CN114292751A - 一种器官芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于组织工程技术领域，尤其涉及一种器官芯片及其应用。本申请第一方面提供了一种器官芯片包括：第一功能层、第二功能层、第三功能层和第四功能层；所述第一功能层、所述第二功能层、所述第三功能层和所述第四功能层由上到下依次组合。本申请提出了一种基于器官芯片，可用于模拟病毒通过空气进入人体内后在人体内传播和作用模型的建立方法，通过结合模拟体内循环应变(即蠕动样运动)等模拟正常或患病器官水平的结构和功能，可以更好地模拟病毒进入人体后在人体内的传播及作用。

Description

一种器官芯片及其应用

技术领域

本申请属于组织工程技术领域，尤其涉及一种器官芯片及其应用。

背景技术

甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和现在的SARS-CoV-2等流行病毒的发病率一直居高不下，为了降低它们的发病率，其中一种方法是开发新的用来模拟病毒在人体内扩散及作用的人体体外模型来加速发展有效的治疗方法和预防方法。而现有的体外模型主要是体外细胞培养和动物模型。但由于普通的体外细胞模型无法准确的模拟人体内的流体、营养物、免疫细胞和其他调节因子的关键运输和对活器官的发育和功能至关重要的动态机械力，由于常用的实验动物(例如，小鼠、大鼠)是专用鼻呼吸器，它们肺部的解剖结构、免疫系统和炎症反应与人类有很大不同，且在动物模型上得到的结果并不能准确的在人体内得到验证，这两种模型都存在着局限性。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种器官芯片及其应用，可模拟病毒经过鼻腔和气管到达肺部后经过肺泡到达微血管再到达全身其他器官的过程。

本申请第一方面提供了一种器官芯片包括：第一功能层、第二功能层、第三功能层和第四功能层；所述第一功能层、所述第二功能层、所述第三功能层和所述第四功能层由上到下依次组合；

所述第一功能层包括第一基底1、类圆形凹槽、以及设置在所述第一基底的第一通道组和第一通孔组；所述第一通道组包括中央阻挡柱通道2、第一半圆环通道3、第二半圆环通道4、中央通道5、第一通道6和第二通道7；所述第一通孔组包括第一通孔8、第二通孔9、第三通孔10和第四通孔11；

所述中央阻挡柱通道2的位置靠近所述第一基底1的第一侧A，所述中央阻挡柱通道2上排列有多个第一阻挡柱2-3；所述第一半圆环通道的内弧边排列有多个第二阻挡柱3-3，相邻所述第二阻挡柱3-3的间隙小于细胞的直径；所述第二半圆环通道的内弧边排列有多个第三阻挡柱，相邻所述第三阻挡柱的间隙小于细胞的直径；中央阻挡柱通道的第二开口2-2与类圆形凹槽连通，第二阻挡柱3-3与第三阻挡柱分别排列在类圆形凹槽的外周；所述中央阻挡柱通道的第二开口2-2分别与所述第一半圆环通道3和所述第二半圆环通道4连通，所述中央通道5的第一开口分别与所述第一半圆环通道3和所述第二半圆环通道4连通；所述中央阻挡柱通道2与所述中央通道5在同一水平面上对齐设置；所述第一通道6和所述第二通道7分别平行设置在靠近所述第一基底的第二侧B；所述第一半圆环通道的第一开口3-1外周设有所述第一通孔8，所述第二半圆环通道的第一开口4-1外周设有所述第二通孔9，所述第一通道的第二开口6-2外周设有所述第三通孔10，所述第二通道的第二开口7-2外周设有所述第四通孔11；

所述第二功能层12的形状与所述类圆形凹槽的形状相匹配，使得所述第二功能层12内置在所述类圆形凹槽的内部；

所述第三功能层包括薄膜13，以及设置在所述薄膜的第二通道组和第二通孔组，所述第二通道组包括第三半圆环微孔通道14、第四半圆环微孔通道15、第三微孔通道16和第四微孔通道17；所述第三半圆环微孔通道14、所述第四半圆环微孔通道15、所述第三微孔通道16和所述第四微孔通道17分别由多个细胞无法通过的微孔排列组成；所述第三半圆环微孔通道14与所述第一半圆环通道3对齐，所述第四半圆环微孔通道15与所述第二半圆环通道4对齐；所述第三微孔通道16与所述第一通道6对齐，所述第四微孔通道17与所述第二通道7对齐；所述第二通孔组包括第五通孔18、第六通孔19、第七通孔20和第八通孔21，所述第五通孔18、所述第六通孔19、所述第七通孔20和所述第八通孔21依次与所述第一通孔8、所述第二通孔9、所述第三通孔10和所述第四通孔11对齐相通；

