CN114369667A - 长非编码rna在舌鳞癌诊治中的应用 - Google Patents

长非编码rna在舌鳞癌诊治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供长非编码RNA在舌鳞癌诊治中的应用，属于生药医药和分子生物学技术领域。本发明首次证明了LINC01356表达随舌鳞癌恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。干扰LINC01356表达后抑制了舌鳞癌细胞的增殖，并促进其凋亡，可作为一种有效的药物用于预防和/或治疗舌鳞癌。本发明为舌鳞癌的诊断、预后评估分析提供了更为有利的手段，这对于舌鳞癌的研究、治疗具有重要的意义。同时也为开发高效的治疗舌鳞癌相关药物奠定实验基础并提供新的视野，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

长非编码RNA在舌鳞癌诊治中的应用
技术领域
本发明属于生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及长非编码RNA在舌鳞癌诊治中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)简称舌鳞癌，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，侵袭性强，易发生颈淋巴结转移。尽管在预防和治疗方面取得了重大进展，TSCC患者的生存率仍然很低。结果表明，肿瘤的侵袭和迁移是肿瘤发生发展的主要原因。因此，通过对舌鳞状细胞癌潜在分子机制的探索，开发新的治疗策略，从而延长患者生存期、提高患者生存质量，是舌鳞癌治疗领域面临的重要挑战。
非编码RNA是一类不参与编码蛋白质而通过RNA形式发挥功能的分子。近年来成为多种疾病、特别是肿瘤防治领域中的研究热点。miRNA、长非编码RNA和环状RNA等非编码RNA均被报道在各类肿瘤中异常表达，并参与肿瘤的发生发展。其中，长非编码RNA(LncRNA)长度超过200个核苷酸单位，没有或仅有有限的蛋白编码能力。依据所在细胞内的位置不同，LncRNA具有调节染色质及基因调节的功能。另外，现有研究表明，LncRNA的异常表达与多种肿瘤、心血管疾病等紧密相关。然而，目前LncRNA在舌鳞癌中的作用的相关研究仍然较少，因此有必要探寻更加有效的LncRNA作为舌鳞癌临床诊断、治疗检测的标记物和靶点。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供长非编码RNA在舌鳞癌诊治中的应用。本发明首次发现LINC01356的表达量在舌鳞癌中异常高表达，且与舌鳞癌患者预后紧密相关，进一步研究证明，干扰LINC01356表达可抑制舌鳞癌细胞的增殖，促进其细胞凋亡。因此，LINC01356可作为舌鳞癌的诊断分子生物标志物，同时也可作为舌鳞癌的预后指标和潜在治疗靶点，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供用于检测LINC01356的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断产品；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估产品。
本发明通过研究发现，LINC01356在头颈部鳞癌中的表达显著高于正常组织，提示LINC01356在人舌鳞癌进展中发挥作用。同时，LINC01356高表达患者的预后显著差于LINC01356低表达患者。因此，LINC01356可作为是一种新的舌鳞癌预后标志物，为患者生存期评估提供依据。
本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测LINC01356的物质，所述产品具有如下任意一种或多种用途：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估。
本发明的第三个方面，提供一种用于舌鳞癌预后评估或辅助预后评估的系统，所述系统包括：
b1)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自LINC01356表达水平的检测物质，以及；
b2)评估单元，所述评估单元包含：根据b1)中确定的所述LINC01356表达水平对所述受试者进行预后评估。
所述预后评估或辅助预后评估包括对受试者的总生存期进行评估。
本发明的第四个方面，提供上述LINC01356作为靶点在舌鳞癌治疗和/或筛选舌鳞癌药物中的应用。
本发明的第五个方面，提供一种筛选舌鳞癌药物的方法，包括：
c1)采用候选物质处理表达和/或含有所述LINC01356的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；
c2)完成步骤c1)后，检测体系中所述LINC01356的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述LINC01356的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的舌鳞癌药物。
本发明的第六个方面，提供抑制所述LINC01356表达的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌。
本发明的第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括用于抑制LINC01356表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次证明了LINC01356表达随舌鳞癌恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。干扰LINC01356表达后抑制了舌鳞癌细胞的增殖，并促进其凋亡，可作为一种有效的药物用于预防和/或治疗舌鳞癌。
