可再吸收的交聯形態穩定膜
本發明係關於用於口腔之新穎可再吸收的交聯形態穩定膜，關於一種製備彼膜之方法及其作為在人類或動物中之不含牙骨之缺損位點處支援骨骼形成、骨骼再生、骨骼修復及/或骨骼替換的植入物之應用。
為藉由骨骼形成(諸如在上頜骨或下頜骨中水平地或垂直地擴增)來再生不含骨的缺損，缺損之機械穩定化係必需的(Bendkowski 2005 "Space to Grow" The Dentist: 3；Merli, Migani等人2007 Int. J. Oral Maxillofac. Implants 22(3): 373-82；Burger 2010 J. Oral Maxillofac. Surg. 68(7): 1656-61；Louis 2010 Oral Maxillofac. Surg. Clin. North Am. 22(3): 353-68)。實際上，口腔組織在咀嚼、吞咽、舌部移動、講話、牙齒移動及畸齒矯正治療期間遭受到複雜的機械力。尤其在外科手術後的傷口癒合期間，可出現內部力及外部力，在再生裝置及最新成形組織上產生應力、剪力及彎矩。 一種抵禦彼等力之形態穩定膜係達成彼機械穩定化之有用構件。 已知鈦網、鈦板或經鈦加固PTFE形態穩定膜用於該目的，該等膜在骨骼再生之後在二次手術期間必須予以移除。可商購經鈦加固形態穩定膜之實例為由Osteogenics出售之Cytoplast®膜。然而，據報導，在使用膨脹型經加固鈦膜時出現開裂或其它併發症之可能性較高(Strietzel 2001 Mund Kiefer Gesichtschir. 5(1): 28-32; Merli, Migani等人2007同上；Rocchietta, Fontana等人2008 J. Clin. Periodontol. 35(第8增刊) : 203-15)。 在1996年引入可再吸收的膠原蛋白膜之前，普遍地使用未經加固之PTFE膜，但在引入該膠原蛋白膜之後便迅速消失。 為避免在二次手術中移除形態穩定膜或網的必要性，可再吸收的形態穩定膜受到關注。已描述基本上由PLA (聚乳酸)或PLGA (羥基乙酸共聚物)製成之若干可再吸收的形態穩定膜或網。應注意之實例係(1)來自KLS Martin之「Sonic Weld RX®」及「Resorb-X®」；(2)來自Sunstar Americas之「Guidor®」；(3)來自Curasan之「Inion GTR System™」及(4)來自Depuy Synthes之「RapidSorb®」。彼等膜之不足之處係，在該等膜之活體內水解降解期間，其釋放導致干擾傷口癒合之組織刺激及組織學標識的乳酸及/或乙醇酸(Coonts , Whitman等人1998 Biomed. Mater. Res. 42(2): 303-11；Heinze 2004 Business briefing: Lobal Surgery: 4；Pilling, Mai等人2007 Br J. Oral Maxillofac. Surg. 45(6): 447-50)。 為克服與傷口癒合問題相關之PLGA/PLA，使用來自病患之自體骨骼塊及部分或完全純化之骨骼塊(諸如，Bio-Oss® Block (Geistlich Pharma A.G.)或Puros® Allograft Block (RTI Surgical Inc.))係普遍公認的。自體骨骼塊之不足之處在於，其自第二部位採集，導致更大的疼痛(Esposito, Grusovin等人2009 Eur. J Oral Implantol. 2(3): 167-84)。 為能在手術期間使用所採集之自體骨骼碎塊(通常與異種移植骨粒合併)，研發出使用來自下頜骨之自體皮層骨骼的所謂骨盾技術(Khoury, Hadi等人2007 「Bone Augmentation in Oral Implantology」, London, Quintessence)。此程序之缺點為其極具技術敏感性及其與第二部位發病率相關且更加疼痛。此外，僅側向地施加骨盾，因此自缺損之冠狀面態樣而言並未給予機械保護。術語「骨盾」用以通告PLA/PLGA以及經部分地去礦物質之皮層骨盾(來自Tecnoss之Semi-Soft及Soft Lamina Osteobiol®)。此經去礦物質之骨盾之缺點係：必須始終固定彎曲骨盾，彎曲骨盾與(例如)經鈦加固PTFE膜相比相對厚，及其在骨缺損之冠狀面態樣上僅以具有弧形邊緣的圓形出現。對牙醫而言，隆脊之冠狀面態樣中之6 mm至8 mm寬的坪將係非常較佳的(Wang及Al-Shammari 2002 Int. J. Periodontics Restorative Dent. 22(4): 335-43)。 揭示於US-8353967-B2之可再吸收的形態穩定膠原蛋白膜試圖將順利癒合及形態穩定性合併，該可再吸收的形態穩定膠原蛋白膜由模具中之含膠原蛋白懸浮液之5%至25%的乙醇/水藉由冷凍-乾燥並在100℃至140℃下加熱而製備。此膜由美國的Osseous Technologies製造並由Zimmer以商標名「Zimmer CurV Preshaped Collagen Membrane」銷售。該市售膜形態穩定性弱且厚度為約1.5 mm，在鹽水中培育之後上升至約2.3 mm；此可導致較高的開裂率之風險。 概言之，當前解決方案因此並未充分滿足牙醫或病患需求。需要二次手術及/或傷口癒合不順利的風險較高。與傷口癒合不順利的較高風險不相關之解決方案不是非形態穩定膜，需要二次手術，就是具有其它缺點。 US 2013/0197662揭示一種製造生物材料之製程，其包含：a)藉由將受控量之包含膠原蛋白的凝膠塗覆至無孔膠原蛋白基材料之黏結表面，並使多孔膠原蛋白基材料之表面與塗覆至黏結表面的凝膠接觸，以在材料之間的介面處部分地水合多孔材料之一部分，從而使得多孔膠原蛋白基材料連接無孔膠原蛋白基材料；b)乾燥凝膠以將材料黏結在一起；及c)在黏結層中交聯膠原蛋白。所獲得之經製造之生物材料將可被礦化[0042]、[0048]之多孔膠原蛋白基材料與機械性強的無孔膠原蛋白基材料合併，因此提供用於再生負荷承載組織(尤其為半月板、關節軟骨、肌腱及韌帶)之架構，該經製造生物材料具有孔隙性及機械強度兩者，亦即，能夠抵禦壓縮力及拉力。對於抵禦彼經合併之生物材料之彎矩而言，或對於經礦化之多孔膠原蛋白基材料之複合物而言，並未揭示任何(教示)。 US 2014/0193477教示，在由可溶膠原蛋白製造膠原蛋白墊中，在其交聯之前拉伸膠原蛋白提高其機械強度，尤其提高極限抗拉強度(UTS)、硬度及彈性模數(楊氏模數) (具體參見[0109]、[0110])。 Langdon, Shari E等人Biomaterials 1998, 20(2), 137-153 CODEN及Chachra, Debbie等人, Biomaterials 1996, 17(19), 1865-1875 CODEN揭示，在膜交聯之前拉伸心包源膜提高其抗拉強度及硬度。
