CN114317619A - 一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化领域，具体涉及一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法。该方法以界面活性二氧化硅纳米颗粒作为乳化剂，将酮还原酶与辅因子分散在水相PBS缓冲液中，形成包封酮还原酶与辅因子的油包水型Pickering乳液，再将上述Pickering乳液装入固定床反应器中进行连续化反制备手性醇。本发明通过油包水型的Pickering乳液实现限域空间内酮还原酶和辅因子的协同催化，连续反应400h以上，酶催化活性基本保持不变，辅因子总的转化数可达60000以上。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化领域，具体涉及一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法。
背景技术
酶催化反应具有条件温和，催化效率高，专一性强等优点，其高效的化学、立体和区域选择性有助于降低成本，提高反应效率，避免不必要的副反应以及减少环境污染。因此，酶作为一种重要的生物催化剂已被广泛用于药物、手性化合物和光学活性化合物等多种有机物的合成反应中，并显示出巨大的应用前景。
手性醇类药物中间体的生产是合成手性药物的难点，也是发展手性药物不可或缺的原料基础。目前工业上合成手性醇类药物中间体主要采用化学合成或外消旋体拆分等方法，化学合成法催化合成手性醇类化合物主要依赖金属催化剂，步骤繁多、选择性低且伴随着严重的环境污染，对含卤素或者硝基等多取代基的底物反应较差；而外消旋体拆分法对应底物为相应的醇类化合物，有相当大的底物局限性。酶催化不对称合成方法立体选择性高、反应条件温和，对含卤素或者硝基等多取代基的底物也有非常好的催化效率，因此人们逐步探索将氧化还原酶用于手性醇类药物中间体的合成中。然而，大部分氧化还原酶都依赖辅因子参与反应过程。因此，实现昂贵的辅因子的有效循环再生，对于工业合成非常重要。
近年来，一些酶固定方法被开发出来应用于两种酶协同催化反应，例如物理吸附法、化学键合法、溶胶凝胶法等。物理吸附法指通过氢键、范德华力等相互作用实现主酶与辅因子在基底材料上的固定，而在催化过程中物理吸附法固定的酶不稳定，在循环过程中有酶的损失进而导致酶催化反应效率的降低；化学键合法以及溶胶凝胶法多指基底材料与酶之间通过化学键结合进而实现两种酶的有效固定，然而化学键的作用使酶的构象发生一定程度的改变，使酶活性相对于自由酶催化反应有明显降低。
发明内容
本发明针对现有技术中酮还原酶活性损失、辅因子无法高效循环再生以及制备过程难以连续化和工业化的问题，提供一种基于Pickering乳液包封酮还原酶和辅因子用于固定床连续化的新方法，实现了对酮还原酶和辅因子无损包封以及辅因子的高效再生利用，长时间连续稳定高效运行为工业化奠定了基础。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，包括以下步骤：
步骤1：将SiO2纳米颗粒超声分散于甲苯中，然后加入疏水硅烷和有机胺；在氮气保护下，搅拌回流；经离心分离，洗涤，干燥，得到具有界面活性的SiO2纳米颗粒；
步骤2：将酮还原酶和辅因子加入到pH＝5-9的PBS缓冲液中，混匀后得到水相体系；将具有界面活性的SiO2纳米颗粒经超声波分散于有机溶剂后得到油相体系；将油水两相体系混合，经高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的粒径均匀的Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液装入固定床反应器中，通过恒流泵从固定床上端输送反应物溶液，并向反应物溶液中添加辅因子再生物，产物从固定床下端收集。
进一步，所述步骤1中SiO2纳米颗粒的粒径为60-80nm；搅拌回流温度为60-120℃，搅拌回流时间为3～6h。
进一步，所述步骤1中疏水硅烷为甲基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷或辛基三甲氧基硅烷；有机胺为正己胺或三乙胺。
进一步，所述步骤1中SiO2与疏水硅烷的摩尔比为1:0.06～1:0.6，疏水硅烷与有机胺的摩尔比为1:0.5～1:3。
进一步，所述步骤2中酮还原酶为ES-KRED-101～ES-KRED-287及其突变体中的一种或多种，辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，有机溶剂为甲苯、正庚烷、己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或辛烷。
进一步，所述步骤2中酮还原酶的含量为10-500μL/mL PBS缓冲液；辅因子的用量为0.1-50mg。
进一步，所述步骤2中PBS缓冲液与界面活性SiO2的质量比为1:0.02～1:0.10；PBS缓冲液与有机溶剂的体积比为1:1～1:10。
进一步，所述步骤2中高速搅拌转数为5000～10000rpm；Pickering乳液微滴的直径为5-300μm。
进一步，所述步骤3中反应器温度为25～50℃，反应器流速范围为0.2～5mL/h。
进一步，所述步骤3中辅因子再生物为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶、异丙醇、甲酸铵-甲酸铵脱氢酶、2-辛醇或2-庚醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)传统方法连续化过程中，辅因子通过连续相进入固定床或通过固体材料吸附等方式固定，难以实现酮还原酶与辅因子原位包封与利用。本发明利用Pickering乳液实现对酮还原酶和辅因子的原位包封，辅因子在乳滴内部自由移动，二者在乳滴界面结合后与流动相中底物进行催化反应，实现了酮还原酶与辅因子在限域空间内的协同催化。
