CN114295768A - 一种阿托伐他汀母核m4中10种杂质的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物合成工艺技术领域，具体涉及一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法。本发明采用高效液相色谱仪对测试样品阿托伐他汀母核M4溶液进行检测，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，采用DAD检测器多波长检测。本发明通过明确杂质的来源，建立了从原料到阿托伐他汀母核M4产品的检测方法，便于对阿托伐他汀母核M4整个合成过程的全线产品及杂质质量进行控制。本发明的检测方法通过采集各杂质临近自身最大吸收处波长下的色谱图，使不同杂质在该检测条件下达到自身最高的灵敏度，提高杂质的检测限，具有较高的灵敏度和精确度。

Description

一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法

技术领域

本发明属于药物合成工艺技术领域，具体涉及一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法。

背景技术

阿托伐他汀钙(ATv—Ca)是市场上销售最好的羟甲基戊二酰辅酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂，由美国Warner-Lambert公司(现与Pfizer公司合并)于1996年获FDA批准在美国上市，属于第三代他汀类药物。

阿托伐他汀母核M4是合成阿托伐他汀钙的一个母环中间体，分子式为C₂₆H₂₄FNO₃，化学名为(±)4-氟-α-[2-甲基-1-氧代丙基]-γ-氧代-N,β-二苯基苯丁酰胺，化学结构式如下：

阿托伐他汀母核M4的合成路线有多种，阿托伐他汀母核M4产品的质量直接影响着阿托伐他汀钙的质量。虽然，目前关于阿托伐他汀钙的质量控制的方法偏多，在USP、EP、JP等药典中均有记载(同时阿托伐他汀钙也收录在2020年的中国药典二部中)，但是对阿托伐他汀母核M4的质量控制和研究相对较少。

文献(李娜.高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙中间体M4中的有关物质[J].化工管理,2020(24):41-42.)公开了高效液相色谱法测定阿托伐他汀母核M4中的有关物质，重点研究了阿托伐他汀母核M4杂质A。同时，公开号为CN 112213424A的中国专利公开了一种阿托伐他汀钙中间体中共存杂质同时测定方法，所述母环M4共存杂质包括M1、M2、M3、以及M4双氟杂质、M4去氟。

然而，文献和专利中仅仅针对阿托伐他汀母核M4的共性杂质进行研究，本发明的发明人在长期的研发过程中，发现在制备阿托伐他汀母核M4的过程中，由于化学平衡的关系，总有少量原料残留，被带入到后续的反应步骤中，并会与后续反应中的原料或产品发生反应，导致在合成阿托伐他汀母核M4的过程中会产生很多杂质。

虽然现有技术中公开了阿托伐他汀母核M4合成过程中的大部分杂质以及检测方法，但是并没有针对具体的工艺路线制备母环阿托伐他汀母核M4时，产生的杂质(包括原料-苯胺和氟苯、中间产品-氨基物、M3、酰化物和溴化物、副产物-二苯基脲、二溴杂质、去氟物和双氟物)进行质量研究和含量控制。

因此，亟需提供一种科学有效的分析方法对阿托伐他汀母核M4中杂质(包括原料、中间产品及副产物杂质)进行检测和质控。

发明内容

本发明目的是解决现有技术中，在制备阿托伐他汀母核M4的过程中会产生多种杂质，且现有技术中并没有一种能够同时检测，并除去多种杂质的工艺方法的问题，提供一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定和去除方法，能够同时检测多种杂质，并能够实现品质控制。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法，包括如下步骤：

