CN114315831A

CN114315831A - 一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物及其制备与应用

Info

Publication number: CN114315831A
Application number: CN202111583008.1A
Authority: CN
Inventors: 尹小英; 陈圣雪
Original assignee: Shanghai University of Engineering Science
Current assignee: Shanghai University of Engineering Science
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物及其制备与应用，该生物碱类化合物的化学结构式如下所示：

与现有技术相比，本发明的化合物具有人表皮癌细胞A431及人乳腺导管癌细胞BT474的细胞毒性，其IC50值分别达到216.1μM,193.3μM，说明该化合物对肿瘤细胞具有细胞毒性作用,可明显抑制肿瘤细胞活性等。

Description

一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物碱化合物技术领域，涉及一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物及其制备与应用。

背景技术

苦参是一种传统中药，为豆科槐属槐种植物苦参的干燥根，又名野槐根、地骨、凤凰爪等。其表面呈灰棕色或棕黄色，具纵皱纹和横长皮孔样突起，外皮薄，多破裂反卷，易剥落，剥落处显黄色，光滑。质硬，不易折断，折断断面纤维。据2015年《中国药典》记载，苦参清热燥湿，杀虫，利尿。可用于治疗热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风，外治滴虫性阴道炎等症。

癌症是一系列相关疾病的统称。在所有类型的癌症中，机体的一部分细胞逃脱正常的生长调控，不停分裂，并可能侵袭或扩散到机体的其他部位。研究发现，苦参类生物碱主要为喹诺里西啶类生物碱，该类生物碱有抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化、诱导凋亡、抑制肿瘤转移等抗肿瘤活性。近几年的研究表明,苦参对乳腺癌、肝癌、胃癌和淋巴内癌细胞的等都有不同程度的抑制和消灭作用，苦参中的生物碱对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，还能通过改变细胞核酸的分子序列，抑制肿瘤的生长，而且这种影响是广泛的、多部位的。研究表明，用苦参碱治疗各种晚期癌肿，能减轻症状，延长存活期，且不破坏正常白细胞的产生，甚至能升高白细胞，提高机体抵抗力，这是许多治疗药物难以达到的。

程序性细胞死亡受体1(PD-1)是一种细胞表面受体，在下调免疫反应和通过抑制T细胞免疫反应促进免疫耐受形成方面发挥着重要作用。PD-L1高表达于肿瘤细胞，PD-L1与PD-1结合后，T细胞活化受到抑制，T细胞处于免疫耐受状态。此时，免疫系统无法对癌细胞造成杀伤，发生肿瘤免疫逃逸。因此，针对PD-1/PD-L1通路设计靶向抑制剂，切断信号通路，可激活T细胞，解除其免疫耐受，调动T细胞进行肿瘤杀伤，实现肿瘤治疗。与化学治疗、放射治疗等这些传统疗法相比，肿瘤免疫治疗具有以下优点：毒副作用小、靶向性强、广谱性强、肿瘤复发率低等。PD-1已被证明是一种高度癌症免疫检查点治疗的有效靶点批准的抗体。目前，美国FDA批准上市的作用于PD-1免疫靶点的药物均为单克隆抗体生物大分子，尚未有小分子获批。2021年，有学者报道了一种联苯-咪唑类化合物，经过初期分子对接打分筛选，被证实对于靶向PD-1通路有抑制作用，目前关于PD-1小分子抑制剂的研究仍在开展中。因此，关于PD-1受体蛋白的小分子抑制剂的发现对于未来肿瘤治疗有着良好的前景。

天然产物对于新药的发现与设计、合成具有非常重要的意义，也是生物活性物质和创新药物的重要来源。为了发挥我国中草药的资源优势，进一步利用现代科技手段研究中药的物质基础有效成分及药理活性，从传统中药和药用植物中寻找新型抗肿瘤药物，研究其作用机制，对癌症的治疗具有积极意义。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物及其制备与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一提供了一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物，其化学结构式如下所示：

本发明的技术方案之二提供了一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取苦参根粉碎后采用溶剂加热提取，得到浸膏粗品，再用萃取法分离出浸膏粗品中的生物总碱；

(2)将分离得到的生物总碱经硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇洗脱剂梯度洗脱，得到中间馏分；

