CN114306757A - 一种湿粘接屏障膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于口腔生物医用材料技术领域，具体涉及一种湿粘接屏障膜及其制备方法和应用。本发明提供的湿粘接屏障膜由湿粘接水凝胶与屏障膜的骨组织面紧密贴合而成。湿粘接水凝胶包括聚多巴胺与交联聚丙烯酰胺组分，具有较强的湿粘接性能和良好的组织相容性，兼具优异的力学性能和合适的降解性能。当本发明湿粘接屏障膜应用于种植义齿修复及牙周组织再生时，不仅对潮湿牙槽骨面具有较强的粘合作用、对植骨材料具有良好的赋型作用，而且还能够有效促进细胞的早期成骨分化，促进牙周组织再生，提高种植义齿修复成功率。

Description

一种湿粘接屏障膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于口腔生物医用材料技术领域，具体涉及一种湿粘接屏障膜及其制备方法和应用。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高和种植技术的飞速发展，种植义齿已逐渐成为牙列缺损和牙列缺失的首选修复方式。种植义齿修复成功的关键是种植术区要有足够的牙槽骨骨量。然而，由于缺牙后牙槽突的生理性吸收、牙周炎、肿瘤切除、外伤等原因，临床上常会见到种植术区牙槽骨的骨高度和(或)骨宽度不足的情况，在这种情况下，需要实施行之有效的骨增量手术才能提高种植义齿修复的成功率，并获得良好的功能及美学效果。此外，牙周炎是人类最常见的口腔疾病之一，是成年人缺牙的最主要原因。牙周炎常会累及多个牙，使牙周附着结构丧失，牙松动脱落。目前，除常规牙周治疗外，联合应用牙周组织再生性手术可获得良好的治疗效果。

引导骨再生(guided bone regeneration，GBR)技术是目前应用最广泛的骨增量技术。GBR技术将屏障膜置于口腔软、硬组织之间，将生长速度较快的上皮细胞和成纤维细胞阻挡于骨缺损之外，使生长速度较慢的成骨细胞和骨细胞在不受干扰的情况下在植骨区形成新骨。引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)是通过在牙龈组织瓣和牙根面之间放置屏障膜来阻止上皮的根向移行，并提供一定的空间，有利于牙周膜衍生细胞爬行至根面形成新附着，达到牙周组织再生的目的。GBR/GTR成功的关键在于膜下屏障成骨或牙周新附着空间的建立及维持，这就要求屏障膜在局部应尽可能固定。

目前常用的屏障膜分为可吸收膜和不可吸收膜两大类。聚四氟乙烯膜和钛膜作为不可吸收膜的经典代表，具有良好的力学性能，但组织贴合性欠佳，需要使用膜钉来固定以维持成骨空间，且需行二次手术取出，存在感染和伤口裂开的风险。可吸收胶原膜由于具有良好的生物相容性、选择性屏障作用和可降解性能，无需二次手术取出，被越来越广泛地应用于临床。但可吸收屏障膜尤其是胶原膜吸湿变软后易发生塌陷及移位，导致植骨空间的丧失和植骨材料泄漏，最终无法达到预期效果。

针对这个问题，学者们通过使用膜钉或膜针来固定可吸收胶原膜，以防止植骨材料移位扩散。这种方法优点是固定效果好，较易使用；缺点是需要垂直旋入缺损区邻近骨组织，可能损伤牙根或重要解剖结构，且在较硬的皮质骨处难以旋入，用力不当可能导致骨折，同样需要二次手术大范围翻瓣拆除膜钉或膜针。为避免上述问题，有学者采用骨膜垂直褥式缝合技术，用可吸收缝线将可吸收胶原膜固定在骨增量区两侧的骨膜上。这种方法无需行二次手术，固定效果良好，但技术敏感性高，操作难度大。因此，目前仍然没有“理想”的方法来解决GBR/GTR过程中屏障膜及植骨材料固定的问题。