采用高效液相色谱仪在特定色谱检测条件分不同波长段对样品进行色谱分析，并记录色谱图，以外标法计算含量。

所述阿托伐他汀母核M4中10种杂质分别为苯胺、氨基物(4-甲基-3氧代-N-苯基戊酰胺)、二苯基脲、氟苯、酰化物(4-氟苯基)-2-苯基乙酮)、溴化物(2-溴-1-(4-氟苯基)-2-苯基乙酮)、M3(4-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(苯甲烯基)戊酰胺)、M4去氟(2-(1,2-双(4-氟苯基)-2-氧乙基)-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊胺)、M4双氟(4-甲基-3-氧代-2-(2-氧代-1,2-二苯基乙基)-N-苯基戊酰胺)、二溴化物(2,2-二溴-1-(4-氟苯基)-2-苯基乙烷-1-酮)；该10种杂质的来源为：苯胺、氟苯为原料残留，氨基物、酰化物、溴化物、M3为中间产物，二苯基脲为苯胺与异丁酰乙酸甲酯反应生成氨基物过程中产生的副产物，二溴杂质为酰化物与溴素反应生成溴化物过程中由于溴素过量而产生的杂质，去氟杂质为氟苯和苯乙酰氯反应生成酰化物中间产品过程中由氟苯中的杂质苯与苯乙酰氯反应生成的副产物参与后续反应而带入到母环M4中的杂质，双氟杂质则是M3与对氟苯甲醛反应产生的副产物参与后续反应进而带入到母环M4中的杂质。

具体的步骤如下：

(1)先分别配制阿托伐他汀母核M4中10种杂质的标准品溶液，再配制含有阿托伐他汀母核M4以及10种杂质的标准品溶液，然后配制阿托伐他汀母核M4测试样品溶液；

(2)采用高效液相色谱仪对阿托伐他汀母核M4测试样品溶液进行检测，所用的流动相为溶剂相与缓冲盐的混合溶液，，采用DAD检测器多波长检测，以外标法计算含量，其中色谱检测条件如下：

所用的色谱柱为反相色谱柱，流速为0.6～2.0ml/min；柱温为25℃～45℃，溶剂为乙腈、水、或者两者的混合液；进样量为10-20μl；检测波长：200nm～400nm。

进一步的，步骤(1)中苯胺标准品溶液的浓度为5.4μg/ml；氟苯标准品溶液的浓度为4.5μg/ml；二溴化物标准品溶液的浓度为30μg/ml。

进一步优选的，步骤(1)中各杂质标准品的工作浓度为：苯胺浓度：0.054μg/ml、氨基物浓度：3μg/ml、二苯基脲浓度：3μg/ml、氟苯浓度：0.045μg/ml、M3浓度：3μg/ml、酰化物浓度：3μg/ml、溴化物浓度：0.3μg/ml、去氟物浓度：3μg/ml、双氟物浓度：3μg/ml、二溴化物浓度为0.3μg/ml、M4浓度：3mg/ml。

进一步的，步骤(2)中所述反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，所述色谱柱的柱长为100mm～250mm，内径为1mm～10mm，粒径为1μm～10μm。

进一步的，步骤(2)中所述溶剂相为甲醇、乙腈、乙醇、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液，缓冲盐为磷酸二氢钠。

优选的，步骤(2)中所述的检测波长为氟苯：210nm；苯胺：232nm；其他物质：250nm，各杂质组分含量在各自检测波长下采用外标法进行计算。

优选的，步骤(2)中所述的流速为1.0ml/min。

优选的，步骤(2)中所述的柱温为40℃。

进一步优选的，步骤(2)中色谱检测条件如下：

色谱柱：Agilent C18 150mm×4.6mm×5μm；

检测器：DAD；检测波长：氟苯：210nm；苯胺:232nm；其他物质：250nm；

流动相为甲醇和pH3.0的磷酸二氢钠缓冲液；

溶剂为乙腈；样品浓度：1.5mg/ml；流速：1.0ml/min；

进样量：20μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的检测方法的适用范围广：通过明确杂质的来源，该10种杂质不仅有反应的起始物料，也有反应中间体及中间体副产物，还包含了最终阿托伐他汀母核M4的杂质，本发明首次建立了从原料到阿托伐他汀母核M4产品的检测方法，便于对阿托伐他汀母核M4整个合成过程的全线产品及杂质质量进行控制。