所述第四功能层包括第二基底22以及设置在所述第二基底的第三通道组；所述第三通道组包括第五半圆环通道23、第六半圆环通道24、第五通道25和第六通道26；所述第五半圆环通道23与所述第一半圆环通道3对齐，所述第六半圆环通道24与所述第二半圆环通道4对齐，所述第五半圆环通道23与所述第五通道25连通，所述第六半圆环通道24与所述第六通道26连通，所述第五通道25依次与所述第三微孔通道16和所述第一通道6对齐，所述第六通道26依次与所述第四微孔通道17和所述第二通道7对齐；所述第五半圆环通道的开口23-1依次与所述第五通孔18和所述第一通孔8对齐，所述第六半圆环通道的开口24-1依次与所述第六通孔19和所述第二通孔9对齐，所述第五通道的开口25-1依次与所述第七通孔20和所述第三通孔10对齐相通，第六通道的开口26-1依次与所述第八通孔21和所述第四通孔11对齐相通。

具体的，第一功能层的中央阻挡柱通道的开口槽的底部排列有大量的第一阻挡柱。

具体的，第一功能层的类圆形凹槽、中央阻挡柱通道、第一半圆环通道、第二半圆环通道、中央通道、第一通道和第二通道均为不贯穿基底的开口槽结构，所述开口槽结构的开口端为第一功能层的底面；第三功能层的第三半圆环微孔通道、第四半圆环微孔通道、第三微孔通道和第四微孔通道均由大量细胞无法通过的微孔排列组成，第四功能层的第五半圆环通道、第六半圆环通道、第五通道和第六通道均为不贯穿基底的开口槽结构，所述开口槽结构的开口端为第四功能层的顶面。

具体的，以器官芯片从上到下的垂直方向看，第一功能层的底面朝下、第二功能层的仿气管绒毛结构朝上、第三功能层、第四功能层的顶面朝上依次组合固定，形成器官芯片。

具体的，第一功能层的类圆形凹槽的形状与第二功能层的形状匹配，第一功能层的底面朝下，第二功能层的仿气管绒毛结构朝上，使得第二功能层固定在类圆形凹槽中；第一功能层的中央阻挡柱通道、第一半圆环通道、第二半圆环通道、中央通道、第一通道和第二通道的开口端直接与第三功能层接触组合，由于第三功能层的第三半圆环微孔通道、第四半圆环微孔通道、第三微孔通道和第四微孔通道的微孔无法通过细胞，在第一功能层的第一半圆环通道、第二半圆环通道、第一通道和第二通道上接种的细胞不会穿过第三功能层到达第四功能层。

具体的，第四功能层的第五半圆环通道的开口23-1、第六半圆环通道的开口24-1、第五通道的开口25-1和第六通道的开口26-1均为不贯穿基底的开口。

具体的，第一功能层的中央阻挡柱通道的第一开口2-1、第一半圆环通道的第一开口3-1、第一半圆环通道的第二开口3-2、第二半圆环通道的第一开口4-1、第二半圆环通道的第二开口4-2、中央通道5的第二开口、第一通道的第一开口6-1、第一通道的第二开口6-2、第二通道的第一开口7-1、第二通道的第二开口7-2、第一通孔8、第二通孔9、第三通孔10和第四通孔11均为贯穿基底的通孔；中央阻挡柱通道的第二开口2-2、中央通道5的第一开口均为不贯穿基底的开口。

具体的，第一通孔8、第五通孔18和第五半圆环通道的开口23-1层叠对应连通；第二通孔9、第六通孔19和第六半圆环通道的开口24-1层叠对应连通；第三通孔10、第七通孔20和第五通道的开口25-1层叠对应连通；第四通孔11、第八通孔21和第六通道的开口26-1层叠对应连通。

具体的，第一通孔8、第五通孔18和第五半圆环通道的开口23-1的尺寸为可让培养基和气体通过的尺寸；第二通孔9、第六通孔19和第六半圆环通道的开口24-1的尺寸为可让培养基和气体通过的尺寸；第三通孔10、第七通孔20和第五通道的开口25-1的尺寸为可让培养基和气体通过的尺寸；第四通孔11、第八通孔21和第六通道的开口26-1的尺寸为可让培养基和气体通过的尺寸。

具体的，第一半圆环通道的第一开口3-1、第一半圆环通道的第二开口3-2、第二半圆环通道的第一开口4-1、第二半圆环通道的第二开口4-2、中央通道5的第二开口、第一通道的第一开口6-1、第二通道的第一开口7-1、第一通道的第二开口6-2和第二通道的第二开口7-2的尺寸为可让培养基和气体通过的尺寸。

