CN114344564A - 一种仿生多通道电活性神经导管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生多通道电活性神经导管及其制备方法，包括：丝线的二次脱胶；以二次脱胶丝线作为原料制备丝素蛋白溶液；多通道丝素蛋白冷冻凝胶的制备；多通道导电冷冻凝胶的制备；仿生多通道导电神经支架的制备；PVDF/PLCL薄膜的制备；将仿生多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜通过手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管。该神经导管具有优异的生物相容性、机械性能和降解性能，其四通道结构能够限制轴突的弥散，防止轴突再生到错误的分支，导电作用能刺激雪旺细胞的成熟和轴突的髓鞘化，压电作用能提供体内的电刺激，进一步促进轴突的髓鞘化进程，从而更好地促进周围神经再生。

Description

一种仿生多通道电活性神经导管及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料和再生医学的技术领域，尤其是指一种仿生多通道电活性神经导管及其制备方法。

背景技术

据保守估计，全球每年新增周围神经损伤超过500万例，如果患者不能得到及时的救治，很可能会导致永久性的感觉运动功能丧失。自体神经移植作为临床治疗的黄金标准，受到供体来源不足等诸多因素的限制，亟需一种有效的替代物。因此，研发能够恢复受损神经形态连续性、为神经再生提供合适微环境的神经导管，具有重要的临床意义。目前市售的神经导管主要包括两种形态，一种为可直接代替神经缺损的管状，另一种为术后用作受损神经保护装置的膜状，但由于当前的产品难以模拟周围神经复杂的解剖结构和再生微环境，人工神经导管还难以应用在长距离神经缺损的修复。

目前的神经导管大多为单通道管状，这是由于这种结构便于制造而且有利于生长因子的集中，但由于神经再生周期较长，简单的管状结构容易在体内发生坍塌，从而阻碍神经的再生，而且单通道设计难以模仿周围神经复杂的多束状结构，无法对雪旺细胞的迁移和轴突的延伸提供有效的指引。因此，多通道仿生神经导管的构建成为了设计神经导管的新选择。

神经导管材料的选择较为广泛，以可降解的人工合成的高分子材料和天然的高分子材料为主。丝素蛋白主要从蚕茧中提取，廉价且安全，其具有良好的机械性能，可以满足神经移植物对于抗结节性和可缝合性的要求。丝素蛋白溶液可以通过梯度冷冻成胶的方式得到Silk I型冷冻凝胶，这种冷冻凝胶具有良好的形状记忆功能，可以在完全压缩或180°弯曲后立即回弹，同时其具有优异的降解性能和稳定的溶胀比，适用于体内周围神经修复。

不同于人体其他组织，神经组织处于极其复杂的电学微环境之中，神经组织在生长成熟的过程中均伴随发电现象，电信号也作为神经元间信息传导的重要方式之一。因此，导电材料在神经导管应用中具有广阔的发展前景。聚(3,4- 乙撑二氧噻吩)(PEDOT)是一种聚噻吩的衍生物，其电导率和化学稳定性高于聚吡咯、聚苯胺等其他导电聚合物。

外源性电刺激是轴突损伤后临床上最常用的非手术治疗方法，对导电神经导管进行体内电刺激能够进一步促进神经细胞分化，促进神经营养因子的释放，加快轴突再生及髓鞘化，自发电型神经导管可以在移植进体内之后持续产生电压，而不需要在体外外加电源。压电材料是受到压力作用时会在两端面间出现电压的晶体材料。其中，聚偏氟乙烯(PVDF)使一种代表性的压电高聚物，具有柔韧性好，密度低，阻抗低和压电电压常数高等优点。