2、本发明的检测方法的灵敏度高：该10种杂质在紫外波长处的最大吸收有所不同，本发明采用DAD检测器，采集各杂质临近自身最大吸收处波长下的色谱图，使不同杂质在该检测条件下达到自身最高的灵敏度，提高杂质的检测限。

附图说明

图1是本发明实施例1系统适用性溶液(混合工作标准品溶液)的HPLC图谱；

图2是对比例1系统适用性溶液(混合工作标准品溶液)的HPLC图谱；

图3是对比例2系统适用性溶液(混合工作标准品溶液)的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本发明所使用的仪器和原料均市售获得，具体信息如下：

Agilent 1260高效液相色谱仪配置DAD检测器，CDS2.4操作软件；

METTLER TOLEDO XDR226DR/A电子天平；

METTLER TOLEDO S470-B型多参数测定仪；

阿托伐他汀母核M4工作标准品(批号为3-LXM-171-1)，由TRC提供；

阿托伐他汀母核M4供试品(批号：201101、201102、201103)，自制；

已知杂质苯胺工作标准品来源：Sigma-aldrich；

二苯基脲工作标准品来源：自制；

氟苯工作标准品来源：Sigma-aldrich；

酰化物工作标准品来源：自制；

M3工作标准品来源：自制；

去氟杂质工作标准品来源：自制；

双氟杂质工作标准品来源：自制；

乙腈来源于TEDIA；

磷酸二氢钠来源于天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯化水来源于杭州娃哈哈集团有限公司。

实施例1

一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法，所述10种杂质为苯胺、氨基物、二苯基脲、氟苯、酰化物、溴化物、M3、M4去氟、M4双氟、二溴化物。阿托伐他汀母核M4中10种杂质的结构式如表1所示。

表1

检测方法具体步骤如下：

一、配样：

1、标准品溶液配制：

(1)苯胺工作标准品溶液

准确称取54mg苯胺于100ml已盛适量稀释液的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，取上述溶液1ml于100ml已盛适量稀释液的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀。(浓度：5.4μg/ml，临用新配)。(2)氟苯工作标准品溶液

准确称取45mg氟苯于100ml已盛适量稀释液的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀，取上述溶液1ml于100ml已盛适量稀释液的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀。(浓度：4.5μg/ml，临用新配)。

(3)溴化物工作标准品溶液

准确称取60mg溴化物和二溴化物于20ml容量瓶中，加适量乙腈溶解后，再用稀释液稀释至刻度，混匀，取上述溶液1ml于100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，混匀。(浓度：30μg/ml，临用新配)。

(4)氨基物工作标准品溶液

准确称取氨基物、酰化物、M3、二苯基脲、去氟杂质、双氟杂质各60mg于20ml容量瓶中，加适量乙腈溶解后，再用稀释液稀释并定容至刻度，混匀，取上述溶液1ml于10ml容量瓶中，用稀释液稀释并定容至刻度，混匀。(浓度：300μg/ml，临用新配)。

将制备得到的(1)、(2)(3)、(4)工作标准品溶液按一定梯度进行稀释，然后分别进行液相色谱测定，获得谱图，测量并记录色谱峰的峰面积，采用外标法以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算获得10个杂质标准品的线性方程，见下表2。

表2

组分名称	浓度范围(μg/ml)	线性方程	相关系数
				苯胺	0.016～0.0812	y＝15.66x+1.18	0.9992
氨基物	0.024～4.5075	y＝62.13x-3.13	0.9994
				二苯基脲	0.004～4.5225	y＝144.60x+14.50	0.9952
氟苯	0.021～0.121	y＝22.56x+0.13	0.9919
				M3	0.014～4.530	y＝52.11x+7.23	0.9913
酰化物	0.013～4.5075	y＝58.64x+7.54	0.9924
				溴化物	0.040～0.45375	y＝38.54x+7.61	0.9997
去氟杂质	0.023～4.515	y＝81.11x+3.58	0.9990
				M4	0.018～4524	y＝62.89x+288.42	0.9999
双氟杂质	0.021～4.5225	y＝54.05x+6.75	0.9948
				二溴杂质	0.025～0.45375	y＝27.66x+1.43	0.9997