上述技术方案为舌鳞癌的诊断、预后评估分析提供了更为有利的手段，这对于舌鳞癌的研究、治疗具有重要的意义。同时也为开发高效的治疗舌鳞癌相关药物奠定实验基础并提供新的视野，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例中LINC01356在舌鳞癌中的表达，*P＜0.05。
图2是本发明实施例中LINC01356在人头颈部鳞癌中的预后分析。
图3是本发明实施例中LINC01356 qPCR检测LINC01356的表达。
图4是本发明实施例中CCK8检测细胞增殖。
图5是本发明实施例中流式细胞术检测细胞凋亡相关图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
技术人员应理解，术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)PCR)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。
发明人前期通过基因测序技术，筛选了舌鳞癌中特异性表达的LncRNA成员，其中LINC01356作为候选基因，差异性大，且在舌鳞癌中尚无报道，提示其可能作为一种新的诊治舌鳞癌的分子生物标志物。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供用于检测LINC01356的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断产品；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估产品。
本发明通过研究发现，LINC01356在头颈部鳞癌中的表达显著高于正常组织，提示LINC01356在人舌鳞癌进展中发挥作用。同时，LINC01356高表达患者的预后显著差于LINC01356低表达患者。因此，LINC01356可作为是一种新的舌鳞癌预后标志物，为患者生存期评估提供依据。
所述应用a2)中，舌鳞癌预后评估包括对舌鳞癌患者总生存期的预测。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测LINC01356的物质，所述产品具有如下任意一种或多种用途：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估。
本发明的又一具体实施方式中，检测LINC01356的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测LINC01356的表达水平的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品包括但不限于检测待测样本中所述LINC01356表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。
本发明的又一具体实施方式中，所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者舌组织。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于舌鳞癌预后评估或辅助预后评估的系统，所述系统包括：
b1)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自LINC01356表达水平的检测物质，以及；
b2)评估单元，所述评估单元包含：根据b1)中确定的所述LINC01356表达水平对所述受试者进行预后评估。
本发明的又一具体实施方式中，所述预后评估或辅助预后评估包括对受试者的总生存期进行评估；
本发明的又一具体实施方式中，当受试者LINC01356表达水平高于阈值时为高表达，则示受试者总生存期较短；
受试者LINC01356表达水平低于阈值时为低表达，则指示受试者总生存期较长。
所述阈值为舌鳞癌患者LINC01356表达水平与总生存期之间的最佳截断值，在本发明的一个具体实施方式中，所述最佳截断值为4.7。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述LINC01356作为靶点在舌鳞癌治疗和/或筛选舌鳞癌药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述舌鳞癌药物为预防和/或治疗舌鳞癌的药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种筛选舌鳞癌药物的方法，包括：
c1)采用候选物质处理表达和/或含有所述LINC01356的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；
c2)完成步骤c1)后，检测体系中所述LINC01356的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述LINC01356的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的舌鳞癌药物。
本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明的又一具体实施方式中，所述细胞体系中的细胞可以为舌鳞癌细胞；
本发明的又一具体实施方式中，所述组织体系中的组织可以为舌鳞癌舌组织；
本发明的又一具体实施方式中，所述器官体系中的器官可以为舌；
本发明的又一具体实施方式中，所述动物体系中的动物可以为哺乳动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、人等。
本发明的又一具体实施方式中，提供抑制所述LINC01356表达的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌。
其中，降低LINC01356表达水平的物质包括针对LINC01356的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述siRNA包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