(3)将中间馏分经反相ODS-18柱层析，以甲醇-水溶液梯度洗脱，经薄层色谱检识，得到中间组分，再次经反相ODS-18柱层析，以甲醇-水溶液洗脱，接着经反相中压制备色谱分离纯化，即得到目标产物。

进一步的，步骤(1)中，所用溶剂为质量分数80～90％的乙醇溶液，优选为85％的乙醇溶液。

进一步的，步骤(1)中，加热提取的温度为70～80℃，优选为75℃。

进一步的，步骤(1)中，对浸膏粗品进行萃取法分离的过程具体为：

(A)取水溶解浸膏粗品，并调节pH值，得到碱性的浸膏水溶液；

(B)往浸膏水溶液中加入氯仿，摇匀并对乳化部分破乳后静置分层，取氯仿相旋干，即得到生物总碱。

更进一步的，步骤(A)中，调节pH所用试剂为氢氧化钠溶液，且pH被调节至10～11，可为10、10.5或11等；

步骤(B)中，氯仿与浸膏水溶液的体积比为1:1。

进一步的，步骤(2)中，梯度洗脱所用二氯甲烷-甲醇洗脱剂的梯度变化范围为98:2-50:50。

进一步的，步骤(2)中，生物总碱通过硅胶柱层析进行进一步纯化(15cm×150cm，CHCl₃/MeOH梯度变换具体为98:2，95:5，90:10，70:30，50:50)得到五个馏分，Fr.A-E，其中Fr.A(100g，CHCl₃/MeOH 98:2)、Fr.B(55g，CHCl₃/MeOH 95:5)、Fr.C(70g，CHCl₃/MeOH 90:10)、Fr.D(87g，CHCl₃/MeOH 70:30)、Fr.E(34g，CHCl₃/MeOH 50:50)，Fr.C即中间馏分进行下一步处理。

进一步的，步骤(3)中，Fr.C即中间馏分通过反相ODS-18柱层析进行进一步纯化(8cm×120cm，MeOH/H₂O梯度变化具体为10:90、30:70、50:50、70:30、100:0)得到五个馏分，Fr.C1-C5，其中Fr.C1(1.0g，MeOH/H₂O 10:90)、Fr.C2(25.6g，MeOH/H₂O 10:90、30:70)、Fr.C3(19.4g，MeOH/H₂O 50:50)、Fr.C4(12.9g，MeOH/H₂O 70:30)、Fr.C5(8.4g，MeOH/H₂O100:0)。

另外，Fr.C1(1.0g)通过半制备型反相中压液相色谱仪纯化，(色谱条件具体为流动相浓度比为MeOH:H2O 81:19，流动相流速为3ml/min，保留时间tR＝18.3min)得到目标化合物(9.0mg)。

本发明的技术方案之三提供了一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的应用，该生物碱类化合物用于作为活性成分制备抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明所述的化合物活性成分为首次发现的对称金雀花碱型生物碱类化合物，在之前的专利及文献中均未有报道。且通过细胞毒性及PD-1分子对接实验证明，该化合物具有一定的抗肿瘤活性，是指以该化合物作为活性成分或唯一活性成分用于制备抗肿瘤药物，具有广泛应用前景。

附图说明

图1为本发明的化合物对A431细胞的IC50值；

图2为本发明的化合物对BT474细胞的IC50值；

图3为本发明的化合物配体与PD-1受体蛋白3D相互作用图；

图4为本发明的化合物配体与PD-1受体蛋白2D相互作用图；

图5为本发明的化合物的结构图；

图6为化合物的红外(KBr)光谱；

图7为化合物的¹H-NMR谱；

图8为化合物的¹³C-NMR谱；

图9为化合物的H-H COSY谱；

图10为化合物的HSQC谱；

图11为化合物的HMBC谱；

图12为化合物的NOESY谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。

实施例1：苦参中新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的分离与结构鉴定

1.1实验药材试剂：

苦参根，购于河南郑州，经上海工程技术大学尹小英教授鉴定为豆科槐属植物苦参(Sophora Flavescens Ait)的干燥根，并根据中国药典药材粉碎方法粉碎。