(5)系统适用性溶液(混合工作标准品溶液)

准确称取300mg阿托伐他汀母核M4工作标准品于100ml容量瓶中，加适量乙腈溶解后，然后再分别移取上述(1)、(2)、(3)、(4)工作标准品溶液各1ml于上述100ml容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，超声混合均匀。

工作浓度：苯胺浓度：0.054μg/ml、氨基物浓度：3μg/ml、二苯基脲浓度：3μg/ml、氟苯浓度：0.045μg/ml、M3浓度：3μg/ml、酰化物浓度：3μg/ml、溴化物浓度：0.3μg/ml、去氟物浓度：3μg/ml、双氟物浓度：3μg/ml、二溴化物浓度为0.3μg/ml、M4浓度：3mg/ml，临用新配。

2、供试品溶液配制：

取阿托伐他汀母核M4供试品约300mg于100ml容量瓶中，加少量乙腈溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀得供试品溶液(浓度：3mg/ml)。

以上使用的稀释液为体积比为60:40的甲醇：磷酸二氢钠缓冲液(pH3.0)；

二、检测：

1、采用高效液相色谱仪对步骤一中的溶液进行检测，其中色谱检测条件如下：

色谱柱：Agilent C18 150mm×4.6mm×5μm或等同；

检测器：DAD；检测波长：氟苯：210nm；苯胺:232nm；其他物质：250nm；

流动相：A:甲醇；B:磷酸二氢钠缓冲液(磷酸调pH3.0)；

稀释液：甲醇：磷酸二氢钠缓冲液＝60:40(V/V)；

溶剂：乙腈；样品浓度：1.5mg/ml；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；

进样量：20μl；运行模式：梯度洗脱；运行时长：45min；

梯度程序：

表3

时间/min	流动相A	流动相B
			0	60	40
27	60	40
			29	70	30
40	70	30
			43	60	40
45	60	40

2、检测结果及分析：

取阿托伐他汀母核M4样品三批，按上述溶液制备方法配置及检测，按外标法(带入线性方程)经换算，计算各有关物质的含量，结果见表4。以信噪比S/N≈3为检测限(LOD)，信噪比S/N≈10为定量限(LOQ)。

表4

批号	201101	201102	201103
				苯胺	<LOQ	<LOQ	<LOQ
氨基物	N.D.	N.D.	N.D.
				二苯基脲	<LOQ	<LOQ	<LOQ
氟苯	N.D.	N.D.	N.D.
				M3	N.D.	N.D.	N.D.
酰化物	<LOQ	<LOQ	<LOQ
				溴化物	0.077％	0.068％	0.072％
去氟杂质	0.029％	0.034％	0.034％
				双氟杂质	N.D.	N.D.	N.D.
二溴杂质	N.D.	N.D.	N.D.

结果表明，主成分M4及各有关物质之间分离效果良好。

(1)方法专属性试验

分别配置溶剂(乙腈)、各杂质定位溶液及阿托伐他汀母核M4加杂质的专属性混合溶液(1.5mg/ml M4+0.0018％苯胺+0.1％氨基物+0.1％二苯基脲+0.0015％氟苯+0.1％M3+0.1％酰化物+0.01％溴化物+0.1％去氟杂质+0.1％双氟杂质+0.01％二溴杂质，以上百分比为质量分数)；分别精密量取上述溶液各20μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1所示。

实验结果表明：①溶剂不干扰阿托伐他汀母核M4有关物质检测；②专属性混合溶液中各有关物质与定位溶液保留时间一致；③专属性混合溶液中各有关物质及主成分之间分离度良好。