本發明之目的係提供一種用於口腔之可再吸收的交聯形態穩定膜，其適於抵禦應力、剪力及彎矩以便在不含骨之缺損位點處支援骨骼形成、骨骼再生、骨骼修復及/或骨骼替換，尤其在上頜骨或下頜骨中呈水平或垂直地擴增，其不具有上述缺點。 該目的藉由如所附權利要求書中所定義之本發明實現。
本發明提供用於口腔之可再吸收的交聯形態穩定膜，其包含每1重量份之膠原蛋白材料含有1.5重量份至3.5重量份之無機陶瓷的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層，該膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間，該膠原蛋白材料包含50%至100% (w/w)之膠原蛋白及0%至50% (w/w)之彈性蛋白。 術語「膠原蛋白材料」在本文中意謂包含50%至100% (w/w)之膠原蛋白及0%至50% (w/w)之彈性蛋白的基於膠原蛋白之材料。在本文中彈性蛋白含量根據涉及水解及RP-HPLC之已知方法的修改，藉由鎖鏈素/異鎖鏈素測定來量測(例如參見，Journal of Chromatography中Guida E.等人1990Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues
或The Open Respiratory Medicine Journal中Rodriguqe P 2008Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development
)。為測定乾燥彈性蛋白之鎖鏈素/異鎖鏈素含量，對海綿之彈性蛋白進行如在1976年由Starcher及Galione描述之彈性蛋白分離程序(Analytical Biochemistry中Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species
)。 該膠原蛋白材料適合源自含有此比例之膠原蛋白與彈性蛋白的天然來源之組織。此等組織之實例包括脊椎動物，具體而言哺乳動物(例如，豬、牛、馬、綿羊、山羊、兔)之腹膜或心包膜、胎盤膜、小腸黏膜下層(SIS)、真皮、硬腦膜、韌帶、肌腱、隔膜(胸隔膜)、網膜、肌肉或器官之筋膜。此類組織較佳為豬、牛或馬。所關注之組織為豬、牛或馬腹膜。 通常膠原蛋白主要為I型膠原蛋白、III型膠原蛋白或其混合物。膠原蛋白亦可包括一定比例之尤其II型、IV型、VI型或VIII型膠原蛋白或彼等或任何膠原蛋白類型之任何組合。 較佳地，膠原蛋白材料含有70%至90% (w/w)之膠原蛋白及30%至10% (w/w)之彈性蛋白。 用於製備此膠原蛋白材料之合適的起始物質之實例為由豬、牛或馬腹膜或心包藉由類似於描述於EP-B1-1676592之「實例」中的製程來製備之膠原蛋白膜，或由豬腹膜藉由此製程製備之膜Geistlich Bio-Gide® (可獲自Geistlich Pharma A.G.，瑞士)。 較佳地，膠原蛋白材料源自豬、牛或馬腹膜或心包膜、小腸黏膜(SIS)或肌肉筋膜。 膠原蛋白材料一般且較佳地為具有天然纖維結構或作為經剪切之膠原蛋白纖維之纖維膠原蛋白材料。 然而，倘若膠原蛋白材料就彈性模數而言具有足夠的機械穩定化以及最大抗拉強度，則亦可在膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層中，或在彈性預拉緊膠原蛋白材料之層中使用非纖維膠原蛋白材料(諸如，由分子膠原蛋白再造之小纖維或具有足夠生物相容性及可再吸收性之交聯膠原蛋白片段) (參見下文)。 術語「可再吸收」在本文中意謂交聯形態穩定膜能夠尤其經由膠原酶及彈性蛋白酶之活動在活體內經再吸收。對於無過度發炎或開裂之癒合而言，交聯形態穩定膜之受控活體內可再吸收性必不可少。使用詳細描述來自以下詳細描述之溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolicum
)之膠原蛋白酶(實例4、實例3)之酶降解測試得出活體內可再吸收性之極佳預測。 所測試之本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之所有經測試原型展示，在4小時後，至少10%膠原蛋白降解(如使用I型膠原蛋白作為標準藉由DC Protein檢定評定)，膠原蛋白降解速率(低於Geistlich Bio-Gide®膜之速率)取決於所使用之交聯條件。 術語「交聯」意謂可再吸收的形態穩定膜已經受至少一個交聯步驟(通常為化學交聯(使用例如EDC及NHS)或藉由脫水加熱處理(DHT)交聯)，通常藉由化學交聯(使用例如EDC及NHS)或藉由脫水加熱處理(DHT)對夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之經裝配複合層進行彼步驟。視情況，膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層在其裝配入本發明之膜中之前通常已藉由化學交聯或藉由脫水加熱處理(DHT)已交聯。 術語「用於口腔之可再吸收的交聯形態穩定膜」意謂，可再吸收的交聯膜能夠藉由提供缺損之機械穩定化(亦即抵禦口腔中出現之應力、剪力及彎矩)在人類或動物中之不含牙骨之缺損位點處支援骨骼形成、骨骼再生、骨骼修復及/或骨骼替換。藉由以下詳細描述(實例4.2中)之3點單軸彎曲測試來評定本發明之膜之形態穩定性：彼測試類似於闡述於EN ISO 178及ASTM D6272-10中之方法，本發明之膜浸沒在pH為7.4溫度為37℃之PBS中。該測試展示，本發明之膜提供實質上比比較性PLA膜Resorb-X® (KLS Martin)更強的穩定化作用。 