CN114317629A - 一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化领域，具体涉及一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法。该方法将转氨酶与辅因子分散在PBS缓冲液中形成混合液；然后将混合液加入到含有界面活性固体SiO2纳米颗粒的油相中，经高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的油包水型Pickering乳液；最后将Pickering乳液装入固定床反应器中进行连续流动反应制备手性胺。本发明操作简单，连续运行600小时以上，反应转化率基本维持不变，辅因子总转化数可高达5000以上，且转氨酶活性基本维持不变，辅因子也基本没有损失。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化领域，具体涉及一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法。
背景技术
手性胺类化合物广泛存在于天然产物、药物分子和多功能材料中，而且作为重要中间体、催化剂和手性辅剂在有机合成中也有广泛的应用，因此，发展高效的方法合成各种手性胺化合物及相应的骨架结构具有重要的科学意义和应用价值。
目前工业上合成手性胺类药物中间体主要采用化学合成法，化学合成法需要多种危险、有毒的试剂和重金属催化剂，并且反应步骤多、反应温度较高，导致手性胺产率较低并伴随严重的环境污染，且对复杂取代基的底物不能实现高效转化，同时由于产物后处理困难，生产的胺手性物质纯度很难达到工业生产要求。由于酶具有活性高、特异性强、立体选择性高、反应条件温和等优势，生物酶法逐渐取代化学合成方法成为手性胺制备中最有前景的合成方法之一，而目前生物酶固定法普遍采用化学键合、物理吸附等方法，酶活性受化学键影响有部分失活，且循环利用过程中有酶的损失。
酶辅因子在生物酶法合成手性胺中起着重要的作用，因为转氨酶需要它们来协同催化制备手性胺类药物中间体。目前在生物酶合成手性胺类药物中间体的过程中，主要采用外源添加辅因子循环的方法或者通过静电作用力、氢键吸附固定辅因子等方法，反应过程中有辅因子的损失以及损耗，并不能实现辅因子的原位反应再生。
发明内容
本发明针对现有技术中转氨酶固载化影响酶活性、转氨酶循环过程中酶量损失以及辅因子无法高效循环再生利用的问题，提供一种基于Pickering乳液包封转氨酶和辅因子的固定床连续流动体系，用于制备手性胺类化合物，有效避免了酶固载化过程中活性损失及流失问题，同时可实现乳滴限域空间内转氨酶与辅因子的协同催化及辅因子的循环再生。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，包括以下步骤：
步骤1：将SiO2纳米颗粒超声分散于甲苯中，然后加入疏水硅烷和有机胺；在氮气保护下，搅拌回流；经离心分离，洗涤，干燥，得到具有界面活性的SiO2纳米颗粒；
步骤2：将步骤1得到的具有界面活性的SiO2纳米颗粒加入到有机溶剂中，超声分散均匀后获得油相体系；将转氨酶和辅因子加入到PBS缓冲溶液中，混合均匀后得到水相体系；将油水两相体系混合，经高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的粒径均一的油包水型Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液装入固定床反应器中，通过恒流泵从固定床上端输送反应物溶液，并向反应物溶液中添加辅酶再生物，产物从固定床下端收集。
进一步，所述步骤1中SiO2纳米颗粒的粒径为60-80nm；搅拌回流温度为60-120℃，搅拌回流时间为3～6h。
进一步，所述步骤1中疏水硅烷为甲基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷或辛基三甲氧基硅烷；有机胺为正己胺或三乙胺。
进一步，所述步骤1中SiO2与疏水硅烷的摩尔比为1:0.06～1:0.6，疏水硅烷与有机胺的摩尔比为1:0.5～1:3。
进一步，所述步骤2中有机溶剂为甲苯、正庚烷、己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或辛烷；转氨酶为ATA-101～ATA-165及其突变体中的一种或多种；辅因子为磷酸吡哆醛(PLP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。
进一步，所述步骤2中转氨酶的含量为10-500μL/mL PBS缓冲液；辅因子的用量为5-500mg。
进一步，所述步骤2中PBS缓冲液与界面活性SiO2的质量比为1:0.02～1:0.10；PBS缓冲液与有机溶剂的体积比为1:1～1:10。
进一步，所述步骤2中高速搅拌转数为5000～10000rpm，Pickering乳液微滴的直径为5-300μm。
进一步，所述步骤3中反应器温度为25～50℃，反应器流速范围为0.2～4mL/h。
进一步，所述步骤3中辅酶再生物为甲酸铵-甲酸铵脱氢酶、异丙胺、苯乙胺或2-辛胺。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明利用Pickering乳液实现对转氨酶和辅因子的原位包封，转氨酶分布在乳滴界面，辅因子分散于乳滴内部，而且辅因子能够自由移动，当辅因子到达乳滴界面后与转氨酶结合，然后与流动相中底物在界面进行反应，有效实现了转氨酶与辅因子在限域空间内的协同催化。
(2)本发明构建的Pickering乳液连续流动体系，由于辅因子完全分散于水相，外部油相抑制了辅因子流失，因而在反应前后辅因子含量基本保持不变，实现了辅因子的有效包封。
