CN114295702B - 一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法。本发明的方法包括如下步骤：步骤1，将食品样品制成供试品溶液；步骤2，采用毛细管电泳法对供试品溶液中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV进行检测；其中，毛细管电泳法的条件如下：毛细管柱为无涂层石英毛细管柱，运行缓冲液为2‑30mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。本发明的方法能够简单、快速、低成本地准确检测食品样品中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV，且具有很好的灵敏度，因此在食品安全检测中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法。
背景技术
天然辣椒红素等在暴露于光后容易褪色，而苏丹染料是一种合成染料，化学性质稳定，对光不敏感。因此，为了使辣椒粉等食品长期保持红色，不法商人常常在这些食品中添加苏丹。研究表明，进入动物的苏丹染料可以被代谢成相应的胺，这些胺具有潜在的致癌性和致突变性。长期食用含有苏丹的食物会引起肝脏DNA结构的变化，并引起肝癌和其他疾病。1995年，欧洲联盟禁止在食品中添加苏丹染料作为佐剂。1996年我国食品添加剂使用卫生标准也规定，食品生产中禁止使用苏丹。
苏丹染料(苏丹红)是化学合成的红色亲脂性偶氮染料，主要包括苏丹I(1-苯基偶氮-2-萘酚)、苏丹II(1-[(2,4-二甲基苯)偶氮]-2-萘酚)、苏丹III(1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮-2-萘酚)和苏丹IV(1-2-甲基-4-[(2-甲基苯)偶氮]苯基偶氮-2-萘酚)。四种苏丹染料具有相似的分子结构、极性和化学性质。因此，要从食品样品中分离出四种苏丹染料进行检测具有较大的难度。
现有技术中，检测食品中苏丹染料的方法主要有液相色谱法和液相色谱-质谱法等。中国法定标准为国家标准GB/T 19681-2005《食品高效液相色谱法中苏丹红的测定方法》。这种方法费时费力，因此有必要创造一种方便快捷的测量方法。
毛细管电泳在测试时间、实验成本和消耗方面具有很大优势。然而，由于四种苏丹染料性质非常接近，因而，采用常规的实验条件难以将四种苏丹染料进行分离和检测。文献“高效毛细管电泳法同时分离测定苏丹红Ⅰ、Ⅱ号”(DOI：10.3969/j.issn.1008-0805.2010.09.109)中公开了一种利用毛细管电泳法进行苏丹检测的方法，其缓冲液为水溶液，且采用的检测样品为苏丹I和苏丹II的标准溶液。然而，发明人进行实验后发现，采用该文献的方法对辣椒粉进行检测，无法对样品中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV进行有效分离。可见，由于样品的化学组成复杂，且四种苏丹染料本身的结构和性质接近，现有的毛细管电泳法难以实现食品样品的苏丹染料含量分析。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法，目的在于对食品样品中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV的含量进行检测。
一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法，包括如下步骤：
步骤1，将食品样品制成供试品溶液；
步骤2，采用毛细管电泳法对供试品溶液中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV进行检测；
其中，毛细管电泳法的条件如下：
毛细管柱为无涂层石英毛细管柱，运行缓冲液为2-30mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
优选的，所述食品为辣椒粉。
优选的，步骤1中，供试品溶液的制备方法为：将食品样品溶解于2-30mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液，超声，分离液体，即得。
优选的，步骤1中，所述食品样品溶解于15mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
优选的，步骤1中，所述分离液体的方法为离心，取上清液过滤膜。
优选的，步骤1中，所述分离液体的方法为8000r/min离心5min，上清液过0.22μm滤膜。
优选的，步骤2中，毛细管柱的内径为25-75μm，有效长度为30-85cm；和/或，所述运行缓冲液为15mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
优选的，步骤2中，毛细管电泳法的条件还包括：
施加电压为15-30kV；和/或，苏丹I的检测波长为478nm，苏丹II、苏丹III和苏丹IV的检测波长为520nm；和/或，压力进样，250毫巴·秒；和/或，毛细管柱的温度为10-30℃。
优选的，步骤2中，毛细管电泳法的条件还包括：
施加电压为30kV；和/或，压力进样，50毫巴进样5秒；和/或，毛细管柱的温度为15℃。
优选的，步骤2中，通过标准曲线法计算得到食品样品中苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV的含量。