一般而言，在彼3點單軸彎曲測試中，可再吸收的交聯形態穩定膜在8 mm應變下抵禦至少0.20 N，較佳地至少0.30 N之力。 術語「彈性預拉緊膠原蛋白材料層」意謂，在該等層交聯之前，膠原蛋白材料層已經受拉緊，使得膠原蛋白材料層之初始大小自應力-應變曲線之腳趾區伸長或拉伸至線性(亦稱彈性)區中(參見，Blayne A. Roder等人, 2002, Journal of Biomechanical Engineering, 124, 214-222，尤其圖3，第216頁，或本申請案之圖5)。在此線性區內，彈性模數最高且因此可達成最高硬度。可(例如)藉由彈簧對膠原蛋白材料片徑向地進行彼拉緊。待施加以使得將膠原蛋白材料伸長或拉伸至應力-應變曲線之線性區中的此拉緊之力取決於膠原蛋白材料。當膠原蛋白材料源自豬、牛或馬腹膜膜時，可藉由在1 N與3 N之間拉緊之彈簧對膠原蛋白材料片徑向地進行產生膠原蛋白材料之應力-應變曲線之線性區的拉緊，使得伸長或拉伸膠原蛋白材料層初始大小之40%至100%。 術語「彈性預拉緊膠原蛋白材料」因此意謂已經拉伸以便在應力-應變曲線之線性(彈性)區內之膠原蛋白材料。 彈性預拉緊膠原蛋白材料之彈性模數(亦稱楊氏模數) (亦即以MPa表達之應力-應變曲線之線性區的斜率)一般為自1 MPa至1000 MPa，較佳地自2 MPa 至150 MPa，尤其自5 MPa至80 MPa。 似乎需要出現夾膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層的彼等兩層「彈性預拉緊膠原蛋白材料」，以在膜經受拉力、壓縮力、剪力及彎矩時保護複合層免於斷裂。 較佳地，彈性預拉緊膠原蛋白材料層中之一者包括5 µm至 500 µm的孔。當膜放置就位時，彈性預拉緊膠原蛋白材料之經穿孔層將朝骨缺損定向，該等孔使得骨骼形成細胞輕易地侵入至無機陶瓷膠原蛋白複合材料中。 無機陶瓷為促進骨骼再生之生物相容性材料，諸如羥基磷灰石或天然骨礦物質。 在牙齒、牙周及頜面骨缺損中促進骨骼生長之熟知天然骨礦物質為可購自Geistlich Pharma AG之Geistlich Bio-Oss®。基於羥基磷灰石之彼骨骼礦物質材料藉由描述於美國專利第5,167,961號中的製程由天然骨骼製成，該製程能保持天然骨骼之小樑架構及奈米晶結構。 較佳地，無機陶瓷為基於羥基磷灰石之天然骨礦物質，諸如Geistlich Bio-Oss®。 無機陶瓷顆粒一般具有50 µm至600 µm，較佳地150 µm至500 µm，尤其250 µm至400 µm之大小。 膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合物每1重量份之膠原蛋白材料包含1.5重量份至3.5重量份、較佳地2.0重量份至3.0重量份之無機陶瓷。 實際上，已出乎意料地發現，在每1重量份之膠原蛋白材料少於1.5重量份之無機陶瓷，或在每1重量份膠原蛋白材料多於3.5重量份之無機陶瓷時，如上所定義並藉由以下詳細描述(實例4.2中)之3點單軸彎曲測試所評定：膜並非「形態穩定」。當膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合物包含1重量份之膠原蛋白材料2.0重量份至3.0重量份之無機陶瓷時，形態穩定性尤其高。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜為親水性的，一般在5分鐘至10分鐘內完全由PBS潤濕。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之細胞黏附特性類似於Geistlich Bio-Gide®之細胞黏附特性，Geistlich Bio-Gide®因其具有低開裂率或低過度發炎率之良好癒合特性而為人熟知。此表明良好的癒合特性，無諸如開裂或過度發炎之不良情況。 已在植入本發明之交聯形態穩定膜以保護在家兔顱骨中造成之骨缺損時觀測到此良好的癒合特性。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜的厚度通常為自0.5 mm至2.5 mm，較佳1.0 mm至2.0 mm，尤其1.2 mm至1.8 mm。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜的典型形狀及典型尺寸呈現於圖1中。 本發明亦關於上述可再吸收的交聯形態穩定膜，其用作在人類或動物中之不含牙骨之缺損位點處支援骨骼形成、骨骼再生、骨骼修復及/或骨骼替換的植入物。 本發明亦關於一種製備上文所定義之可再吸收的交聯形態穩定膜之方法，該可再吸收的交聯形態穩定膜包含夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層，該方法包含以下步驟： (a) 製備膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層，視情況使該複合層交聯， (b) 在經受拉緊之兩層膠原蛋白材料之間裝配並膠合該膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層，該拉緊使得該膠原蛋白材料拉伸在該應力-應變曲線的線性區中；由此得到夾在該兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層，及 (c) 使夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的該膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層交聯，繼之進行製造親水性之處理。 可藉由以下進行步驟(a)： - 藉由類似於描述於US-A-5417975中之製程由皮質骨或松質骨產生作為無機陶瓷顆粒之羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒，或替代性地將Geistlich Bio-Oss Small Granules (可購於Geistlich Pharma AG)研磨成更小的微粒，並以所需範圍(例如，150 µm至500 µm或250 µm至400 µm)使彼等顆粒經受篩分，由此得到經篩分之羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒。 - 藉由以下製備纖維膠原蛋白材料： o 使來自豬、牛或馬腹膜或心包膜之富含膠原蛋白之組織經受類似於EP-B1-1676592之實例中所描述之製程之製程；或替代性地自藉由此製程由豬腹膜獲得之Geistlich Bio-Gide膜(可購自Geistlich Pharma AG)開始，或自在工業化生產Geistlich Bio-Gide膜除菌之前所獲得之中間產物(本文稱之為未除菌Geistlich Bio-Gide膜)開始， o (例如用剪刀)將因此獲得之膠原蛋白纖維組織剪切成片，使用切碎機將彼等經剪切膠原蛋白纖維組織之片塊與乾冰混合，因此得到經剪切膠原蛋白纖維， o 用帶篩剪切機將膠原蛋白纖維組織剪切成片塊，因此得到膠原蛋白纖維片段之經篩分碎片。 - 藉由以下製備纖維膠原蛋白材料及羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒之複合層： o 在磷酸鹽緩衝鹽水PBS中混合並振盪0 wt%至40 wt%之經剪切膠原蛋白纖維及60 wt%至100 wt%之以上所獲得之經篩分膠原蛋白纖維片段之碎片振盪， o 將以上所得之自1.5重量份至3.5重量份(尤其2.0至3.0重量份)之經篩分羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒添加至以上段落中所得之1重量份之纖維膠原蛋白，以2000 xg至6000 xg，較佳地3000 xg至5000 xg離心，使用刮勺將所得離心塊倒入至矩形模型中並形成板。使所獲得之纖維膠原蛋白材料及羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒之複合層在真空烘箱中乾燥。 並非必需在(a)結束後交聯膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之乾燥複合層，但交聯具有有助於在步驟(b)期間處置彼複合層之益處。 可使用化學製品或藉由脫水加熱處理(DHT)來進行彼交聯。 可使用能夠向交聯形態穩定膜提供所需之機械強度的任何醫藥學上可接受之交聯劑進行使用化學製品之交聯。合適的此類交聯劑包括：戊二醛、乙二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁二縮水甘油醚(BDDGE)、N-磺基丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯、二異氰酸己二酯(HMDC)、氰胺、二苯基磷醯基疊氮化物、京尼平(genipin)、EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺)以及EDC及NHS (N-羥基琥珀醯亞胺)之混合物。 使用化學製品之交聯宜使用NHS及EDC之混合物進行。 在彼情況下，可使以上所得之纖維膠原蛋白材料及羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒之乾燥複合層在pH 5.5之含10 mM 至400 mM EDC及13 mM至520 mM NHS的0.1 M MES (2-(N-嗎啉基)-乙磺酸)及40%乙醇溶液中在室溫下交聯1小時至3小時。隨後可藉由在pH為9.5之0.1 M Na2
HPO4
緩衝液中1小時至3小時培育原型兩次來終止反應。可藉由在1 M氯化鈉溶液中培育原型1小時，並在2 M氯化鈉溶液中1小時培育兩次來移除極性殘餘物。可在蒸餾水中洗滌經化學地交聯之原型30分鐘至60分鐘總共8次。可接著藉由浸沒在乙醇中15分鐘總共5次，繼之以5分鐘三次之二乙醚處理並接著在10 mbar及40℃下整夜乾燥，或藉由凍乾(在低於-5℃下冷凍並藉由習知凍乾處理進行乾燥)來進行乾燥。 或者，藉由在0.1 mbar至10 mbar下及80℃至160℃下脫水加熱處理(DHT) 1至4天來進行交聯。在此情況下，不需要後續乾燥方法。 可藉由以下進行步驟(b)： - 藉由以下製備膠原蛋白纖維膠： o 使用1500巴至2000巴之高壓均質機在pH為3.5、濃度為3%之H3
PO4
水溶液中混合以上膠原蛋白片段之經篩分碎片，重複彼混合若干次， o 藉由添加氫氧化鈉溶液將所得漿液中和至pH 7.0，藉由凍乾來濃縮膠原蛋白並藉由切碎機均質均質化後者， o 藉由加熱至60℃直至無其他可見顆粒，由所獲得之漿液製備pH為7.4之含2%至10%溶液之磷酸鹽緩衝鹽水PBS的膠原蛋白纖維膠，及 - 使用(例如)類似於圖2之設備的設備，使膠原蛋白材料之兩個預潤濕層經受拉緊，使得膠原蛋白材料在應力-應變曲線之線性區中拉伸，由此得到兩層潤濕彈性預拉緊膠原蛋白材料，將滲透有上述膠原蛋白纖維膠之在(a)中所獲得的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層插入上述兩層潤濕彈性預拉緊膠原蛋白材料之間；使用(例如)類似於圖3之設備的設備，將彼等兩層潤濕彈性預拉緊膠原蛋白材料壓靠滲透有膠原蛋白纖維膠之膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之彼複合層，並在35℃至45℃的溫度下在減壓下(例如，20 mbar至1 mbar)乾燥夾在兩層潤濕彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之該複合層。 在上文所描述之程序中，膠原蛋白材料之預潤濕層中之一者可已經針穿刺，以便包括5 µm至500 µm之孔。 在步驟(c)中，可使用化學製品(例如使用EDC及NHS)或藉由脫水加熱處理DHT來進行交聯夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的彼膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之複合層。 化學交聯可使用能夠向交聯形態穩定膜提供必需之機械強度的任何醫藥學上可接受之交聯劑來進行。合適的此類交聯劑包括：戊二醛、乙二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁二縮水甘油醚(BDDGE)、N-磺基丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯、二異氰酸己二酯(HMDC)、氰胺、二苯基磷醯基疊氮化物、京尼平、EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺)及EDC及NHS (N-羥基琥珀醯亞胺)之混合物。 使用化學製品之交聯宜使用EDC及NHS之混合物來進行。 在彼情況下，可使以上所得之纖維膠原蛋白材料及羥基磷灰石骨骼礦物質顆粒之乾燥複合層在pH 5.5之含10 mM 至400 mM EDC及13 mM至520 mM NHS的0.1 M MES (2-(N-嗎啉基)-乙磺酸)及40%乙醇溶液中在室溫下交聯1小時至3小時。隨後可藉由在pH為9.5之0.1 M Na2