(3)本发明中辅因子循环再生所需物质随连续相流入固定床，在对辅因子进行反应再生后随连续相流出固定床，以连续流动的方式实现了辅因子再生及循环利用。
(4)本发明利用Pickering乳液连续流动反应体系制备手性胺类化合物，相对于自由酶催化反应，反应转化率无降低，完整保留了酶的活性。
(5)本发明制备的包封转氨酶和辅因子的Pickering乳液装填到固定床反应器中进行酶催化反应，操作简单，连续运行600小时以上，反应转化率基本维持不变，辅因子总转化数可高达5000以上。
附图说明
图1为本发明转氨酶连续化反应制备手性胺的过程示意图；
图2为本发明实施例1中制备得到的界面活性SiO2的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中制备得到的Pickering乳液形貌图；
图4为本发明实施例1中对硝基苯乙酮不对称催化氨化反应中，反应转化率与选择性随时间变化的曲线图。
具体实施方式
以下所述实例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但并不限制本发明专利的保护范围，凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，包括如下步骤：
步骤1：将1.0g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒超声分散到12mL甲苯中，加入4.5mmol辛基三甲氧基硅烷和4.5mmol三乙胺，在110℃、氮气保护条件下，搅拌回流4h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2(形貌如图2所示)；
步骤2：将0.08mL的转氨酶ATA-117溶液、5.0mg PLP加入到3.2mL100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；将0.32g界面活性SiO2超声分散于8mL正庚烷中，混合均匀后得到油相体系；将油水两相体系混合，经5000rpm高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的油包水型Pickering乳液(形貌如图3所示)；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为30℃；通过恒流泵以1.0mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L对硝基苯乙酮和0.12mol/L异丙胺的正庚烷溶液，进行还原反应，结果如图4所示，反应连续进行450小时，转化率维持在85％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
实施例2
一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，包括如下步骤：
步骤1：将1.5g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒超声分散到20mL甲苯中，加入4.5mmol二氯二甲基硅烷和2.25mmol正己胺，在60℃、氮气保护条件下，搅拌回流6h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将0.72mL的转氨酶ATA-113溶液、40mg NADP+加入到6.4mL100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；将0.316g界面活性SiO2超声分散于16mL甲苯中，混合均匀后得到油相体系；将油水两相体系混合，经5000rpm高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的油包水型Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为45℃；通过恒流泵以4mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L苯乙酮和0.4mol/L甲酸铵以及80mg/L甲酸铵脱氢酶的甲苯溶液，进行还原反应，反应连续进行400小时，转化率维持在90％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
实施例3
一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，包括如下步骤：
步骤1：将1.2g粒径为80nm的SiO2纳米颗粒超声分散到20mL甲苯中，加入1.5mmol二氯二甲基硅烷和4.5mmol正己胺，在60℃、氮气保护条件下，搅拌回流5h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将0.06mL的转氨酶ATA-119溶液、10mg PLP加入到3.2mL 100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；将0.158g界面活性SiO2超声分散于20mL乙酸乙酯中，混合均匀后得到油相体系；将油水两相体系混合，经10000rpm高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的油包水型Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液转移至内径为1.8cm的固定床反应器中，设定反应器温度为50℃；通过恒流泵以0.5mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L对甲氧基苯乙酮和0.4mol/L 2-辛胺的乙酸乙酯溶液，进行还原反应，反应连续进行300小时，转化率维持在80％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