(2)传统方法中，辅因子通过电荷吸引或氢键作用等方法进行固定化，反应过程中辅因子流失严重，难以实现对辅因子的有效包封。本发明制备的Pickering乳液，反应300h后辅因子仍在乳滴内部分布，未见有损失，实现了对辅因子的有效包封。
(3)本发明中辅因子循环再生所需物质随连续相流入固定床，在对辅因子进行反应再生后随连续相流出固定床，实现了对辅因子限域空间内的循环再生利用。
(4)本发明利用Pickering乳液制备手性醇，包封后酮还原酶结构与构型未发生改变，完整保留了酮还原酶的活性。
(5)本发明制备的包封酮还原酶和辅因子的Pickering乳液装填到固定床反应器中进行酶催化反应，操作简单，连续运行400小时以上，辅因子的总的转化数可达60000以上。
附图说明
图1为本发明酮还原酶连续化反应制备手性醇的过程示意图；
图2为本发明实施例1中制备得到的界面活性纳米SiO2的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中制备得到Pickering乳液形貌图；
图4为本发明实施例2中3',4'二氟-2-氯乙酰苯不对称催化还原反应中，反应转化率与选择性随时间变化的曲线图。
具体实施方式
以下所述实例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但并不限制本发明专利的保护范围，凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，包括如下步骤：
步骤1：采用超声波将1.0g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒分散到12mL甲苯中，加入4.5mmol辛基三甲氧基硅烷和4.5mmol三乙胺，在110℃、氮气保护条件下，搅拌回流4h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2(形貌如图2所示)；
步骤2：将0.36mL的ES-KRED-113酮还原酶溶液、0.223mg NADP+加入到3.2mL100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；然后将0.072g界面活性SiO2超声分散于25mL正庚烷中得到油相体系；将油水两相体系混合，经5000rpm高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的Pickering乳液(形貌如图3所示)；
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为30℃；通过恒流泵以1.0mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L三氟苯乙酮和0.12mol/L异丙醇的正庚烷溶液，进行还原反应；反应连续进行400小时，转化率大于95％，生成的手性醇的ee值均大于99％，辅因子的总的转化数达到60000。
实施例2
一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，包括如下步骤：
步骤1：采用超声波将1.0g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒分散到15mL甲苯中，加入4.5mmol二氯二甲基硅烷和2.25mmol正己胺，在120℃、氮气保护条件下，搅拌回流3h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将0.72mL的ES-KRED-115酮还原酶溶液、1mg NADP+加入到6.4mL 100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；然后将0.316g界面活性SiO2超声分散于16mL甲苯中得到油相体系；将油水两相体系混合，经10000rpm高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为40℃；通过恒流泵以0.5mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L3',4'二氟-2-氯乙酰苯和0.12mol/L 2-辛醇的甲苯溶液，进行还原反应；反应连续进行300小时，转化率大于85％，生成的手性醇的ee值均大于99％(如图4所示)。
实例3
一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，包括如下步骤：
步骤1：采用超声波将1.2g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒分散到20mL甲苯中，加入1.5mmol二氯二甲基硅烷和4.5mmol正己胺，在60℃、氮气保护条件下，搅拌回流5h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将0.05mL的ES-KRED-172酮还原酶溶液、0.112mg NADP+加入到3.2mL100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；然后将0.158g界面活性SiO2超声分散于15mL乙酸乙酯中得到油相体系；将油水两相体系混合，经8000rpm高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液转移至内径为1.8cm固定床反应器中，设定反应器温度为30℃；通过恒流泵以0.3mL/h的流速通入浓度为0.2mol/L4-氯乙酰乙酸乙酯和0.24mol/L 2-庚醇的乙酸乙酯溶液，进行酯交换反应；反应连续进行200小时，转化率大于98％，生成的手性醇的ee值均大于99％
实施例4