HPO4
緩衝液中1小時至3小時培育原型兩次來終止反應。可藉由在1 M氯化鈉溶液中培育原型1小時，並在2 M氯化鈉溶液中1小時培育兩次來移除極性殘餘物。可在蒸餾水中洗滌經化學地交聯之原型30分鐘至60分鐘總共8次。可接著藉由浸沒在乙醇中15 min總共5次，繼之以實施二乙醚處理5分鐘三次，並隨後在10 mbar下及40℃下乾燥30分鐘；或藉由凍乾(在低於-10℃下冷凍並藉由習知凍乾處理進行乾燥)而不藉助溶劑處理來進行脫水及乾燥。 或者，藉由在0.1 mbar至10 mbar下及80℃至160℃下脫水加熱處理(DHT) 1至4天來進行交聯。在此情況下，不需要後續乾燥方法。 步驟c)之製造親水性之處理一般包含將夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之交聯複合層親水性地浸沒至生理學上可接受之鹽溶液中，諸如氯化鈉溶液，較佳地100 g/l至300 g/l，尤其150 g/l至250 g/l氯化鈉溶液。 較佳地，製造親水性之處理包含將夾在兩層彈性預拉緊膠原蛋白材料之間的膠原蛋白材料及無機陶瓷顆粒之交聯複合層親水性地浸沒至氯化鈉溶液中。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜可藉由X-射線、β-射線或γ輻射來除菌。 以下實例說明本發明，但不限制其範疇。實例 1
製備原材料製備大小為 250 µ m 至 400 µ m 之 羥基磷灰石精細顆粒 ( A )
如US-A-5417975之實例1至實例4中所描述，使用在250 µm與400 µm之間的額外篩分步驟由皮質骨或松質骨來產生羥基磷灰石骨礦物質精細顆粒。 或者藉由以下操作來產生羥基磷灰石骨礦物質精細顆粒：藉由使用衝擊槍謹慎地衝擊及250 µm與400 µm之間的額外篩分步驟來研磨Geistlich Bio-Oss® Small Granules (購自Geistlich Pharma AG, CH-6110, 瑞士)。 將上文所製備之具有250 µm至400 µm之大小之羥基磷灰石骨礦物質精細顆粒(A)儲存於玻璃瓶中，直至使用。製備膠原蛋白纖維 ( B )
如EP-B1-1676592之「實例」中所描述，藉由機械方法在流動水下洗滌並經2% NaOH溶液處理12小時，來自幼豬之腹膜完全不含肉及油脂。隨後在流動水下洗滌並用0.5% HCl酸化該等膜。酸化經由材料整個厚度後(持續約15分鐘)，用水洗滌材料直至獲得3.5之pH。隨後，用7%鹽水溶液收縮，用1% NaHCO3
溶液中和，並在流動水下洗滌材料。隨後，用丙酮脫水並用正己烷脫脂並使用乙醇乙醚乾燥材料。 如此獲得的膠原蛋白膜藉由手動用剪刀剪切成2 cm × 2 cm片。 或者，使用剪刀人工地剪切2 cm × 2 cm之Geistlich Bio-Gide®膜片塊(購自Geistlich Pharma AG)。 將以上所獲得之1 g 2 cm × 2 cm之膠原蛋白膜片塊與200 ml乾冰混合，並在5000 rpm下於切碎機(Retsch® Grindomix)中混合，直至不出現阻塞物。隨後將速度提高至6000 rpm、7000 rpm、9000 rpm及10,000持續20秒至30秒，每次添加50 ml乾冰。 汽化乾冰，並將因此獲得之膠原蛋白纖維(B)儲存於Minigrip塑料包裝中，直至進一步使用。製備剪切機膠原蛋白纖維片段 ( C )
在1500 rpm下、在帶有0.8 mm篩網之剪切機中剪切以上所獲得之2 cm × 2 cm之膠原蛋白纖維片塊，得到剪切機膠原蛋白纖維片段之經篩分碎片(C)。製備膠原蛋白纖維膠 ( D )
在水中混合剪切機膠原蛋白纖維片段之經篩分碎片(C)以獲得3%之溶液，藉由添加磷酸H3
PO4
將pH設定至3.5，並使懸浮液在1500巴至2000巴下高壓均勻化，將此重複3次至5次。 藉由添加氫氧化鈉溶液NaOH使所得漿液中和至約pH 7，並在4℃下整夜膠化。在-40℃下冷凍4小時之後，在-10℃下及0.310 mbar下藉由凍乾來濃縮膠原蛋白並藉由切碎機使其均勻化。 藉由加熱至60℃直至無其他可見顆粒，由所獲得之pH 7.4之含2%至10%溶液之磷酸鹽緩衝鹽水之漿液製備膠原蛋白纖維膠(D)。實例 2
製備視情況交聯之羥基磷灰石/膠原蛋白板(E) 將實例1中製備之4 g膠原蛋白纖維(B)及6 g剪切機膠原蛋白纖維片段(C)與140 g磷酸鹽緩衝鹽水混合並在混合液混合機中振盪。在另一實例中，膠原蛋白纖維完全由剪切機膠原蛋白纖維片段替代。 添加實例1中製備之20 g羥基磷灰石精細顆粒(A)並人工地混合。 在7000 g (7000倍重力加速度)下離心此34.14 g混合物2分鐘。 將離心塊倒入呈平坦矩形形態之8 cm × 12 cm的兩張聚醯胺網(孔徑為21 µm且敞形結構總共為17%)之間，並藉由用實驗匙移除多餘水來濃縮物質。在1 kPa至1.7 kPa之壓力下壓縮所獲得之板，並在30℃/50 mbar下在真空烘箱中乾燥2小時，隨後在30℃/10 mbar下乾燥8小時。移除聚醯胺網。視情況交聯羥基磷灰石膠原蛋白板
為便於處置羥基磷灰石膠原蛋白板，後者經化學地交聯或藉由脫水加熱處理(DHT)來交聯。 用EDC/NHS進行膠原蛋白之化學交聯，使得羥基磷灰石膠原蛋白板的整體穩定性提高。隨後，乾燥板在室溫下在pH為5.5的含10 mM至400 mM EDC及13 mM至520 mM NHS之0.1 M MES (2-(N-嗎啉基)-乙磺酸)及40%乙醇中交聯2小時。 藉由在pH為9.5的0.1 mol/l Na2
HPO4