甲醇(AR,上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(AR,上海泰坦科技股份有限公司)；氨水(AR，国药集团化学试剂有限公司)；碘化铋钾(AR,上海泰坦科技股份有限公司)；ODS(50μm，日本YMC公司)；硅胶(200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)；

1.2苦参总生物碱的提取：

苦参根(50kg)经粉碎后用85％乙醇溶剂在提取罐内75℃加热提取，得浸膏7.0Kg。

再用萃取法分离出浸膏中的生物总碱，具体为：

用尽量少的水溶解浸膏，并用氢氧化钠溶液调节PH值至10.0。将所得浸膏水溶液移入分液漏斗中，并加入相同体积的氯仿，摇匀。用离心机对乳化部分破乳后静置。待到分层清晰，取氯仿相，用旋转蒸发仪旋干，得到520g苦参氯仿层浸膏，即苦参总碱。回收氯仿并对浸膏水溶液反复萃取，重复操作，直至氯仿相无色。

1.3对称金雀花碱型生物碱类化合物的分离：

取苦参总碱经硅胶柱层析，通过硅胶柱层析进行进一步纯化(15cm×150cm，CHCl₃/MeOH 98:2,95:5,90:10,70:30,50:50)得到五个馏分，分别为Fr.A-E，其中Fr.A(100g,CHCl3/MeOH 98:2)、Fr.B(55g，CHCl3/MeOH 95:5)、Fr.C(70g,CHCl3/MeOH90:10)、Fr.D(87g,CHCl3/MeOH 70:30)、Fr.E(34g,CHCl3/MeOH 50:50)。

从中选取馏分Fr.C通过反相ODS-18柱层析进行进一步纯化(8cm×120cm,MeOH/H₂O,10:90,30:70,50:50,70:30,100:0)得到五个馏分，Fr.C1-C5,其中Fr.C1(1.0g,MeOH/H₂O 10:90)、Fr.C2(25.6g,MeOH/H₂O 10:90、30:70)、Fr.C3(19.4g,MeOH/H₂O 50:50)、Fr.C4(12.9g,MeOH/H₂O 70:30)、Fr.C5(8.4g,MeOH/H₂O 100:0)。

Fr.C1(1.0g)通过半制备型反相中压液相色谱仪(色谱条件为40％MeOH,3ml/min,tR＝18.3min)得到目标化合物(9.0mg)。

1.4对称金雀花碱型生物碱类化合物的结构鉴定：

化合物：为黄色油状物质。结合图6至图12可知，从其HR-ESI-MS在m/z471.2378[M+Na]⁺(C₂₆H₃₂N₄O₃Na的计算值：471.2372)推导出所得化合物的分子式为C₂₆H₃₂N₄O₃，需要13个碳不饱和度。3413cm-1和1646cm-1处的傅里叶红外吸收带表明存在羟基和羰基。¹³CNMR光谱显示存在26个碳，包括两个羰基δC165.5(C-3)，165.8(C-3')和四个双键碳，碳的位移分别为107.7(C-6)，108.1(C-6')，116.6(C-2)，116.8(C-2')，142.2(C-1)，141.3(C-1')，153.0(C-5)，153.9(C-5')。在¹HNMR谱中，6.23(d，J＝7.1Hz，1H，H-6)，6.25(d，J＝7.0Hz，1H，H-6')，6.37(dd，J＝8.9，1.3Hz，1H，H-2)，6.40(dd，J＝8.9，1.4Hz，1H，H-2')，7.42-7.39(m，1H，H-1)，7.46-7.43(m，1H，H-1')被分配到金雀花碱型骨架上的吡啶酮环上。3.98(d，J＝15.4Hz，1H，H-12α)，3.90(d，J＝6.6Hz，1H，H-12β)，4.03(d，J＝15.6Hz，1H，H-12'α)，3.89–3.84(m，1H，H-12'β)是金雀花碱H12/H12'的特征氢信号。分配完两个金雀花碱的H和C信号后，还剩余1.95–1.88(m，2H)，2.19(td，J＝13.4，2.9Hz，1H)，1.27–1.23(m，1H)，2.38(dd，J＝13.8，4.4Hz，1H)，3.20(td，J＝13.9，3.0Hz，1H)，4.16(p，J＝3.0Hz，1H)，由此，推断两个金雀花碱通过环连接。通过核磁谱图，该化合物具体结构式如图5所示。其对应C和H的归属如下表所示。