(2)检测限与定量限试验

以信噪比S/N≈3为检测限(LOD)，信噪比S/N≈10为定量限(LOQ)，阿托伐他汀母核M4及其10种杂质的LOQ和LOD见下表5。

表5

各组分的LOD和LOQ均小于10％。

(3)线性与范围试验

取阿托伐他汀母核M4及其10种杂质，加适量乙腈溶解，并用稀释液稀释制成混合溶液作为线性贮备液(相当于对照浓度的100倍)，并保证混合溶液中苯胺的浓度为：5.4μg/ml；溴化物和二溴杂质的浓度为：30μg/ml；其余杂质的浓度为：300μg/ml；然后再依次稀释成相当于LOQ对照浓度的30％、50％、80％、100％、120％、150％溶液，分别进样20μl。以质量浓度c(μg/ml)为横坐标，各组分峰面积A为纵坐标，进行线性回归，各组分回归方程见下表6。

表6

组分名称	浓度范围(μg/ml)	线性方程	相关系数
				苯胺	0.016～0.0812	y＝15.66x+1.18	0.9992
氨基物	0.024～4.5075	y＝62.13x-3.13	0.9994
				二苯基脲	0.004～4.5225	y＝144.60x+14.50	0.9952
氟苯	0.021～0.121	y＝22.56x+0.13	0.9919
				M3	0.014～4.530	y＝52.11x+7.23	0.9913
酰化物	0.013～4.5075	y＝58.64x+7.54	0.9924
				溴化物	0.040～0.45375	y＝38.54x+7.61	0.9997
去氟杂质	0.023～4.515	y＝81.11x+3.58	0.9990
				M4	0.018～4524	y＝62.89x+288.42	0.9999
双氟杂质	0.021～4.5225	y＝54.05x+6.75	0.9948
				二溴杂质	0.025～0.45375	y＝27.66x+1.43	0.9997

各组分的相关系数均大于0.990，主成分M4的相关系数为0.9999(≥0.9990)，本发明检测方法的线性关系良好。

(4)精密度试验

取线性与范围试验中的100％溶液，按上述测定方法，精密量取20μl，注入液相色谱仪，连续进样6针。以峰面积计算，10个杂质组分的RSD(相对标准偏差)分别为1.09％、0.14％、0.06％、7.31％、0.18％、0.24％、0.46％、0.35％、1.14％、3.10％，均小于10％。说明本发明检测方法的精密度良好。

(5)准确度试验

取取阿托伐他汀母核M4样品10份每份30mg，精密加入各杂质混合溶液(50％、100％、150％各三份，不加样1份)，分别置10ml量瓶中，加适量乙腈溶解，并用稀释液稀释至刻度，作为回收率供试品溶液，另制备100％杂质混合对照溶液2份，按外标法进行回收率测定，结果见下表7。

表7

组分名称	平均回收率	RSD
			苯胺	96.13％	5.88％
氨基物	98.98％	2.25％
			二苯基脲	99.40％	0.94％
氟苯	90.96％	0.87％
			M3	92.28％	0.66％
酰化物	93.40％	0.98％
			溴化物	106.65％	3.74％
去氟杂质	94.62％	1.70％
			双氟杂质	93.96％	3.69％
二溴杂质	90.44％	1.44％

从表中可以看出，各杂质的平均回收率在90.44％～106.65％之间，说明本发明的方法准确度良好。

阿托伐他汀钙母核M4中上述杂质可以根据杂质自身的物理化学性质分别采取不同的去除方法进行去除：(1)液体杂质采用蒸馏或精馏的方法进行去除；(2)固体杂质或中间产物采用合适的溶剂(如甲醇、乙醇、二氯甲烷、异丙醇、乙醚或以上溶剂中的一种或多种混合)重结晶进行去除。

对比例1

一种阿托伐他汀钙母核M4中10种杂质的测定方法，所述10种杂质为苯胺、氨基物、二苯基脲、氟苯、酰化物、溴化物、M3、去氟杂质、双氟杂质、二溴杂质；其中检测方法与实施例1基本相同，其区别在于，色谱检测条件不同，具体如下：