緩衝液中一小時培育原型兩次來終止反應。可藉由在1 mol/l氯化鈉溶液中培育原型1小時，並在2 mol/l氯化鈉溶液中1小時培育兩次來移除極性殘餘物。可在蒸餾水中洗滌經化學地交聯之原型30分鐘至60分鐘總共8次，隨後藉由將其浸沒在乙醇中15分鐘總共5次來脫水。藉由進行5分鐘三次的二乙醚處理並接著在10 mbar及40℃下乾燥30分鐘，或藉由凍乾(在低於-10℃下冷凍並藉由習知凍乾處理乾燥)來接著進行乾燥處理。 或者，藉由在0.1 mbar至10 mbar下及80℃至120℃下脫水加熱處理(DHT) 1至4天來進行交聯。在此情況下，並不需要後續乾燥方法。實例 3
藉由在羥基磷灰石/膠原蛋白板(E)之兩個相反面上裝配並膠合兩層彈性預拉緊膠原蛋白層來製備可再吸收的交聯形態穩定膜(M) 藉由參考圖2及圖3將更好地理解以下描述。 平坦或U形原型之組裝需要使用能使膠原蛋白材料層拉緊之固定的或可彎曲的框架。形成平坦或 U 形 原型 ( F )
圖2為適用於在將膠原蛋白材料層裝配至本發明之平坦或U形形態穩定膜中之前能使其拉緊之設備之示意圖。 彼設備由框架(a)構成，該框架可由任何合適的材料(例如鋼或鋁)製成。框架之主要目的在於錨定拉緊兩個潤濕膠原蛋白層(c)之彈簧(b)。羥基磷灰石/膠原蛋白板(E)經定位於兩個膠原蛋白層(c)之間。 若需要U形可再吸收的交聯形態穩定膜，則使用用於彎曲膠原蛋白板(E)之負向模型(e)及帶有鉸鏈(f)之框架，因此獲得U形直線型原型。 藉由拉長或拉伸初始長度之40%至100%，經由拉緊每一彈簧2 N至3 N，使未除菌Geistlich Bio-Gide Collagen層之膠原蛋白材料層預拉緊，以便處於膠原蛋白材料之應力曲線之線性區中。在此線性區內，彈性模數最高且因此達成最高硬度。 由於膠原組織之黏彈本質，故使潤濕且拉緊之材料保持拉緊狀態大致30分鐘。由於預拉緊膠原蛋白膜之鬆弛，故彈簧再次拉緊1 N至3 N，以便處於膠原蛋白材料之應力曲線之線性區內。 使用剪切自未除菌Geistlich Bio-Gide®膠原蛋白膜之直徑為10 cm的兩個圓形膠原蛋白片塊，其中之一者經每平方公分包含軸直徑為0.88 mm之50根針的針筒穿孔。彼等兩個圓形膠原蛋白片塊經潤濕，並藉由12根每根拉緊至1 N至3 N的彈簧以徑向方式拉緊，使得膠原蛋白片塊自初始大小伸長40%至100%。 在完成此步驟後，即用膠原蛋白纖維膠(C)潤濕羥基磷灰石/膠原蛋白板(E)兩個面，並隨後將該羥基磷灰石/膠原蛋白板放置在兩個彈性預拉緊膠原蛋白層之間。需要中央桿(e)以及鉸鏈(f)以生產U形原型(參見下文)。將彈性預拉緊膜放置在加熱盤上，並預熱至40℃。 將在實例2中所獲得之交聯Bio-Oss板(E)短暫地浸沒在經預熱纖維膠(D)中，並放置在兩個彈性預拉緊膠原蛋白膜之間。 將聚醯胺網以及海綿(由聚胺脂製成，厚度為5 cm，密度大致為20 mg/cm3
至25 mg/cm3
，含有互聯微孔)放置在兩側上，壓縮50%至95%，使得壓縮應力高達120 kPa。 參見圖3，其呈現平坦形態穩定膜之組裝：其中，(1)為鋼板，(2)為經壓縮聚胺脂海綿，(3)為聚醯胺網，(4)為彈性預拉緊膠原蛋白層，且(5)為交聯羥基磷灰石膠原蛋白板。 隨後，在40℃下在真空烘箱中乾燥構築體，伴以氣壓在總共32小時內平穩地降至10毫巴。形成 U 形 原型
藉由在合適的負向模型上彎曲構築體，並用較薄聚胺脂海綿或不含纖維之紙巾來替換其中一個海綿，熟習此項技術者將輕易地調適圖2及圖3之裝置及上述方法以形成U形直線形或弧形原型。交聯平坦或 U 形 原型 ( G )
使用剪刀或小型環形鋸將平坦或U形原型(F)剪切成所需尺寸。隨後，原型經化學交聯或藉由脫水加熱處理(DHT)交聯。 在乙醇含量為40 Vol-%、EDC及NHS之濃度分別為10 mM至400 mM及13 mM至520 mM之pH為5.5的0.1 mol/L MES緩衝液中進行化學交聯。交聯溶液中之原型濃度為10%。為使交聯均勻，最初在真空(＜40 mbar)下處理板，且交聯反應在4℃下進行2小時，所有緩衝液經預冷卻至此溫度。 藉由在pH為9.5的0.1 mol/l Na2
HPO4
緩衝液中一小時培育原型兩次來終止反應。藉由在1 mol/l NaCl溶液中培育原型1小時並在2 mol/l NaCl溶液中1小時培育兩次來移除極性殘餘物。在蒸餾水中洗滌原型30分鐘至60分鐘總共8次。隨後藉由進行15分鐘5次之乙醇處理及5分鐘三次之二乙醚處理並隨後在10 mbar及40℃下整夜乾燥或直至產物完全乾燥，或藉由習知凍乾(在低於-10℃下冷凍並藉由習知凍乾處理乾燥)非藉由溶劑處理之產物來進行脫水及乾燥處理。 或者，藉由在0.1 mbar至10 mbar下在80℃至160℃下脫水加熱處理(DHT) 1至4天來進行交聯。在此情況下，並不需要後續乾燥方法。 將藉由上述方法所獲得之原型在鹽水或PBS中潤濕一小時或兩小時。為使得在10 min內潤濕，在蒸餾水中預潤濕原型大致1小時至2小時。此時，用上述針筒穿孔一側亦係可能的。藉由在200 g/l NaCl溶液中40 min培育原型三次來塗覆氯化鈉。如下所描述來沈澱氯化鈉(H)。乾燥交聯平坦或 U 形 原型 ( H )
藉由浸沒在乙醇中15分鐘總共5次來脫水經交聯原型。隨後，藉由溶劑乾燥(5分鐘三次之二乙醚處理，並在10毫巴及40℃下進行後續乾燥)，抑或藉由習知凍乾(在低於-10℃下冷凍並藉由習知凍乾處理來乾燥)來乾燥經交聯原型。 潤濕狀態下的不同原型之交聯形態穩定膜的厚度為自1.0 mm至2.0 mm，其大多數為自1.2 mm至1.8 mm。 經乾燥原型視情況可藉由27 kGy至33 kGy的x-射線輻射來除菌。實例 4
可再吸收的交聯形態穩定膜之特性 在實例3中獲得之可再吸收的交聯形態穩定膜的以下特徵經測定：(1)PBS中的可濕性，(2)機械強度，(3)使用來自溶組織芽胞梭菌
之膠原蛋白酶的酶降解，及(4)細胞黏附，(5)彈性預拉緊膠原蛋白材料層之伸長之量測值，(6)膠原蛋白羥基磷灰石板及最終原型之厚度的量測值。( 1 ) PBS 中的 可濕性
對於可再吸收的交聯形態穩定膜之不同原型而言，觀測到在PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)中完全潤濕的時間如以肉眼評定之在5分鐘至10分鐘之間，彼時間主要取決於在用乙醇脫水並乾燥之前用氯化鈉處理。( 2 ) 機械強度
藉由類似於EN ISO 178及ASTM D6272-10中描述之方法的3點單軸彎曲測試來評定本發明之膜的形態穩定性，本發明之膜浸沒在pH為7 .