除了GBR技术外，骨移植术是另一种可靠的骨增量技术。其中上置式植骨术(onlaybone graft，onlay植骨术)是将植骨材料固定于牙槽骨表面来增加牙槽嵴宽度或(和)高度的骨移植技术，是目前临床上认可度非常高的骨增量技术。植骨材料按来源分为自体骨、同种异体骨、异种骨和人工合成骨材料，按形状分为颗粒状和块状。由于颗粒状植骨材料吸收快、易流失，目前常用把块状骨移植应用在onlay植骨术中，以解决中度甚至重度牙槽嵴骨量不足的问题。块状骨onlay植骨术成功的关键是保证移植骨块的固定，因此骨块常需选用长钛钉来进行固定，待骨结合形成后需行二次手术拆除钛钉，增加了感染的风险和患者的痛苦。那么，是否有更简便的方法可以稳定地固定块状骨呢？

组织粘合剂是近年来生物医学领域中的新兴材料。与传统使用缝线、缝合钉或骨钉修补破损组织相比，组织粘合剂具有多方面优点，如理化特性与组织匹配、可减少应力集中、使用方便、微创等。传统的粘接剂如氰基丙烯酸酯和聚乙烯醇等通过渗透固化或氢键作用等，可粘接两个干燥的表面，但在潮湿表面上，界面水会影响材料的渗透、固化以及界面间化学键与氢键的形成，从而导致粘接失败。同时，材料的毒性对破损组织愈合的影响也不可忽视。

因此，有必要开发一种全新的湿粘接屏障膜体系，以维持植骨空间并防止植骨材料移位和泄漏，提高种植义齿修复的成功率并促进牙周组织再生。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本申请旨在提供一种湿粘接屏障膜及其制备方法和应用，能够用于种植义齿修复及牙周组织再生领域的屏障膜及植骨材料的固定。湿粘接屏障膜不仅对潮湿牙槽骨面具有较强的粘合作用、对植骨材料具有良好的赋型作用，而且还能够有效促进细胞的早期成骨分化，促进牙周组织再生，提高种植义齿修复的成功率。

基于上述目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种湿粘接屏障膜的制备方法，包括如下步骤：

S1.向盐酸多巴胺溶液中加入引发剂过硫酸铵，经搅拌反应制得聚多巴胺(polydopamine，PDA)溶液；

S2.向PDA溶液中依次加入丙烯酰胺(AM)、交联剂和四甲基乙二胺，搅拌均匀后制得湿粘接水凝胶；

S3.将湿粘接水凝胶与屏障膜的骨组织面贴合，经干燥制得湿粘接屏障膜。

本申请以过硫酸铵作为引发剂，引发盐酸多巴胺的聚合反应，生成PDA；随后向PDA溶液中加入AM、交联剂和四甲基乙二胺，搅拌均匀并加热引发共聚合反应，制得本申请所述湿粘接水凝胶。反应过程中利用交联剂与丙烯酰胺共聚形成以聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAM)为主体的三维交联网络，其中四甲基乙二胺起加速反应的作用。

本申请制备的湿粘接水凝胶为基于PDA的湿粘接水凝胶体系，其主体框架包括PDA和PAM，因此本申请湿粘接水凝胶命名为PDA-PAM湿粘接水凝胶，并简称为DAH。

当基于PDA体系的湿粘接水凝胶与被粘接的潮湿底物结合时，首先通过溶胀作用快速吸收界面水分，再利用PDA中邻苯二酚基团和底物形成氢键、碳氮双键以及π-π堆叠作用等，以实现牢固粘接潮湿底物的效果。此外，基于PDA体系的湿粘接水凝胶具有生物相容性好、机械性能易于调控以及湿粘接过程快速等优点，在临床手术中应用更具有优势。另一方面，DAH中的PDA能与潮湿的骨面上Ca²⁺离子螯合，促进羟基磷灰石的沉积，并且通过促进羟基磷灰石矿化加速干细胞的成骨分化，具有良好的成骨性能。