鉴于以上所述，本发明针对当前的产品难以模拟周围神经复杂的解剖结构和再生微环境的现状，通过仿生设计及再生修复探究，研发出一种模仿周围神经解剖结构的多通道神经导管，该导管同时具有压电和导电双重电活性。利用丝素蛋白特殊的梯度冷冻成胶方式，设计了含有四通道的模具，制备了具有形状记忆功能的丝素蛋白冷冻凝胶支架，并利用冷冻凝胶原位聚合导电材料 PEDOT。本发明能满足缝合强度和体内再生的力学要求，同时在体内持续提供电刺激，联合导电支架进一步快轴突的再生和髓鞘化进程，为周围神经缺损的修复提供了新方案。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种仿生多通道电活性神经导管及其制备方法，该方法制备的神经导管具有优异的生物相容性、机械性能和降解性能，其四通道结构能够限制轴突的弥散，防止轴突再生到错误的分支，导电作用能刺激雪旺细胞的成熟和轴突的髓鞘化，压电作用能提供体内的电刺激，进一步促进轴突的髓鞘化进程，从而更好地促进周围神经再生。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种仿生多通道电活性神经导管的制备方法，包括以下步骤：

1)将蚕丝置于碳酸氢钠溶液中煮沸后用去离子水清洗以完全脱去丝胶，得到二次脱胶的丝线，烘干待用；

2)将步骤1)中得到的二次脱胶的丝线溶于9.3M溴化锂溶液，透析后高速离心去除杂质，得到丝素蛋白溶液；

3)将步骤2)中得到的丝素蛋白溶液注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具放置在-20℃-80℃下冷冻浓缩，之后将模具转移到-4℃-6℃以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶；

4)将步骤3)中得到的多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于过硫酸铵溶液中浸泡 2-4小时，之后转移到3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡2-4小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶；

5)将步骤4)中得到的多通道导电冷冻凝胶置于去离子水和无水乙醇中充分洗涤，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架；

6)将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL 溶液，将两种溶液按不同比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃下烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜；

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的 PVDF/PLCL薄膜通过手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管。

进一步，在步骤1)中，所述碳酸氢钠溶液浓度为0.5wt％-2wt％，煮沸时间为30-45分钟，去离子水的温度为50℃-60℃。

进一步，在步骤2)中，采用透析装置透析后再采用离心机高速离心，其中，透析装置的截留分子量为3000-14000，离心机转速和时间分别为9000g-12000g， 30分钟，重复两次。

进一步，在步骤3)中，所述丝素蛋白溶液需用去离子水稀释至2wt％-8wt％，模具在-20℃-80℃下放置24小时以上，在-4℃-6℃下放置24小时以上。

进一步，在步骤4)中，所述过硫酸铵溶液的浓度为0.4mol/L-0.8mol/L， 3,4-乙烯二氧噻吩溶液使用环己烷或正己烷作为溶剂，浓度为0.4mol/L。

进一步，在步骤6)中，所述PVDF溶液和PLCL溶液的浓度为8wt％-12wt％，混合体积比为2：8或3：7或4：6。

进一步，在步骤7)中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

本发明也提供了一种由上述方法制备得到的仿生多通道电活性神经导管。

本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：

本发明利用丝素蛋白特殊的梯度冷冻成胶的自交联方式制备了具有形状记忆功能的多通道丝素蛋白冷冻凝胶，可以有效限制轴突再生过程中的弥散，防止轴突再生到错误的分支。多通道丝素蛋白冷冻凝胶的多孔结构为PEDOT的原位聚合提供足够的聚合位点，从而得到高电导率的仿生多通道导电神经支架，可以刺激雪旺细胞的成熟和轴突的延伸。此外，外层PVDF/PLCL薄膜的压电性能可以为导管提供额外的持续电刺激，而不需要埋入外加电源，可以进一步促进轴突的延伸和髓鞘化进程，同时提供优异的缝合性能，便于神经导管的体内移植。