一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，包括如下步骤：
步骤1：采用超声波将1.0g粒径为80nm的SiO2纳米颗粒分散到12mL甲苯中，加入1.5mmol甲基三甲氧基硅烷和4.5mmol三乙胺，在110℃以及氮气保护条件下搅拌下回流4个小时冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将1.5mL的ES-KRED-270酮还原酶溶液、45mg NADH加入到3.2mL 100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；然后将0.316g界面活性SiO2超声分散于5mL甲基叔丁基醚中得到油相体系；将油水两相体系混合，经5000rpm高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的Pickering乳液。
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液转移至内径为2.8cm固定床反应器中，设定反应器温度为30℃；通过恒流泵以5mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L苯甲酰甲酸甲酯和0.2mol/L异丙醇的甲基叔丁基醚溶液，进行反应；反应连续进行300小时，转化率大于90％，生成的手性醇的ee值均大于99％。
实施例5
本实施例手性醇的制备方法基本同实施例1，不同的是：步骤2中正庚烷替换为等量的己烷，步骤3中0.12mol/L异丙醇替换为0.12mol/L葡萄糖和80mg/L葡萄糖脱氢酶。反应连续进行400小时，转化率大于95％，生成的手性醇的ee值大于99％。
实施例6
本实施例手性醇的制备方法基本同实施例4，不同的是：步骤2中甲基叔丁基醚替换为等量的辛烷，步骤3中异丙醇替换为等浓度的2-辛醇。反应连续进行400小时，转化率大于95％，生成的手性醇的ee值大于99％。
实施例7
本实施例手性醇的制备方法基本同实施例4，不同的是：步骤3中0.2mol/L异丙醇替换为0.12mol/L甲酸铵与80mg/L甲酸铵脱氢酶。反应连续进行300小时，转化率大于90％，生成的手性醇的ee值大于99％。
Claims (10)
1.一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将SiO2纳米颗粒超声分散于甲苯中，然后加入疏水硅烷和有机胺；在氮气保护下，搅拌回流；经离心分离，洗涤，干燥，得到具有界面活性的SiO2纳米颗粒；
步骤2：将酮还原酶和辅因子加入到pH＝5-9的PBS缓冲液中，混匀后得到水相体系；将具有界面活性的SiO2纳米颗粒经超声波分散于有机溶剂后得到油相体系；将油水两相体系混合，经高速搅拌形成固载酮还原酶和辅因子的粒径均匀的Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的Pickering乳液装入固定床反应器中，通过恒流泵从固定床上端输送反应物溶液，并向反应物溶液中添加辅因子再生物，反应产物从固定床下端收集。
2.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤1中SiO2纳米颗粒的粒径为60-80nm；搅拌回流温度为60-120℃，搅拌回流时间为3～6h。
3.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤1中疏水硅烷为甲基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷或辛基三甲氧基硅烷，有机胺为正己胺或三乙胺。
4.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤1中SiO2与疏水硅烷的摩尔比为1:0.06～1:0.6，疏水硅烷与有机胺的摩尔比为1:0.5～1:3。
5.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤2中酮还原酶为ES-KRED-101～ES-KRED-287及其突变体中的一种或多种，辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；有机溶剂为甲苯、正庚烷、己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或辛烷。
6.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤2中酮还原酶的含量为10-500μL/mL PBS缓冲液，辅因子的用量为0.1-50mg。
7.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤2中PBS缓冲液与界面活性SiO2的质量比为1:0.02～1:0.10；PBS缓冲液与有机溶剂的体积比为1:1～1:10。
8.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤2中高速搅拌转数为5000～10000rpm；Pickering乳液微滴的直径为5-300μm。
9.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤3中反应器温度为25～50℃，反应器流速范围为0.2～5mL/h。
10.根据权利要求1所述的一种酮还原酶连续化反应制备手性醇的方法，其特征在于，所述步骤3中辅因子再生物为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶、异丙醇、甲酸铵-甲酸铵脱氢酶、2-辛醇或2-庚醇。
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