PAM是水凝胶的主体框架材料，其机械性能易调控，易于进行化学改性，生物相容性良好。

进一步地，交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)和/或甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。

天然大分子交联剂GelMA是碳-碳双键功能化的明胶，有与明胶类似的较好的降解性能，其双键可在丙烯酰胺聚合的过程中与之共聚，调节三维网络框架的力学性能与降解性能。另外，GelMA具有与胶原蛋白相似的生物活性，含有许多精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，其含有的基质金属蛋白的靶序列与天然ECM非常相似，提高生物相容性，有利于细胞黏附、迁移和增殖。

进一步地，N,N-亚甲基双丙烯酰胺在交联剂中的重量百分比为50％～100％。

进一步地，N,N-亚甲基双丙烯酰胺在交联剂中的重量百分比为80％。

本申请通过调整湿粘接水凝胶中MBAA在交联剂中的含量来调整水凝胶的力学性能和降解性能。由于MBAA是小分子交联剂，而GelMA是大分子交联剂，实验发现随着MBAA在体系交联剂中的比例增大，交联密度增加，水凝胶变得更加硬而韧，降解速率变慢。试验发现，当湿粘接水凝胶的交联剂中MBAA的重量百分比为80％时，同时具有适宜的力学性能和降解性能。试验还发现，湿粘接水凝胶中交联剂组分配比的变化并不影响湿粘接水凝胶在湿环境中的粘性强度。

进一步地，根据所用屏障膜的大小及形状，沿屏障膜的边缘裁剪湿粘接水凝胶的边缘。

根据术区范围大小，选用合适大小的商用屏障膜或将屏障膜裁成一定大小及形状。裁剪完后，可将本申请所制备的湿粘接水凝胶贴合于屏障膜的骨组织面上，并沿屏障膜的边缘裁剪湿粘接水凝胶的边缘，形成适合术区大小的屏障膜与湿粘接水凝胶复合材料。

进一步地，湿粘接屏障膜的骨组织面的中央区域暴露出屏障膜，骨组织面的其余部分由湿粘接水凝胶覆盖。

具体地，根据植骨材料覆盖的范围，于屏障膜与湿粘接水凝胶复合材料中央区裁去所需区域的湿粘接水凝胶，以暴露出屏障膜的骨组织面。屏障膜的骨组织面其余部分由湿粘接水凝胶覆盖，烘干制得湿粘接屏障膜。

进一步地，屏障膜与湿粘接水凝胶形成的复合材料干燥的温度为35～45℃。

根据植骨材料覆盖的范围，于复合材料中央区个性化地裁去所需成骨区域的湿粘接水凝胶，以暴露屏障膜的骨组织面，充分发挥屏障膜稳定血凝块及促成骨细胞增殖等功能。裁切好的复合材料置于35～45℃下烘干，使水凝胶材料通过机械锁结作用与屏障膜的骨组织面紧密结合，形成完全适合术区特征的个性化湿粘接屏障膜。试验发现，当屏障膜与湿粘接水凝胶复合材料的烘干温度为40℃时，烘干速度适中，水凝胶与屏障膜结合良好，且不影响胶原屏障膜的质地。

第二方面，本申请提供一种由前述方法制得的湿粘接屏障膜。

由本申请所述方法制得的湿粘接屏障膜对潮湿牙槽骨面具有较强的粘合作用、对植骨材料具有良好的赋型作用，而且还能够有效促进细胞的早期成骨分化。

第三方面，本申请提供前述湿粘接屏障膜在种植义齿修复及牙周组织再生中的应用。

湿粘接水凝胶在湿环境中具有较强的粘接强度，同时具有较强的力学性能、可降解性以及良好的生物相容性，与屏障膜复合制备而成的湿粘接屏障膜能够用于种植义齿修复及牙周组织再生。

