛋白G复合物，进一步利用该复合物通过荧光成像和同步辐射X射线荧光信号定位某类神经元，实现碘元素的定位并成像此类神经元。本发明除了首次创造性地提出这样一种藻红B-免疫球蛋白G复合物及其制备方法，还由此提供了一种目标神经元双模态成像方法，对神经元成像以及同步辐射光源在生物医学领域的研究都具有重要的意义和应用价值。
根据本发明提供的藻红B-免疫球蛋白G复合物的制备方法，采用的羧基活化的条件反应温度为-30℃～-10℃才能实现，温度条件控制极其重要。对于仅仅用于荧光成像来说其他染料分子更优。藻红B除了有荧光信号，还含有碘，这个信号检测需要借助高灵敏的同步辐射荧光大科学装置才能检测，因此不太容易想到，然而本发明利用该探针实现了某类特征细胞特异性的同步辐射X射线荧光成像。
根据本发明提供的一种基于同步辐射光源的X射线荧光及荧光的双模态成像探针、制备方法及应用，相对现有技术的积极进步效果如下：
1)本发明提供了一种藻红B-免疫球蛋白G复合物，利用该复合物能够实现特定类型神经元定位与成像，本发明的复合物以及检测方法对神经元成像以及同步辐射光源在生物医学领域的研究都具有重要的意义和应用价值；
2)由于本发明的藻红B-免疫球蛋白G复合物中不含放射性元素，因此不会造成放射性污染，也不受其半衰期的影响；
3)本发明藻红B-免疫球蛋白G复合物的制备方法反应条件温和，操作简单，产率能实现90％以上。
综上所述，本发明提供了一种免疫球蛋白G偶联藻红B的制备方法，克服了现有的染料分子难以实现X射线成像的缺陷，利用藻红B的结构性质，对其表面进行羧基修饰，使整个分子既具有荧光性质，又具有X射线的荧光性质，实现了对脑部目标神经元的荧光成像及同步辐射X射线荧光成像。
附图说明
图1为实施例2中得到的藻红B-免疫球蛋白G复合物的电泳图谱；
图2为实施例2中得到的藻红B-免疫球蛋白G复合物的光谱表征图；
图3为脑部多巴胺能神经元的示意图(A)、荧光成像(B，D)以及同步辐射X射线荧光成像图(C，E)。
具体实施方式
下面给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。
下述实施例中使用的同步辐射X射线装置为上海同步辐射光源(单位全称)的硬X射线显微微探针(BL15U)线站的装置。
实施例1制备藻红B-免疫球蛋白G复合物
取5.2mg藻红B，1μL三乙胺，10μL氯甲酸异丁酯，溶解到360μL1，4-二氧六环，-10℃条件下反应1h待用。取0.622mg免疫球蛋白G溶解到240μL PBS缓冲液和60μL碳酸盐缓冲液待用，加入4μL藻红B反应液于4℃过夜反应。通过透析袋去除有机反应溶剂，在PBS溶液中透析48h，每12h更换一次PBS溶液，3000转每分钟离心去除因聚集形成的大颗粒，采用sephadex G25脱盐柱实现高效脱盐，通过10000超滤管除去10kDa以下的颗粒，除去小分子物质，得到150kDa的藻红B-免疫球蛋白G的复合物。
该实施例中免疫球蛋白G与藻红B的用量摩尔比为1∶15。
实施例2藻红B-免疫球蛋白G复合物的鉴定
取免疫球蛋白G和藻红B-免疫球蛋白G，与溴酚蓝上样缓冲液在95℃以上煮沸10min变性，冷却后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳待溴酚蓝到达底部停止，在快速考马斯亮蓝染色液中染色30-60min，脱色使用Syngene GBOX化学发光成像仪和BlueLight Gel Imager拍胶。
如图1所示，连上藻红B的免疫球蛋白G条带在白光条件下与免疫球蛋白G接近，而在波长为340nm的紫外光照射下，藻红B-免疫球蛋白G复合物轻链和重链条带显示黄绿色荧光，表明藻红B成功连接到了免疫球蛋白G上。应当理解的是，胶图中复合物对应条带为免疫球蛋白G在变性胶中的两条重链50kDa和两条轻链25kDa，共150kDa，因此跑胶条带分别在50和25kDa的位置。
取免疫球蛋白G和藻红B-免疫球蛋白G在最大紫外可见吸收波长下扫描发射波谱，在最大发射波长下扫描激发波谱。如图2所示，藻红B-免疫球蛋白G复合物的激发光谱和发射光谱均较免疫球蛋白G出现了红移，表明藻红B-免疫球蛋白G复合物成功合成。
实施例3组织样品的制备
取经4％多聚甲醛心室灌注后蔗糖脱水，使用Leica CM1950切片机切出30μm厚切片，将所述组织切片样品置于24孔板底部，4℃条件下与目标神经元的一抗共孵育18～24小时，再与所述实施例1中藻红B-免疫球蛋白G复合物室温共孵育2小时，吸掉所述复合物溶液并清洗，将所述组织贴在mylar膜上，室温下避光条件下风干待用。