附图说明

图1为实施例1中所得到的仿生多通道导电神经支架横截面的体视显微镜照片。

图2为实施例1中所得到的仿生多通道导电神经支架的横断面内多孔结构的扫描电子显微镜照片；

图3为实施例1横截面孔壁上附着的PEDOT颗粒的扫描电子显微镜照片。

图4为实施例1和实施例2中所得到的仿生多通道导电神经支架的电导率。

图5为实施例1中所得到的PVDF/PLCL薄膜的压电效应表征图。

图6为实施例1中所得到的多通道丝素蛋白冷冻凝胶和仿生多通道导电冷冻凝胶的细胞相容性评价图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1)将30g蚕丝置于1.5L浓度为0.5wt％的碳酸氢钠溶液中煮沸30分钟，之后转移到5L去离子水中，50℃水浴中反复揉搓直至泡沫变少，重复两次后，将丝线置于60℃烘箱中烘干待用。

2)将4g二次脱胶的丝线在30℃水浴中溶于9.3M溴化锂溶液，使用截留分子量为8000-14000的透析装置透析48小时后以11000g的转速离心30分钟，重复两次去除杂质，得到丝素蛋白溶液。

3)将丝素蛋白溶液使用去离子水稀释至6wt％后注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具在-20℃下放置24小时冷冻浓缩，将模具转移到-5℃放置 48小时以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶。

4)将多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于0.8mol/L过硫酸铵溶液中浸泡3小时，之后转移到0.4mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡3小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶。

5)将多通道导电冷冻凝胶用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次，并置于去离子水中洗涤过夜，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架，其横截面结构如图1所示，其横截面内多孔结构如图2所示，其横截面孔壁上附着的PEDOT 颗粒如图3所示，其电导率表征在图4中，其与多通道丝素蛋白冷冻凝胶对雪旺细胞的细胞相容性评价如图6所示。

6)将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL 溶液，两种溶液浓度均为10wt％，将两种溶液按3：7的比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃烘箱中烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜，其压电性能如图5所示。

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的 PVDF/PLCL薄膜通过8-0的手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管，其中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

实施例2

1)将30g蚕丝置于1.5L浓度为0.5wt％的碳酸氢钠溶液中煮沸30分钟，之后转移到5L去离子水中，50℃水浴中反复揉搓直至泡沫变少，重复两次后，将丝线置于60℃烘箱中烘干待用。

2)将4g二次脱胶的丝线在30℃水浴中溶于9.3M溴化锂溶液，使用截留分子量为8000-14000的透析袋装置透析48小时后以9000g的转速离心30分钟，重复两次去除杂质，得到丝素蛋白溶液。

3)将丝素蛋白溶液使用去离子水稀释至6wt％后注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具在-20℃下放置24小时冷冻浓缩，将模具转移到-5℃放置48 小时以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶。

4)将多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于0.4mol/L过硫酸铵溶液中浸泡3小时，之后转移到0.4mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡3小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶。

5)将多通道导电冷冻凝胶用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次，并置于去离子水中洗涤过夜，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架，其电导率表征在图4中。

6将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL 溶液，两种溶液浓度均为12wt％，将两种溶液按2：8的比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃烘箱中烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜。

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的 PVDF/PLCL薄膜通过8-0的手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管，其中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

实施例3

1)将30g蚕丝置于1.5L浓度为2.0wt％的碳酸氢钠溶液中煮沸45分钟，之后转移到5L去离子水中，60℃水浴中反复揉搓直至泡沫变少，重复两次后，将丝线置于60℃烘箱中烘干待用。

2)将4g二次脱胶的丝线在60℃水浴中溶于9.3M溴化锂溶液，使用截留分子量为3000-8000的透析袋装置透析48小时后以12000g的转速离心30分钟，重复两次去除杂质，得到丝素蛋白溶液。

3)将丝素蛋白溶液使用去离子水稀释至2wt％后注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具在-80℃下放置24小时冷冻浓缩，将模具转移到-6℃放置72 小时以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶。

4)将多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于0.4mol/L过硫酸铵溶液中浸泡2小时，之后转移到0.4mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡4小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶。

5)将多通道导电冷冻凝胶用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次，并置于去离子水中洗涤过夜，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架。

6将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL 溶液，两种溶液浓度均为8wt％，将两种溶液按4：6的比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃烘箱中烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜。