进一步地，所述湿粘接屏障膜在固定屏障膜和植骨材料中的应用。

湿粘接水凝胶与胶原膜屏障膜之间紧密结合并有相互渗透的趋势；在极端的剪切摩擦环境下，依然能够有效避免胶原屏障膜与骨粉的位移；湿粘接水凝胶对植骨材料具有良好的赋型作用，而且还能够有效促进细胞的早期成骨分化活性，提高种植义齿修复及牙周组织再生的成功率。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供一种湿粘接屏障膜，具有较强的力学性能的同时具有适宜的降解性能和良好的组织相容性。当本申请湿粘接屏障膜应用于固定屏障膜和植骨材料时，不仅对潮湿牙槽骨面具有较强的粘合作用、对植骨材料具有良好的赋型作用，并且能够有效促进细胞的早期成骨分化，促进牙周组织再生，提高种植义齿修复的成功率。

附图说明

图1为不同湿粘接水凝胶对骨髓间充质干细胞细胞骨架影响的荧光图；

图2为不同湿粘接水凝胶对红细胞溶血影响试验图；

图3为湿粘接屏障膜(ABM)的实物图；

图4为ABM及其界面扫描电镜图；

图5为不同交联剂比例的DAH对屏障膜以及骨面的剪切粘性；

图6为模拟在体内剪切摩擦力作用前后Col和ABM的抗摩擦漏粉效果图；

图7为Col和ABM体内固定植骨材料并促进原位成骨效果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处.所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中商用胶原屏障膜(Col)来自Geistlich

实施例1

本实施例提供一种湿粘接水凝胶(简称DAH-80)及其制备方法如下：

(1)在50mL去离子水中加入0.25g盐酸多巴胺，搅拌溶解，然后加入1.75g过硫酸铵，搅拌反应30min；

(2)向上述溶液中依次加入12.50g AM、100mg MBAA、25mg GelMA以及93.8μL四甲基乙二胺，搅拌均匀后倒入模具中，于60℃恒温反应2h制成湿粘接水凝胶，简称DAH-80。

实施例2

本实施例提供一种湿粘接水凝胶(简称DAH-60)及其制备方法如下：

(1)在50mL去离子水中加入0.25g盐酸多巴胺，搅拌溶解，然后加入1.75g过硫酸铵，搅拌反应30min；

(2)向上述溶液中依次加入12.50g AM、75mg MBAA、50mg GelMA以及93.8μL四甲基乙二胺，搅拌均匀后倒入模具中，于60℃恒温反应12h制成湿粘接水凝胶，简称DAH-60。

实施例3

本对比例提供一种湿粘接水凝胶(简称DAH-100)及其制备方法如下：

(1)在50mL去离子水中加入0.25g盐酸多巴胺，搅拌溶解，然后加入1.75g过硫酸铵，搅拌反应30min；

(2)向上述溶液中依次加入12.50g AM、125mg MBAA以及93.8μL四甲基乙二胺，搅拌均匀后倒入模具中，于60℃恒温反应12h制成水凝胶，简称DAH-100。本实施例水凝胶中不含GelMA。

性能测试

1、压缩性能

经对实施例1、2、3所制得的湿粘接水凝胶的循环压缩性能进行检测，结果表明：DAH-60水凝胶经过20次10kPa压缩应力的负载-卸载循环后，能基本保持其原始力学性能，但是效果不如交联密度更高的DAH-80和DAH-100湿粘接水凝胶；DAH-80水凝胶和DAH-100水凝胶经过20次10kPa压缩应力的负载-卸载循环后，仍能保持其原始力学性能，说明其力学稳定性较好。上述结果说明，随着MBAA小分子交联剂在体系交联剂中的比例增大，交联密度增加，水凝胶变得更加坚韧，抗压缩性能增强。

2、拉伸性能

经对实施例1、2、3所制得的湿粘接水凝胶的拉伸性能进行检测，结果如下：DAH-80水凝胶的拉伸强度为111kPa，断裂伸长率为383％；DAH-100水凝胶的拉伸强度为278kPa，断裂伸长率为472％；而DAH-60由于湿粘接水凝胶过于柔软，未检测到其拉伸强度及断裂伸长率数据。上述结果表明，随着小分子交联剂MBAA在体系交联剂中的比例增大，水凝胶的交联密度增加，水凝胶变得更加坚韧，抗拉伸性能增强。