所述产品可以为药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括用于抑制LINC01356表达水平的物质。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌。
其中，抑制LINC01356表达水平的物质包括针对LINC01356的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述siRNA包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列。
所述产品可以为药物。
根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗舌鳞癌相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
根据本发明，上述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
一、材料与方法
1.实验材料
1.1基因信息
物种 基因名称 Gene ID 基因全名
Human LINC01356 100996702 long intergenic non-protein coding RNA 1356
1.2细胞信息：人舌鳞癌细胞CAL-27、SCC9来自上海中科院细胞库。
细胞名 细胞中文名 来源物种
CAL-27 舌鳞癌细胞 人
SCC9 舌鳞癌细胞 人
2.主要试剂
2.1购买试剂
1)DMEM培养液购自美国HYCLONE公司。
2)血清购自Gibco公司。
3)双抗、0.25％胰酶消化液、CCK-8试剂购自北京索莱宝公司。
4)Lipofectamine2000脂质体购自美国Invitrogen公司。
5)RNA抽提试剂盒Ultrapure RNA kit，反转录试剂盒HiFiScript cDNASynthesis Kit，荧光定量PCR试剂盒UltraSYBR Mixture均购自北京康为世纪公司。
6)实验用引物由北京金唯智公司合成(Genewiz Beijing,China)。
7)LINC01356的RNA干扰序列及其阴性对照由山东杰凯生物有限公司合成。
8)Transwell小室购自美国millipore公司。
9)In Situ Cell Death Detection Kit,Fluorescein购自美国Roche公司。
2.2溶液配制
1)D-Hank’S液：称取NaCl 8g，KCl0.4g，Na2Hpo4.H2O 0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，用双蒸水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱内保存备用。
2)0.25％胰蛋白酶：称取一定量的胰蛋白酶，用Hanks平衡盐溶液配成0.25％的溶液，0.22μm滤器过滤除菌，4℃冰箱内保存备用。
3)PBS：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 12H2O2.94g，调pH至7.4，ddH2O定容至1L，高压蒸汽灭菌30min
3.仪器设备
1)冻存管、离心管：美国Coming公司。
2)细胞培养瓶、培养皿及各型号孔板：美国eppendorf公司
3)低温高速离心机：国IEC公司。
4)倒置显微镜：Olympus公司。
5)Biophtometry紫外分光光度仪：德国Eppendorf公司
6)GeneAmp2400型PCR仪：美国PE公司。
7)HH.W型恒温水浴箱：江苏恒丰仪器厂。
8)CO2水套细胞培养箱：美国Forma Scietific公司。
9)RC.5C型高速低温离心机：美国DC Pount公司。
10)移液器：Eppendorf公司。
11)iMark多功能酶标仪购自美国BIO-RED公司。
12)4℃/-20℃、-80℃冰箱：青岛海尔股份有限公司
13)电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司
14)磁力加热搅拌器：常州国华仪器有限公司
15)pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司
16)电热恒温水槽：天津欧诺仪器股份有限公司
17)高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司
4.实验方法
4.1引物设计，小干扰合成
4.1.1基因LINC01356小干扰RNA由北京欧林格生物技术有限公司合成；
小干扰信息如下：
靶点 靶点序列(5’-3’)
si-LINC01356-1 GCUUUCCACGCGCUUGUUU(SEQ ID NO.1)
si-LINC01356-2 GCCCAAGCUAAGCCAUCAU(SEQ ID NO.2)
NC TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO.3)
4.1.2内参基因和目的基因引物由山东杰凯生物科技有限公司设计，金唯智合成；
引物信息如下：
Figure BDA0003539241970000111
Figure BDA0003539241970000112
4.2细胞培养
4.2.1.细胞复苏
1)将盛有细胞的冻存管从液氮罐中取出，立刻放入37℃恒温水浴箱，快速摇动冻存管，使其融化。
2)用浓度为75％的酒精棉球擦拭管壁外周后，移至超净工作台内。
3)用无菌吸管吸出冻存管内的细胞悬液，加入已盛有5ml DMEM完全培养液(含10％胎牛血清)的无菌离心管中，混匀后置于离心机中，低速离心10分钟。
4)弃去上清液，加入新鲜的细胞培养液轻轻吹悬细胞，接种于已盛有适量DMEM完全培养液(血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml,链霉素为0.1mg/ml)的培养皿中。