本发明优化了毛细管电泳法检测食品中苏丹染料的方法，通过选择特定的检测条件，优选样品制备方法，能够将苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV从食品样品中分离出来并进行检测。且本发明的检测方法具有很好的灵敏度。因此，本发明在食品安全检测中具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中检测加标辣椒粉样品中苏丹染料的样品加标回收图；
图2为实施例1中检测混合对照品中苏丹染料的毛细管电泳色谱图；
图3为实验例1中苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV的紫外吸收光谱图；
图4为实验例1中苏丹染料溶于甲醇并用30mmol/L Tris缓冲溶液作为缓冲溶液的毛细管电泳色谱图；
图5为实验例1中添加剂选择15mmoL/L醋酸铵的毛细管电泳色谱图；
图6为实验例1中添加剂选择15mmoL/L NaOH的毛细管电泳色谱图；
图7为实验例1中添加剂选择15mmoL/L氢氧化铵的毛细管电泳色谱图；
图8为实验例1中添加剂选择15mmoL/L氯化铵的毛细管电泳色谱图；
图9为实验例1中添加剂选择15mmoL/L三乙胺的毛细管电泳色谱图；
图10为实验例1中添加剂选择15mmoL/L四丁基氢氧化铵的毛细管电泳色谱图；
图11为实验例1中有机溶剂选择甲醇的毛细管电泳色谱图；
图12为实验例1中有机溶剂选择乙酰胺的毛细管电泳色谱图；
图13为实验例1中有机溶剂选择N,N-二甲基甲酰胺的毛细管电泳色谱图；
图14为实验例1中有机溶剂选择乙醇的毛细管电泳色谱图；
图15为实验例1中有机溶剂选择二甲亚砜的毛细管电泳色谱图；
图16为实验例1中四甲基氢氧化铵甲醇溶液用氨水调节pH＝10的毛细管电泳色谱图；
图17为实验例1中四甲基氢氧化铵甲醇溶液用盐酸调节PH＝1的毛细管电泳色谱图；
图18为实验例1中2mmoL/L四甲基氢氧化铵甲醇溶液的毛细管电泳色谱图；
图19为实验例1中8mmoL/L四甲基氢氧化铵甲醇溶液的毛细管电泳色谱图；
图20为实验例1中15mmoL/L四甲基氢氧化铵甲醇溶液的毛细管电泳色谱图；
图21为实验例1中30mmoL/L四甲基氢氧化铵甲醇溶液的毛细管电泳色谱图。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。
实施例1辣椒粉中苏丹染料的检测
1、材料和化学品
标准品苏丹I(99.0％)、苏丹II(87.0％)、苏丹III(98.0％)和苏丹IV(94.0％)均购自Dr.EhrenstorferGmbh。甲醇(色谱纯，购自德国默克集团)。实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水仪制备)，其余试剂为分析纯。
2、仪器设备
HP 3DCE毛细管电泳仪(配备二极管阵列检测仪，美国惠普公司)；毛细管为50μm×50cm(至检测器42cm)无涂层熔融石英毛细管(中国河北永年光纤厂)；数据采集工作站是HPChemStation System(惠普公司)；TGL-16M高速台式冷冻离心机(中国长沙)；KudosSKS250H超声波清洗机(上海Kudos超声波仪器有限公司，中国)。
3、检测步骤
3.1参比溶液的制备：
取苏丹Ⅰ～Ⅳ对照品约10mg，准确称量，置于10mL容量瓶中，加适量氯仿溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精确移取上述溶液1mL至50mL容量瓶中，用15mmol/L TMAH甲醇溶液定容，摇匀即得标准储备液。
3.2供试品溶液制备
称取辣椒粉1g，置于25mL比色管中。加入15mmol/L四甲基氢氧化铵(TMAH)甲醇溶液10mL，用150W和40kHz的频率超声处理15分钟。冷却后，8000r/min离心5min，上清液过0.22μm滤膜，即得。
3.3毛细管法检测
毛细管法检测检测条件如下：无涂层石英毛细管柱(内径50μm，总长50cm，有效长度42cm)；施加电压为30kV，测量波长为苏丹I 478nm、苏丹II、苏丹III、苏丹IV 520nm；压力进样(50毫巴进样5秒)；毛细管柱的温度保持在15℃；运行缓冲液为15mmol/L四甲基氢氧化铵(TMAH)甲醇溶液；在每次实验之前，毛细管用0.1M NaOH冲洗2分钟，用水冲洗2分钟，然后用缓冲液冲洗5分钟。
按照本实施例的方法检测加标辣椒粉样品得到的毛细管电泳色谱图如图1所示，苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV(各20μg/mL)混合对照品的毛细管电泳色谱图如图2所示，从图中可以看到，苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV的色谱峰之间以及它们与辣椒粉样品中的其他成分峰之间的分离度良好，能够实现四种成分的准确检测。
下面通过实验例对本发明的技术方案作进一步说明。实验例中未具体说明的实验条件均与实施例1相同。
实验例1条件筛选实验
本实验例对各检测条件进行筛选实验。
1、检测波长选择
本实验采用二极管阵列检测器进行波长扫描。实验条件下苏丹Ⅰ的最大吸收波长为478nm，苏丹Ⅱ～Ⅳ的最大吸收波长均在520nm左右(见图3)。因此，选择478nm作为苏丹I的检测波长，选择520nm作为苏丹II～IV的检测波长。
2、缓冲溶液选择
使用了常用的Tris缓冲系统(文献：DOI：10.3969/j.issn.1008-0805.2010.09.109)、磷酸盐缓冲体系和硼酸盐缓冲体系，均无法检测到苏丹红。其中用Tris缓冲系统的毛细管电泳色谱图如图4所示。
3、添加剂选择
本实验中，在缓冲液中分别添加常见的电解质，如醋酸铵(图5)、氢氧化钠(图6)、氢氧化铵(图7)、氯化铵(图8)、三乙胺(图9)、四丁基氢氧化铵(图10)、醋酸、甲酸、四甲基氢氧化铵(TMAH，图11)等，并通过非水毛细管电泳来分离苏丹红。将上述电解液分别配置为浓度为15mmol/L的甲醇溶液的电泳缓冲液，进行电泳分离。结果表明TMAH是最好的。