3、降解性能

将实施例1、2、3水凝胶充分干燥后，分别称取一定量的上述干燥后的水凝胶于0.01mol/L PBS中，在37℃、120rpm恒温摇床下培养，每3d更换1次PBS，分别于1d、3d、5d、7d、14d和28d后取出水凝胶，并充分干燥后称重，检测28d内水凝胶重量变化。

结果发现：三种水凝胶均呈现在前5天快速降解趋势，而在第7天之后降解速率减缓。另外，随着易降解的GelMA在交联剂中比例降低(DAH-60至DAH-100中GelMA从40％降至0％)，DAH降解速率与降解比例均明显下降。

4、生物相容性

(1)不同水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖的影响

将实施例1、2、3水凝胶于培养基浸泡48h制得浸提液，培养基中各水凝胶的浸泡量均为20mg/mL。取第三代大鼠骨髓间充质干细胞接种至孔板，以浸提液为实验组，培养基为对照组培养细胞，通过CCK8法检测接种后1d、3d和7d细胞的增殖情况，结果显示各组检测结果相近，且细胞增殖随时间呈上升趋势，表明各组DAH及其降解产物不会产生细胞毒性，细胞可正常生长增殖。

(2)不同水凝胶对骨髓间充质干细胞细胞骨架的影响

将实施例1、2、3水凝胶于培养基浸泡48h制得浸提液，培养基中各水凝胶的浸泡量均为20mg/mL。取第三代大鼠骨髓间充质干细胞接种至孔板，以浸提液为实验组，培养基为对照组培养细胞，通过F-actin/DAPI免疫荧光染色观察水凝胶对细胞骨架的影响，结果如图1所示，结果显示细胞均呈梭形，细胞核呈现蓝色荧光，细胞骨架呈现绿色荧光，细胞骨架呈丝状清晰地沿同一方向排列，细胞核较为居中，证明细胞较为伸展，生长状态良好，不同交联剂配比的DAH对骨髓间充质干细胞的细胞骨架无明显影响。

(3)不同水凝胶对红细胞溶血的影响

以实施例1、2、3水凝胶为实验组，以PBS为阴性对照，以0.2％Triton X-100稀释液为阳性对照，将上述各试样与新鲜兔血红细胞于37℃混合孵育30min，检测吸光度，计算溶血率，评估水凝胶血液相容性，结果如图2所示，结果表明水凝胶和PBS引起红细胞溶血结果间无统计学差异，由此说明本申请湿粘接水凝胶不会引起红细胞溶血，具有良好的血液相容性。

实施例4湿粘接屏障膜的制备及其粘接性能测试

1、试样准备

本实施例将商用胶原屏障膜裁剪至10mm×10mm，将实施例1、2、3水凝胶与胶原屏障膜的疏松层复合，并于正中部裁出直径为6mm的圆孔以暴露出胶原屏障膜，随后于40℃烘箱中烘干制得湿粘接屏障膜(ABM)，如图3所示。

以实施例1湿粘接水凝胶为例，经上述方法制得湿粘接屏障膜后，借助扫描电镜观察湿粘接屏障膜界面的微观形貌，结果如图4所示。可以看出，湿粘接水凝胶与胶原屏障膜之间紧密结合，并有相互渗透的趋势，证明湿粘接屏障膜复合材料的一体性。

2、湿粘接屏障膜性能测试

(1)剪切粘性测试

将10mm×10mm的实施例1、2、3水凝胶与胶原屏障膜的疏松层复合并烘干，粘贴于潮湿的新鲜猪肋骨表面。其中，水凝胶与新鲜猪肋骨表面直接接触，使用万能测试机施加剪切拉伸力，通过拉伸阶段最大的剪切应力计算剪切粘性大小。