5)将无菌培养皿移入温度为37℃、含5％C02的细胞培养箱中常规培养，24h后更换新培养液，以后根据细胞的生长状态，每2-3天换液一次。
4.2.2.细胞传代及培养
1)将培养瓶放入倒置显微镜下观察，当发现细胞融合至培养瓶的70％-80％时，即可进行细胞传代。
2)使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清，再用培养液重悬。
3)反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验。
4.3细胞转染
按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染。
1)待六孔板中的细胞汇合度达到80％时，于转染前两小时更换无抗生素的培养液，进行Lipofectamine2000介导细胞转染。
2)准备复合物
a)取250ul无血清无抗生素的培养液稀释siRNA寡聚物，并轻轻混匀。
b)轻轻混匀Lipofectamine2000，稀释5ul脂质体于250ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀在室温下孵育5min。
c)5min后将Lipofectamine2000和稀释的siRNA混合，并轻轻混匀，室温孵育20min,使复合物形成。
3)将混合物(总体积500ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀，放入培养箱中培养。
4)将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液。
5)48h后可以观察转入基因表达情况。
4.4实时荧光定量PCR(RT-PCR)
使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，一部分用于下游实验，剩余部分冻存到-80℃冰箱中。SYBR法检测各样本相应指标的mRNA水平，每反应进行3个重复。2-ΔCt法分析数据。
相关引物见4.1。
4.5CCK8法检测细胞增殖情况
细胞转染24h后，离心弃去上清，制备细胞悬液并计数，取100ul细胞悬液,以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ul CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线。
4.6细胞凋亡流式检测
细胞加药处理24h后，离心，移去培养基，更换成无血清培养基，常规条件下培养饥饿24h。收集细胞到离心管中，1000rpm离心5min，再次加入4℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清。加入1X结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1-5×106/ml。取100ul细胞悬液至于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min.加入10ul PI染液，并加400ulPBS，后进行上机检测。Flowjo软件对流式结果进行分析处理。
4.7统计学分析
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
二、结果
1.表达与预后分析
利用TCGA数据库分析LINC01356在头颈部鳞癌中的表达。经过在线数据分析并绘制箱式图，发现LINC01356在头颈部鳞癌中的表达显著高于正常组织，提示LINC01356在人舌鳞癌进展中发挥作用(P＜0.05)(图1)。
2.在舌鳞癌中LINC01356低表达患者预后较好
利用TCGA数据库分析LINC01356在头颈部鳞癌中的预后作用。结果显示，LINC01356高表达患者的预后显著差于LINC01356低表达患者(P＜0.05)(图2)。
3.LINC01356在细胞系中的表达及干扰株构建
为探讨LINC01356在人舌鳞癌中的功能，选择了CAL-27和SCC9细胞株为研究对象。构建LINC01356敲低细胞株(转染siLINC01356，KD)，设空白对照(转染试剂，CON)和阴性对照(转染siNC，NC)。
将LINC01356的小干扰转染，并收集CON、NC、KD组的RNA。qPCR结果显示，在KD组中，LINC01356的表达显著下降(图3)。
结论：实验在CAL-27和SCC9细胞中使用si-LINC01356-1对LINC01356基因干扰进行后续研究。
4.LINC01356对舌鳞癌细胞增殖的影响
通过CCK8实验检测LINC01356对人舌鳞癌细胞增殖影响。结果显示，干扰LINC01356表达后，CAL-27和SCC9细胞增殖显著下降(图4)。
5.LINC01356对舌鳞癌细胞凋亡的影响
通过流式细胞术检测LINC01356对舌鳞癌细胞凋亡的影响。结果显示，干扰LINC01356表达后，与NC组相比CAL-27和SCC9细胞凋亡数量增加(图5)。
综上可知：
1.LINC01356在人舌鳞癌组织中高表达，并可指导预后；
2.细胞功能实验显示，干扰LINC01356表达可抑制CAL-27、SCC9细胞的增殖，同时促进细胞凋亡。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东杰凯生物科技有限公司
<120> 长非编码RNA在舌鳞癌诊治中的应用
<130> 202127954
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcuuuccacg cgcuuguuu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcccaagcua agccaucau 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agacctgtac gccaacacag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggactcgtc atactcctgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaacttccc gaggtcactg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgtagtaga gggaagcgac 20