实施例4多巴胺能神经元成像
将由实施例2得到的载有组织样品的mylar膜置于样品架上，先通过调节显微镜X、Y的距离对样品进行聚焦，设定碘元素的感兴趣区域(3.93kev-4.37kev)，选定一定区域进行粗扫描，粗扫描步长为0.01mm，扫描时间为0.5s。然后选定单个细胞进行精细扫描进行X射线荧光检测及成像，精细扫描步长定为0.002mm，扫描时间定为2s。扫描完毕后用系统自带软件进行数据和图像分析，得到成像结果。
如图3所示，利用该探针进行黑质部位多巴胺能神经元的检测，不仅获得了多巴胺能神经元荧光成像信息(B，D)，而且成功进行了同步辐射X射线荧光成像(C，E)，该探针可用于特定神经元双模态成像。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种双模态成像探针在制备同步辐射光源的X射线荧光及荧光成像制剂中的应用，其特征在于，所述双模态成像探针是一种藻红B-免疫球蛋白G复合物，通过免疫球蛋白G的酪氨酸氨基与藻红B的活化羧基共价偶联而成，所述藻红B-免疫球蛋白G复合物同时具有荧光信号和X射线荧光信号。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫球蛋白G为可与目标神经元的特异性一抗结合的免疫球蛋白G，包括：羊抗兔、羊抗鼠、兔抗鼠、鼠抗鼠免疫球蛋白G。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双模态成像探针的制备方法包括下述步骤：
S1：在-30℃~-10℃条件下，在反应溶剂二氧六环中，以三乙胺作为敷酸剂，采用氯甲酸异丁酯对藻红B中的羧基进行活化；
S2：将免疫球蛋白G溶解到磷酸盐与碳酸盐缓冲液中，然后将其加入步骤S1中的藻红B中，进行酰胺化反应，即可获得一种藻红B-免疫球蛋白G复合物；
其中，所述免疫球蛋白G与所述藻红B的用量摩尔比为 1：10~1：20。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述藻红B与反应溶剂二氧六环的用量为10~20mg藻红B/mL 二氧六环；所述藻红B与氯甲酸异丁酯的摩尔比为 1：1~1：2；所述活化的时间为4~8小时。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S2中，所述免疫球蛋白G在磷酸盐与碳酸盐缓冲液中的浓度为 2～3mg 免疫球蛋白G大分子/mL磷酸盐与碳酸盐缓冲液；所述酰胺化反应的时间为12～24小时。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述双模态成像探针的制备方法还包括步骤S3：将完成所述酰胺化反应的溶液装入透析袋中，在PBS溶液中透析以去除反应溶剂，再通过离心去除因聚集形成的大颗粒，然后采用sephadex G25 脱盐柱脱盐，最后通过超滤以除去小分子物质，最终获得所述藻红B-免疫球蛋白G复合物。
7.一种以非诊断、非治疗为目的的目标神经元双模态成像方法，其特征在于，包括下述步骤：
P1：制备组织样品：提供一种根据权利要求1所述的双模态成像探针，将所述双模态成像探针与孵育完目标神经元一抗的脑组织共同孵育，所述藻红B-免疫球蛋白G复合物与脑部目标神经元特异性识别；
P2：采用同步辐射X射线荧光成像技术及荧光成像技术分别对步骤P1制备得到的所述组织样品进行X射线荧光成像及荧光成像，即可。
8.如权利要求7所述的目标神经元双模态成像方法，其特征在于，步骤P1中所述组织样品的制造方法包括：将所述组织样品置于24孔板底部，于4℃与目标神经元一抗共孵育18~24小时，再与所述藻红B-免疫球蛋白G复合物室温共孵育1~3小时，吸掉多余的所述藻红B-免疫球蛋白G复合物并清洗，将所述组织样品贴在mylar膜上，室温避光条件下风干待用。
9.如权利要求8所述的目标神经元双模态成像方法，其特征在于，步骤P2包括：在同步辐射X射线装置上设定碘元素的k边敏感域，进行区域粗扫描；对单个细胞进行精细扫描，成像即可；其中，所述粗扫描的步长为0.01 mm，粗扫描的时间为0.5 s；所述精细扫描的步长为0.002 mm，精细扫描的时间2s；当检测碘元素时，所述k边敏感域为3.78-4.37 keV。
10.如权利要求7所述的目标神经元双模态成像方法，其特征在于，步骤P1中，所使用的所述藻红B-免疫球蛋白G复合物的浓度为0.001~0.01 M。
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