4且溫度為37℃之PBS中。 此測試被視為非常有用，此係因為經設計以機械地穩定不含骨之缺損位點之每一形態穩定膜將受彎矩影響。因此，可將3點或4點彎曲用作表徵所用材料且額外地將(例如)具有不同厚度之不同產物進行比較之測試。對材料表徵而言，彎曲模數為最合適的參數。然而，為比較具有不同厚度的產物，8 mm至10 mm之壓痕後的最大力更為相關且因此用以表徵產物。 在所使用之3點單軸彎曲測試中，將標本剪切至50 mm × 13 mm之大小並在37℃下在PBS中培育，如肉眼觀測到直至完全潤濕。在具有每一支撐結構之跨度寬度為26 mm且半徑為5 mm之3點彎曲裝置中以每分鐘5 mm來實施機械測試。彎曲模組經計算，在1%及5%彎曲應變內。在減小8 mm與10 mm之間之中間壓痕後，讀出所得最大力。 對藉由EDC/NHS交聯之厚度為1.5 mm的本發明之膜，藉由DHT交聯之厚度為1.6 mm的本發明之膜，及來自KLS Martin之厚度為0.137 mm的PLA膜Resorb-X®進行測試。 圖4呈現力之變化隨彼等膜之應力變化而變化，其展示藉由EDC/NHS交聯(8 mm應變約0.65 N)或藉由DHT交聯(8 mm應變約0.40 N)之本發明之膜的機械穩定化實質上優於PLA膜Resorb-X® (8 mm應變約0.10 N)之機械穩定化。本發明之膜因此將更好地穩定不含骨之缺損位點。( 3 ) 使用自 溶組織芽胞梭菌 之酶降解測試
在人體中，膠原蛋白藉由人類組織基質金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶降解及假定地藉由部分絲胺酸蛋白酶降解。由於膠原酶為用於膠原蛋白直接降解最重要酶，故被研究得最多的是MMP (尤其MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18) (Lauer-Fields等人2002Matrix metalloproteinases and collagen catabolism
in Biopolymers - Peptide Science Section及Song等人2006Matrix metalloproteinase dependent and independent collagen degradation
in Frontiers in Bioscience)。 降解膠原蛋白組織及膜之膠原蛋白酶容量取決於受質可撓性及膠原蛋白類型、MMP活性位點及MMP外部位點。膠原酶在三螺旋膠原蛋白處對齊，解繞三螺旋膠原蛋白並隨後將其分解(Song等人2006，參見上文)。 為克服不同類型膠原蛋白降解之不同，常常使用具有較高催化速度之來自溶組織芽胞梭菌
之膠原蛋白酶來評定膠原蛋白之膠原蛋白酶降解(Kadler等人2007Collagen at a glance
in J Cell Sci)。一般而言，天然膠原蛋白產物比經化學交聯膠原蛋白產物降解更快。 在此測試中，在37℃下在含鈣參緩衝液中培育膠原蛋白產物(1 mg/ml膠原蛋白之可再吸收的交聯形態穩定膜的樣本)及50單位/毫升溶組織芽胞梭菌
(一個單位被定義為：在茚三酮顯色中，在37℃、pH為7.4、存在鈣離子的情況下，自牛踵肌腱等效物於5個小時內向1.0莫耳白胺酸釋出的肽)；採用肉眼及用來自Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA, 訂單號500-0116)之「DC Protein Assay」以I型膠原蛋白作為參考材料量測膠原蛋白基質之降解。使用微孔板光譜儀(Infinite M200，購自Tecan)來測定膠原蛋白濃度。 本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之所有原型展示，在4小時後，至少10%膠原蛋白降解(如使用I型膠原蛋白作為標準藉由DC Protein檢定評定)，膠原蛋白降解速率(低於Geistlich Bio-Gide®膜之速率)取決於所使用之交聯條件。( 4 ) 細胞黏附
藉由首次接種具有先前用螢光、親脂性染料標記之100,000個人類齒齦纖維母細胞之8 mm膜沖孔，在37℃下在PBS中培育24小時，藉由在PBS中洗滌膜來移除非黏附細胞，裂解黏附細胞並藉由在485 nm下之量測螢光來量化該等細胞來評定不同膜之細胞黏附。將螢光歸一化至標準曲線，該標準曲線以在裂解之前未經洗滌之經接種細胞之膜沖孔來建立。 形態穩定可再吸收的膜之所獲得之結果呈現在圖5中，圖5為水平方向呈現以百分比為單位的能黏附在不同類型的牙齒膜，本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜，及Cystoplast®PTFE膜(Keystone Dental)上的細胞%之柱狀圖。 圖5展示，黏附至本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜為約10.5%，此值比Cystoplast®PTFE膜(約4%)更加接近Geistlich Bio-Gide®膜(約13%)。Geistlich Bio-Gide®膜因其良好的癒合特性以低開裂率(Zitzmann, Naef等人1997；Tal, Kozlovsky等人2008)或無過度發炎(Jung, 2012)而為人熟知。人類齒齦纖維母細胞黏附至本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之量測值為在無不良情況(諸如過度發炎或開裂)下軟組織癒合的一種預示。( 5 ) 量測彈性預拉緊膠原蛋白材料層之伸長