Claims (10)

1.用于检测LINC01356的物质在制备如下任意一种或多种产品中的应用：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断产品；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估产品。
2.如权利要求1所示应用，其特征在于，所述应用a2)中，舌鳞癌预后评估或辅助预后评估包括对舌鳞癌患者总生存期的预测。
3.一种产品，其特征在于，所述产品包含用于检测LINC01356的物质，所述产品具有如下任意一种或多种用途：
a1)舌鳞癌诊断或辅助诊断；
a2)舌鳞癌预后评估或辅助预后评估。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，检测LINC01356的物质包括用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测LINC01356的表达水平的物质；
所述产品包括检测待测样本中所述LINC01356表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。
5.一种用于舌鳞癌预后评估或辅助预后评估的系统，其特征在于，所述系统包括：
b1)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自LINC01356表达水平的检测物质，以及；
b2)评估单元，所述评估单元包含：根据b1)中确定的所述LINC01356表达水平对所述受试者进行预后评估。
6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述预后评估或辅助预后评估包括对受试者的总生存期进行评估；
当受试者LINC01356表达水平高于阈值时为高表达，则示受试者总生存期较短；
当受试者LINC01356表达水平低于阈值时为低表达，则指示受试者总生存期较长；
所述阈值为舌鳞癌患者LINC01356表达水平与总生存期之间的最佳截断值。
7.LINC01356作为靶点在舌鳞癌治疗和/或筛选舌鳞癌药物中的应用。
8.抑制LINC01356表达的物质在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌；
其中，降低LINC01356表达水平的物质包括针对LINC01356的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述siRNA包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列；
所述产品为药物。
10.一种产品，其活性成分包括用于抑制LINC01356表达水平的物质；
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
d1)抑制舌鳞癌细胞增殖
d2)抑制舌鳞癌细胞恶性侵袭；
d3)促进舌鳞癌细胞凋亡；
d4)抑制舌鳞癌生长；
d5)抑制舌鳞癌转移；
d6)治疗舌鳞癌；
其中，抑制LINC01356表达水平的物质包括针对LINC01356的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质；
所述siRNA包括如SEQ ID NO.1-2所示的序列；
所述产品为药物。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779618A (zh) * 2016-04-19 2016-07-20 中南大学湘雅二医院 一种舌鳞癌的新诊治靶标基因及其应用
CN108220446A (zh) * 2018-03-29 2018-06-29 北京泱深生物信息技术有限公司 Linc01356作为分子标志物在胃癌中的应用
CN108653737A (zh) * 2018-06-25 2018-10-16 徐州市中心医院 Mthfd1l抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途
CN110616265A (zh) * 2019-11-15 2019-12-27 中国医科大学附属口腔医院 一种预防、诊断和治疗舌鳞癌的分子标志物及应用
CN111893188A (zh) * 2020-08-21 2020-11-06 河北医科大学第二医院 生物标志物linc01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779618A (zh) * 2016-04-19 2016-07-20 中南大学湘雅二医院 一种舌鳞癌的新诊治靶标基因及其应用
CN108220446A (zh) * 2018-03-29 2018-06-29 北京泱深生物信息技术有限公司 Linc01356作为分子标志物在胃癌中的应用
CN108653737A (zh) * 2018-06-25 2018-10-16 徐州市中心医院 Mthfd1l抑制剂在制备舌鳞癌治疗药物中的用途
CN110616265A (zh) * 2019-11-15 2019-12-27 中国医科大学附属口腔医院 一种预防、诊断和治疗舌鳞癌的分子标志物及应用
CN111893188A (zh) * 2020-08-21 2020-11-06 河北医科大学第二医院 生物标志物linc01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用

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