色谱柱：Kromasil C18 250mm×4.6mm×5μm或等同；

流动相：乙腈：水(磷酸调pH4.0)＝55:45；检测器：DAD；

检测波长：氟苯：210nm；苯胺：232nm；其他组分：250nm；

稀释液：乙腈：水＝55:45(V/V)；样品浓度：1mg/ml；流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；进样量：20μl；运行模式：梯度；运行时长：60min。

记录色谱图，结果如图2所示。

检测结果：溴化物和去氟杂质不能有效分离。

对比例2

一种阿托伐他汀钙母核M4中10种杂质的测定方法，所述10种杂质为苯胺、氨基物、二苯基脲、氟苯、酰化物、溴化物、M3、去氟杂质、双氟杂质、二溴杂质；其中检测方法与实施例1基本相同，其区别在于，色谱检测条件不同，具体如下：

色谱柱：Luna PFP(2)；150mm×4.6mm×3μm或等同；

检测器：DAD；检测波长：氟苯：210nm；苯胺：232nm；其他组分：250nm；

流动相A：乙腈：THF＝95:5；流动相B：醋酸铵缓冲液(0.01M醋酸铵，用醋酸调节pH3.5)；

稀释液：乙腈：水＝65:35(V/V)；样品浓度：0.4mg/ml；流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；进样量：20μl；运行模式：梯度；运行时长：60min；

梯度程序：

表8

时间/min	流动相A	流动相B
			0	35	65
30	68	32
			42	69	31
45	80	20
			47	35	65

记录色谱图，结果如图3所示。检测结果：(1)溴化物和去氟杂质不能有效分离出峰时间重叠，不能有效分离；(2)在210nm波长条件下基线不稳；(3)在该色谱条件下，各色谱峰响应不高，灵敏度偏低。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种阿托伐他汀母核M4中10种杂质的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制含有阿托伐他汀母核M4中10种杂质的标准品溶液，配制测试样品阿托伐他汀母核M4溶液；

（2）采用高效液相色谱仪对阿托伐他汀母核M4测试样品溶液进行检测，所用的流动相为溶剂相与缓冲盐的混合溶液，采用DAD检测器多波长检测，以外标法计算含量，其中色谱检测条件如下：

所用的色谱柱为反相色谱柱，流速为0.6~2.0ml/min；柱温为25℃~ 45℃，溶剂为乙腈、水、或者两者的混合液；进样量为10-20μl；检测波长：200nm~400nm；

所述阿托伐他汀母核M4中10种杂质分别为苯胺、4-甲基-3氧代-N-苯基戊酰胺、二苯基脲、氟苯、4-氟苯基）-2-苯基乙酮、2-溴-1-（4-氟苯基）-2-苯基乙酮、4-甲基-3-氧代-N-苯基-2-（苯甲烯基）戊酰胺、2-（1,2-双（4-氟苯基）-2-氧乙基）-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊胺、4-甲基-3-氧代-2-（2-氧代-1,2-二苯基乙基）-N-苯基戊酰胺、2,2-二溴-1-（4-氟苯基）-2-苯基乙烷-1-酮。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中所述反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中所述溶剂相为甲醇、乙腈、乙醇、甲醇-水混合液或乙腈-水混合液，缓冲盐为磷酸二氢钠。

4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中所述的检测波长为氟苯：210nm；苯胺：232nm；其他物质：250nm；步骤（2）中所述的流速为1.0ml/min；步骤（2）中所述的柱温为40℃。

5.如权利要求3或4所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中色谱检测条件如下：

色谱柱：Agilent C18 150mm×4.6mm×5µm；检测器：DAD；流动相为甲醇和 pH3.0的磷酸二氢钠缓冲液；溶剂为乙腈；样品浓度：1.5mg/ml；流速：1.0ml/min；进样量：20µl。

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