表1化合物的NMR核磁共振C\H归属表(400Hz)

实施例2：苦参中新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的肿瘤细胞毒性研究

2.1实验试剂及细胞

胎牛血清(Biological Industries，货号：04-007-1A)；DMEM-H培养基(Corning，货号：10-013-CVRC)；谷氨酰胺(吉诺生物科技有限公司，货号：GNM21051)；丙酮酸钠(吉诺生物科技有限公司，货号：GNM11444)；RPMI-1640培养基(Corning，货号10-010-CV)；PBS(Procell，货号：WH0112201 911XP)；胰酶(Biosharp，货号：143188)；CCK8(Invigentech，货号：IV08-100)

细胞株A431细胞和BT474细胞，购自上海赛百慷生物有限公司。

2.2细胞培养及样品处理

A431细胞，按照DMEM-H培养基：胎牛血清为9:1的比例进行配制细胞完全培养基，同时需要添加丙酮酸钠和谷氨酰胺。

BT474细胞，按照RPMI-1640培养基：胎牛血清为9:1的比例进行配制细胞完全培养基，同时需要添加牛胰岛素。

细胞在5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养。

样品(即上述实施例1所制得化合物)为固体粉末，将所有样品在紫外下照射灭菌，用DMSO溶解成40mM的浓度，用培养基按照样本浓度要求进行稀释，然后与细胞共培养24h。

表2细胞毒性实验分组及浓度梯度表

组别	处理
		Control	完全培养基
Sample-A431	浓度为250、220、200、150、100、50μM
		Sample-BT474	浓度为220、200、150、100、75、50μM

按照上述表格中的分组进行处理，分为control组和实验组，control组为完全培养基；实验组为5个样本，每个样本6个浓度，每个检测组设置3个复孔。

取对数生长期的A431和BT474细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％CO2，37℃恒温培养箱中培养过夜。按照上述分组处理，培养72h。移除培养基。用PBS清洗各孔三次，按照100μL/孔加入含10％CCK-8的培养基，5％CO2，37℃恒温培养箱中培养2小时。酶标仪检测450nm处的吸光度值。

2.3数据处理

将各组吸光度值输入Excel并计算相对活力(相对活力％＝(实验组OD值-背景OD值)/(对照组OD值均值-背景OD值)×100)，其中背景OD值为多孔板本身(未加培养基和细胞的孔)的吸光度。将相对活力数值输入GraphPad Prism中，计算IC50后作图1，结果如下：

表3化合物对A431及BT474细胞的IC50值

通过图1及图2可见，本发明的对称金雀花碱型生物碱类化合物具有A431及BT474细胞毒性，其IC50值分别达到216.1μM,193.3μM，可明显降低肿瘤细胞活性，说明本发明的对称金雀花碱型生物碱类化合物具有明显的抗肿瘤作用，可望开发为抗肿瘤药物。

实施例3：苦参中新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的PD-1抑制作用研究

3.1实验操作软件及数据库

本发明所有工作均在Microsoft Windows XP Professional操作系统中完成，采用The Scripps Research Institute研究所Dr.Oleg Trott实验室开发与维护的AutoDockTools-1.5.6、AutoDock Vina软件进行分子对接、美国剑桥公司的ChemBioOffice2004程序中的Chem 3D模块、DeLano Scientific LLC公司的开源软件Pymol进行化合物处理。参数设置除特殊说明外，均为默认值。

RCSB PDB蛋白质数据库(RCSB Protein Data Bank,PDB)是全球唯一关于大生物分子(包括蛋白质和核酸)三维结构信息的数据库。涵盖物种包括人类，细菌，酵母，植物，苍蝇和其他动物。了解这些大生物分子结构有助于推测其结构与人类健康和疾病的规律，以及推动药物的开发。PDB数据库每周更新一次，数据库中的结构文件对所有用户免费开放，本文所需的蛋白结构均来自此数据库。

3.2研究方法

通过计算机模拟，选择PD-1蛋白为受体，将本次提取得到的新型小分子化合物与PD-1蛋白受体进行分子对接。分子对接的基本流程为：受体结构的搜集和准备，及配体结构的搜集和准备，配体、受体导入AutoDock Vina，设置参数，进行分子对接。