為測定膠原蛋白層之拉緊量，使用尚未拉緊的彈簧(圖2，部分b)將乾燥膠原蛋白層安裝至拉緊環(圖2，部分a)。使用鉛筆或筆在膜的中間部位標記彼此間隔若干公分的至少4個點。使用尺子量測每一點之間的距離。所量測距離定義為每一點之間的初始長度。將膠原蛋白層浸沒在水中，並拉緊至所需力。在水中培育膠原蛋白層30分鐘。由於大多數膠原蛋白層之黏彈本質，故降低拉緊力。因此，膠原蛋白層需經再次拉緊。在培育30分鐘至40分鐘之後，用尺子測量每一點之間的距離。藉由由拉緊後之長度減去初始長度，除以初始長度，再乘以100來測定應變百分比。 對未除菌Geistlich Bio-Gide而言，處於應力-應變曲線之線性區中之典型結果為在40%與100%應變(伸長、延伸)之間。 藉由此方法量測之應變值與在單軸伸長測試中獲得之應變值並不直接相當。( 6 ) 量測膠原蛋白羥基磷灰石板及最終原型之厚度
如上文所描述或藉由使用滑動卡尺可量測最終原型或膠原蛋白/羥基磷灰石板「E」之厚度。( 7 ) 分析不同膠原蛋白層之機械特性 ( 圖 5 )
為比較不同來源的膠原蛋白層並評估其機械特性，使用標準單軸拉緊潤濕樣本。用於此分析方法之一般設定描述於ASTM D882-09「Standard Test Method for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting」中。由於所使用之膠原蛋白膜成本高，測試之若干參數可經調適。將樣本剪切為(例如)2 cm × 1 cm之矩形薄片，在等張磷酸鹽緩衝鹽水中預潤濕並安裝至每一樣本夾之間距離為1 cm之拉緊測試機。以每分鐘33%初始長度之恆定速度來拉緊樣本。將在100%初始長度下記錄之預力典型地設置成50 kPa。使用兩個樣本夾之間的距離來計算樣本之伸長。 因此，獲得圖5之應力-應變曲線。 儘管已在圖式及前述描述中詳細說明及描述本發明，但此類說明及描述應被視為說明性或例示性的而非限定性的：本發明不限於所揭示之實施例。 所揭示的實施例的其他變體可由熟習此項技術者自圖式、揭示內容及所修正之申請專利範圍的研究藉由實踐所要求的發明而理解並實現。 在申請專利範圍中，詞語「包含」並非排除其它元素；定冠詞「一(a/an)」並非排除複數。
1、1'‧‧‧平坦2、2'‧‧‧U形直線型3、3'‧‧‧U形弧形1‧‧‧鋼板2‧‧‧經壓縮聚胺脂海綿3‧‧‧聚醯胺網4‧‧‧彈性預拉緊膠原蛋白層5‧‧‧交聯羥基磷灰石膠原蛋白板
參看本發明之較佳實施例之說明性實例及隨附圖式在下文中將對本發明予以進一步詳細描述，圖式中： 圖1呈現根據本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之典型形狀及典型尺寸。彼等膜可為對應於定位於假牙前部或後部之左側側邊或右側側邊彎曲處之1顆至3顆牙齒(門牙、犬牙、前臼齒或臼齒)之牙槽腔之平坦的(1)、(1')，U形直線型的(2)、(2')或U形弧形的(3)、(3')。 前部產物之大小類似於後部產物之大小，彎曲半徑為符合牙槽脊之半徑。典型尺寸為：a = 5 nm至20 nm，b = 8 mm至20 mm，c = 6 mm至10 mm，d = 25 mm至40 mm，e = 15 mm，f = 20 mm至40 mm。 圖2為用於在將聚合物層裝配至本發明之平坦或U形形態穩定膜中之前能使聚合物層拉緊之設備之示意圖。 圖3呈現平坦形態穩定膜之組裝：其中，(1)為鋼板，(2)為經壓縮聚胺脂海綿，(3)為聚醯胺網，(4)為彈性預拉緊膠原蛋白層，且(5)為交聯羥基磷灰石膠原蛋白板。 圖4呈現相比於PLA膜Resorb-X® (KLS Martin)之藉由EDC/NHS或DHT交聯之本發明之可再吸收的形態穩定膜在3點彎曲分析測試中力隨應變而變化。 圖5呈現少許可商購的潤濕且無菌膠原蛋白材料之應力-應變曲線，可在根據本發明之可再吸收的交聯形態穩定膜之彈性預拉緊膠原蛋白材料層中使用該等材料，亦即源自豬腹膜之Geistlich Bio-Gide®膠原蛋白膜(Geistlich Pharma AG)、源自豬心包膜之Jason®膠原蛋白膜(aap Biomaterials/Botiss)及源自豬SIS之Dynamatrix®膠原蛋白膜(Cook Biotech Inc.)，以及源自肌肉筋膜之膠原蛋白材料之應力-應變曲線。在彼等應力曲線中之每一者中，存在由基於最小應力值之較大應變表徵之腳趾區、由每單位應力下應變線性升高表徵之線性或彈性區以及由聚合物纖維之斷裂表徵之失效區。在此圖中所呈現之應力-應變曲線中，Geistlich Bio-Gide®膜之彈性模數(或楊氏模數，亦即應力-應變曲線之線性區之斜率)為約8 MPa，Jason膜之彈性模數為約64 MPa，Dynamatrix®膜之彈性模數為約54 MPa，且源自肌肉筋膜之膠原蛋白材料之彈性模數為約56 MPa。 圖6為在PBS中在37℃下培育24小時後已黏附至膜之人類齒齦纖維母細胞%的柱狀圖，該等膜為Geistlich Bio-Gide®膠原蛋白膜，藉由DHT (FRM)交聯之本發明之可再吸收的形態穩定膜的原型及Cystoplast® PTFE膜(Keystone Dental)的柱狀圖。