结果表明：分别贴覆有实施例1、2、3中三种DAH的湿粘接屏障膜对骨面均有较强粘性(>90kPa)，如图5所示；同时也表明湿粘接水凝胶和胶原屏障膜之间具有较强的相互结合作用，不易分离。另外，尽管三种水凝胶中MBAA含量不同，但对湿粘接屏障膜的粘性强度没有明显影响。

(2)抗剪切摩擦性能

以商用胶原屏障膜(Col)为对照组，以由实施例1制得的湿粘接水凝胶参照实施例4中记载的方法制得的湿粘接屏障膜为实验组，测试其抗剪切摩擦漏骨粉效果。在新鲜猪肋骨表面制造直径6mm的圆形术区，术区内骨组织去皮质化，植入15mg植骨材料，使其表面在骨面隆起高度约2mm。在骨面喷洒一定量水模拟口内潮湿环境，骨缺损处分别覆盖10×10mm的Col和ABM并密切贴于骨面。将重约150g的滑块表面粘接新鲜带肉猪肋骨骨膜，放置在屏障膜上方，模拟口内压力带来的影响，骨膜接触屏障膜以模拟口内软组织对屏障膜的作用，使用剪切机器进行10次和30次的10mm循环剪切摩擦。结果发现：分别经过10次和30次的10mm循环剪切摩擦，通过湿粘接屏障膜复合材料固定的骨粉只有轻微的摩擦损耗，损耗量仅为6.2％和6.7％，而直接用胶原屏障膜固定的骨粉有较大的摩擦损耗，损耗量高达61.1％和67.8％，如图6所示。上述结果表明：在极端的剪切摩擦环境下，湿粘接屏障膜仍能有效的避免屏障膜与骨粉的移位。

(3)对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

以商用胶原屏障膜(Col)为对照组，以由实施例1制得的湿粘接水凝胶参照实施例4所述方法与胶原屏障膜制得的湿粘接屏障膜为实验组，分析湿粘接屏障膜对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。

取第三代骨髓间充质干细胞分别与对照组胶原屏障膜、实验组DAH-80和ABM共培养，ALP检测结果显示在成骨诱导7d和14d后，DAH-80组比Col组的碱性磷酸酶活性显著升高(P<0.05)，表明DAH-80湿粘接水凝胶比胶原屏障膜能更好促进细胞的早期成骨分化活性。

(3)对兔胫骨成骨的影响

以商用胶原屏障膜(Col)为对照组，以由实施例1制得的湿粘接水凝胶参照实施例4所述方法制得的湿粘接屏障膜(ABM)为实验组，测试对兔胫骨成骨的效果。

用环形骨钻在兔胫骨近心端内侧骨皮质制备直径为6mm的圆形术区，圆形区域内骨组织去皮质化，打出5个滋养孔，在缺损区内移植等量骨粉或直径为6mm的自体颅骨骨块(自体骨)，按照实验分组放置Col和ABM屏障膜，分层缝合骨膜、肌肉和皮肤。

2个月后扫描Micro-CT，结果如图7所示，骨缺损区ABM组的自体骨剩余量和骨粉存留量均明显多于Col组，表明本发明ABM可有效固定块状骨和骨粉，并促进其原位成骨。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种湿粘接屏障膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.向盐酸多巴胺溶液中加入引发剂过硫酸铵，经搅拌反应制得聚多巴胺溶液；

S2.向聚多巴胺溶液中依次加入丙烯酰胺、交联剂、四甲基乙二胺，搅拌均匀后制得湿粘接水凝胶；

S3.将湿粘接水凝胶与屏障膜的骨组织面贴合，经干燥制得湿粘接屏障膜。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰化明胶。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺在交联剂中的重量百分比为50％～100％。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺在交联剂中的重量百分比为80％。

5.由权利要求1～4任一项所述制备方法制得的湿粘接屏障膜。

6.权利要求5所述湿粘接屏障膜在种植义齿修复及牙周组织再生中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述湿粘接屏障膜在固定屏障膜和植骨材料中的应用。

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