(1)剥离PD-1

从RCSB蛋白库中选取PDB ID：6R3K的PD-1蛋白结构，下载并将复合晶体通过Pymol从蛋白结构中剥离出来，并除去杂离子及小分子配体。

(2)PD-1受体预处理

将PDB格式的蛋白导入AutoDock ToolsJ进行加氢、除水、除杂原子、添加CHARMM力场，得到受体蛋白文件PD-1.pdbqt对接配置文件。

(3)配体预处理

将上述实施例1中所提取出来的对称金雀花碱型生物碱用Chem 3D绘制结构并进行能量最小化操作，保存为.pdb格式后导入Pymol中，进行加氢、加电荷、确认旋转键等操作，得到配体小分子文件alkaloid.pdbqt对接配置文件。

(4)产生盒子

根据文献及活性残基，设置盒子至活性中心并将其完全包裹，盒子的大小设置为为

Binding pocket参数如下：x＝-9.078；y＝-10.392；z＝21.944。

(5)运行分子对接程序.

3.3分子对接结果分析

表4化合物与PD-1蛋白的分子对接结合能

由于本发明所提取的新型化合物有着良好的刚性结构，因此软件模拟出2种优势构象。其中构象1与PD-1受体蛋白的分子结合能较低，达到-7.9kcal/mol，该构象与受体蛋白结合的相互作用图如图3和图4所示。

在2D相互作用图中，绿色虚线所示为氢键，黑色实心所示原子为参与疏水作用的相应原子，红色圆弧所示氨基酸残基为参与疏水作用的非配体残基。结合化合物配体与PD-1受体蛋白相互作用图可以清晰看出，配体与Tyr123、Asp122、Tyr56、Asp61残基形成氢键，与Arg125、Lys124、Asp73、Thr20、Ala121、Va168、Gly120等参与疏水作用。氢键与范德华力之间的相互作用使得化合物与结合受体蛋白形成部分结合，一定程度上阻隔了PD-1/PD-L1信号通路，切断信号通路，激活T细胞，解除其免疫耐受，调动T细胞进行肿瘤杀伤，实现肿瘤治疗。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物，其特征在于，其化学结构式如下所示：

2.如权利要求1所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)将中间馏分经反相ODS-18柱层析，以甲醇-水溶液梯度洗脱，经薄层色谱检识，得到中间组分，再次经反相ODS-18柱层析，以甲醇-水溶液洗脱，接着经反相中压制备色谱分离，即得到目标产物。

3.根据权利要求2所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所用溶剂为质量分数80～90％的乙醇溶液。

4.根据权利要求2所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加热提取的温度为70～80℃。

5.根据权利要求2所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，对浸膏粗品进行萃取法分离的过程具体为：

6.根据权利要求5所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，调节pH所用试剂为氢氧化钠溶液，且pH被调节至10～11；

步骤(B)中，氯仿与浸膏水溶液的体积比为1:1。

7.根据权利要求2所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，梯度洗脱所用二氯甲烷-甲醇洗脱剂的98:2-50:50；

步骤(3)中，采用甲醇-水溶液以30:70～100:0梯度洗脱，经反相ODS-18柱层析，以甲醇-水溶液80:20洗脱。

8.根据权利要求7所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用二氯甲烷-甲醇洗脱剂梯度洗脱后，得到Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E五个馏分，各馏分所对应洗脱时的二氯甲烷/甲醇的浓度比分别为：98:2、95:5、90:10、70:30、50:50，并以馏分Fr.C作为中间馏分进行后续处理。

9.根据权利要求7所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，中间馏分通过经反相ODS-C18柱层析、再经甲醇-水梯度洗脱后得到Fr.C1、Fr.C2、Fr.C3、Fr.C4和Fr.C5五个馏分，各馏分所对应梯度洗脱时甲醇/水的浓度比分别为：10:90、30:70、50:50、70:30和100:0；

接着以馏分Fr.C1作为中间组分，再经过半制备型反相中压液相色谱仪纯化，得到目标产物。

10.如权利要求1所述的一种新型对称金雀花碱型生物碱类化合物的应用，其特征在于，该生物碱类化合物用于作为活性成分制备抗肿瘤药物。