4、有机溶剂的选择
本实验使用了一些非水毛细管电泳中最常用的有机介质，如甲醇(图11)、乙腈、乙酰胺(图12)、N,N-二甲基甲酰胺(图13)、乙醇(图14)、二甲亚砜(图15)、四氢呋喃、乙酸乙酯和氯仿作为非水毛细管电泳中的缓冲介质。其中，TMAH在乙酸乙酯、氯仿或乙腈中的溶解性不好，不能进行非水毛细管电泳。结果表明，苏丹染料在甲醇介质中的分离效果最好。
5、pH选择
取15mmol/L TMAH甲醇溶液3份，一份用氢氧化铵调pH＝10(图16)，一份用盐酸调pH至1(图17)，另一份不调pH(图2)。然后在上述条件下进行非水毛细管电泳。结果表明，苏丹红在不调节pH的缓冲液中分离效果最好。
6、添加剂浓度的影响
本实验采用2mmol/L(图18)、8mmol/L(图19)、15mmol/L(图20)、30mmol/L(图21)TMAH甲醇溶液作为分离缓冲液分离苏丹红。随着缓冲液浓度的增加，苏丹染料的保留时间会延迟。15mmol/L时效果更佳。
实验例2方法验证
本实验例分别从线性、特异性、精密度、准确度、LOD和LOQ方面进行了验证。LOD和LOQ分别在信噪比为3和10时测定。苏丹I、III、IV的峰面积与浓度在0.25-5μg/mL的范围内呈线性关系，苏丹II的峰面积与浓度在0.5-10μg/mL呈线性关系，它们的相关系数在0.9990-0.9996的范围内。辣椒粉中苏丹红的回收率在89.2-97.3％的范围内。苏丹红的日内和日间精密度是通过在同一天和连续三天内重复进样六次样品溶液来确定的。结果总结在下表中。
从表中数据可以看到，本发明的方法线性好，精度度高，能够满足准确检测苏丹染料的要求。
实验例3本发明方法与高效液相色谱法的比较
本实验例对比了高效液相色谱法(GB/T19681-2005，食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法[S].国家质量监督检验检疫总局，2005.)和非水毛细管电泳法测定苏丹红所需的时间和试剂用量，结果如下表所示。
从表中可以看到，本发明所用的试剂量和试验时间远少于现有技术中所用的高效液相色谱法。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明针对苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV提供了一种非水毛细管电泳法检测食品样品的方法。本发明的方法前处理简单，分析时间短，有机溶剂少，苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV能够完全分离，检出限分别为0.075μg/mL、0.15μg/mL、0.075μg/mL、0.075μg/mL。该方法的方法学指标符合质量控制规范，提高了检测效率。因而，本发明在食品安全检测中具有很好的应用前景。
Claims (10)
1.一种非水毛细管电泳法测定苏丹染料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将食品样品制成供试品溶液；
步骤2，采用毛细管电泳法对供试品溶液中的苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV进行检测；
其中，毛细管电泳法的条件如下：
毛细管柱为无涂层石英毛细管柱，运行缓冲液为2-30mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述食品为辣椒粉。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，供试品溶液的制备方法为：将食品样品溶解于2-30mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液，超声，分离液体，即得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述食品样品溶解于15mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
5.按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述分离液体的方法为离心，取上清液过滤膜。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述分离液体的方法为8000r/min离心5min，上清液过0.22μm滤膜。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中，毛细管柱的内径为25-75μm，有效长度为30-85cm；和/或，所述运行缓冲液为15mmol/L四甲基氢氧化铵的甲醇溶液。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中，毛细管电泳法的条件还包括：
施加电压为15-30kV；和/或，苏丹I的检测波长为478nm，苏丹II、苏丹III和苏丹IV的检测波长为520nm；和/或，压力进样，250毫巴·秒；和/或，毛细管柱的温度为10-30℃。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2中，毛细管电泳法的条件还包括：
施加电压为30kV；和/或，压力进样，50毫巴进样5秒；和/或，毛细管柱的温度为15℃。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中，通过标准曲线法计算得到食品样品中苏丹I、苏丹II、苏丹III和苏丹IV的含量。
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