实施例4
一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，包括如下步骤：
步骤1：将1.0g粒径为60nm的SiO2纳米颗粒超声分散到12mL甲苯中，加入1.5mmol甲基三甲氧基硅烷和4.5mmol三乙胺，在120℃、氮气保护条件下，搅拌回流3h，冷却后将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯洗涤3-5次，干燥后得到界面活性纳米SiO2；
步骤2：将1.6mL的转氨酶ATA-142溶液、500mg PLP加入到3.2mL 100mM的PBS缓冲液中，经磁力搅拌混合均匀得到水相体系；将0.316g界面活性SiO2超声分散于12mL甲基叔丁基醚中，混合均匀后得到油相体系；将油水两相体系混合，经5000rpm高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的油包水型Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液转移至内径为2.8cm的固定床反应器中，设定反应器温度为40℃；通过恒流泵以0.5mL/h的流速通入浓度为0.1mol/L苯甲酰甲酸甲酯和0.2mol/L异丙胺的甲基叔丁基醚溶液，进行反应，反应连续进行600小时，转化率维持在90％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
实施例5
本实施例手性胺的制备方法基本同实施例1，不同的是：步骤2中正庚烷替换为等量的己烷，步骤3中异丙胺替换为等浓度的苯乙胺。反应连续进行400小时，转化率维持在90％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
实施例6
本实施例手性胺的制备方法基本同实施例4，不同的是：步骤2中甲基叔丁基醚替换为等量的辛烷，PLP替换为等量的NADH。反应连续进行400小时，转化率维持在90％以上，生成的手性胺的ee值大于99％。
Claims (10)
1.一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将SiO2纳米颗粒超声分散于甲苯中，然后加入疏水硅烷和有机胺；在氮气保护下，搅拌回流；经离心分离，洗涤，干燥，得到具有界面活性的SiO2纳米颗粒；
步骤2：将步骤1得到的具有界面活性的SiO2纳米颗粒加入到有机溶剂中，超声分散均匀后获得油相体系；将转氨酶和辅因子加入到PBS缓冲溶液中，混合均匀后得到水相体系；将油水两相体系混合，经高速搅拌形成包封转氨酶和辅因子的粒径均一的油包水型Pickering乳液；
步骤3：将步骤2得到的油包水型Pickering乳液装入固定床反应器中，通过恒流泵从固定床上端输送反应物溶液，并向反应物溶液中添加辅酶再生物，产物从固定床下端收集。
2.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤1中SiO2纳米颗粒的粒径为60-80nm；搅拌回流温度为60-120℃，搅拌回流时间为3～6h。
3.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤1中疏水硅烷为甲基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷或辛基三甲氧基硅烷；有机胺为正己胺或三乙胺。
4.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤1中SiO2与疏水硅烷的摩尔比为1:0.06～1:0.6，疏水硅烷与有机胺的摩尔比为1:0.5～1:3。
5.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤2中有机溶剂为甲苯、正庚烷、己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或辛烷；转氨酶为ATA-101～ATA-165及其突变体中的一种或多种；辅因子为磷酸吡哆醛、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
6.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤2中转氨酶的含量为10-500μL/mL PBS缓冲液；辅因子的用量为5-500mg。
7.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤2中PBS缓冲液与界面活性SiO2的质量比为1:0.02～1:0.10；PBS缓冲液与有机溶剂的体积比为1:1～1:10。
8.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤2中高速搅拌转数为5000～10000rpm，Pickering乳液微滴的直径为5-300μm。
9.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤3中反应器温度为25～50℃，反应器流速范围为0.2～4mL/h。
10.根据权利要求1所述的一种转氨酶连续化反应制备手性胺的方法，其特征在于，所述步骤3中辅酶再生物为甲酸铵-甲酸铵脱氢酶、异丙胺、苯乙胺或2-辛胺。
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