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的 PVDF/PLCL薄膜通过8-0的手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管，其中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

实施例4

1)将30g蚕丝置于1.5L浓度为1wt％的碳酸氢钠溶液中煮沸30分钟，之后转移到5L去离子水中，60℃水浴中反复揉搓直至泡沫变少，重复两次后，将丝线置于60℃烘箱中烘干待用。

2)将4g二次脱胶的丝线在60℃水浴中溶于9.3M溴化锂溶液，使用截留分子量为3000-8000的透析袋装置透析48小时后以11000g的转速离心30分钟，重复两次去除杂质，得到丝素蛋白溶液。

3)将丝素蛋白溶液使用去离子水稀释至8wt％后注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具在-20℃下放置24小时冷冻浓缩，将模具转移到-4℃放置24 小时以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶。

4)将多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于0.8mol/L过硫酸铵溶液中浸泡4小时，之后转移到0.4mol/L 3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡2小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶。

5)将多通道导电冷冻凝胶用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次，并置于去离子水中洗涤过夜，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架。

6将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL 溶液，两种溶液浓度均为10wt％，将两种溶液按3：7的比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃烘箱中烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜。

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的 PVDF/PLCL薄膜通过8-0的手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管，其中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所举的例子，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的专业人员而言，在上述实施例的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种仿生多通道电活性神经导管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将蚕丝置于碳酸氢钠溶液中煮沸后用去离子水清洗以完全脱去丝胶，得到二次脱胶的丝线，烘干待用；

2)将步骤1)中得到的二次脱胶的丝线溶于9.3M溴化锂溶液，透析后高速离心去除杂质，得到丝素蛋白溶液；

3)将步骤2)中得到的丝素蛋白溶液注入模具中，盖紧盖子以保证密封性，将模具放置在-20℃-80℃下冷冻浓缩，之后将模具转移到-4℃-6℃以实现丝素蛋白的自交联过程，脱模后得到多通道丝素蛋白冷冻凝胶；

4)将步骤3)中得到的多通道丝素蛋白冷冻凝胶置于过硫酸铵溶液中浸泡2-4小时，之后转移到3,4-乙烯二氧噻吩溶液中浸泡2-4小时以进行原位聚合，得到多通道导电冷冻凝胶；

5)将步骤4)中得到的多通道导电冷冻凝胶置于去离子水和无水乙醇中充分洗涤，冷冻干燥后得到仿生多通道导电神经支架；

6)将PVDF和PLCL分别溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到PVDF溶液和PLCL溶液，将两种溶液按不同比例混合均匀，将混合溶液倒入玻璃皿中，在50℃-60℃下烘干，并使用无水乙醇洗去残余溶剂，得到PVDF/PLCL薄膜；

7)将步骤5)中得到的仿生多通道导电神经支架和步骤6)中得到的PVDF/PLCL薄膜通过手术缝线固定，得到仿生多通道电活性神经导管。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，所述碳酸氢钠溶液浓度为0.5wt％-2wt％，煮沸时间为30-45分钟，去离子水的温度为50℃-60℃。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，采用透析装置透析后再采用离心机高速离心，其中，透析装置的截留分子量为3000-14000，离心机转速和时间分别为9000g-12000g，30分钟，重复两次。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述丝素蛋白溶液需用去离子水稀释至2wt％-8wt％，模具在-20℃-80℃下放置24小时以上，在-4℃-6℃下放置24小时以上。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述过硫酸铵溶液的浓度为0.4mol/L-0.8mol/L，3,4-乙烯二氧噻吩溶液使用环己烷或正己烷作为溶剂，浓度为0.4mol/L。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤6)中，所述PVDF溶液和PLCL溶液的浓度为8wt％-12wt％，混合体积比为2：8或3：7或4：6。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤7)中，在固定多通道导电神经支架和PVDF/PLCL薄膜时，两端的薄膜需要比支架长出1mm-2mm以形成对神经残断的保护。

8.由权利要求1-7任一项所述方法制备得到的仿生多通道电活性神经导管。

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