具体的，本申请的器官芯片的第一半圆环通道的第一开口3-1、第二半圆环通道的第一开口4-1、第一通道的第一开口6-1、第二通道的第一开口7-1、第一通孔8、第二通孔9与导入管连接，使得细胞所需的培养基和气体通入导入管导进器官芯片内；本申请的器官芯片的第一半圆环通道的第二开口3-2、第二半圆环通道的第二开口4-2、中央通道5的第二开口、第一通道的第二开口6-2、第二通道的第二开口7-2、第三通孔10和第四通孔11与导出管连接，使得多余的培养基和气体通入导出管导出器官芯片。

另一实施例中，所述第一通道的第一开口和所述第二通道的的第一开口分别设置在所述中央通道的第二开口的两侧。

另一实施例中，所述第一半圆环通道包括半圆环通道和与所述半圆环通道两端连通的短通道；所述第二半圆环通道包括半圆环通道和与所述半圆环通道两端连通的短通道。

具体的，所述第二阻挡柱3-3与所述第三阻挡柱对齐排列在类圆形凹槽的外周，所述类圆形凹槽设有第一开口和第二开口，所述中央阻挡柱通道的第二开口2-2与所述类圆形凹槽的第一开口连通，所述中央通道5的第一开口与所述类圆形凹槽的第一开口连通。

具体的，一方面，中央通道5的第二开口用于导进气管上皮细胞，使得气管上皮细胞接种在第二功能层中，另一方面，本申请的器官芯片使用时，中央通道5的第二开口用于导出流经中央阻挡柱通道2、第一半圆环通道3和第二半圆环通道4的病毒悬液、培养基和气体。

具体的，所述第一半圆环通道的第一开口3-1；所述第二半圆环通道的第一开口4-1设置在所述中央阻挡柱通道的第二开口的两侧；所述中央阻挡柱通道的第一开口2-1用于通入病毒悬液。所述第一半圆环通道的第一开口3-1和所述第二半圆环通道的第一开口4-1用于通入培养基和细胞所需气体，维持接种在所述第一半圆环通道3和所述第二半圆环通道4的肺泡上皮细胞生存。所述第一半圆环通道的第二开口3-2，所述第二半圆环通道的第二开口4-2用于导出流经中央阻挡柱通道2、第一半圆环通道3和第二半圆环通道4的病毒悬液、培养基和气体。

具体的，所述第一通道的第一开口6-1和所述第二通道的第一开口7-1用于通入培养基和细胞所需气体，维持接种在所述第一通道6和所述第二通道7的器官上皮细胞生存。所述第一通道的第二开口6-2和所述第二通道的第二开口7-2用于导出流经所述第一通道6和所述第二通道7的培养基和气体。

具体的，第一通孔8和第二通孔9用于通入培养基和细胞所需气体，培养基和气体分别通过第五通孔18和第六通孔19通入第五半圆环通道23和第六半圆环通道24，维持接种在所述第五半圆环通道23和所述第六半圆环通道24的微血管内皮细胞生存。

具体的，第一功能层的病毒从第一半圆环通道3和第二半圆环通道4通过第三半圆环微孔通道14和第四半圆环微孔通道15传递至第五半圆环通道23和第六半圆环通道24，进而该病毒通过第五通道25和第六通道26传递至第五通道的开口25-1和第六通道的开口26-1，第五通道的开口25-1和第六通道的开口26-1用于将该病毒分别通过第七通孔20和第八通孔21传递至第一功能层的第三通孔10和第四通孔11。

具体的，所述第五半圆环通道23依次与所述第三半圆环微孔通道14和所述第一半圆环通道3对齐，所述第六半圆环通道24依次与所述所述第四半圆环微孔通道15和所述第二半圆环通道4对齐。

具体的，所述第三半圆环微孔通道14、所述第四半圆环微孔通道15、所述第三微孔通道16和所述第四微孔通道17分别由大量微孔组成，这些微孔的孔径小于细胞的直径，细胞不能通过微孔，但培养基和细胞分泌的小分子物质等能通过这些微孔进行物质交换。

另一实施例中，所述第一通道包括长通道和与所述长通道两端连通的短通道；所述第二通道包括长通道和与所述长通道两端连通的短通道。

另一实施例中，所述第二功能层包括圆形基底和仿气管绒毛结构，所述仿气管绒毛结构固定设置在所述圆形基底的表面。

另一实施例中，所述第一基底和所述第二基底的材质选自聚二甲基硅氧烷；所述第二功能层的材质选自水凝胶。

另一实施例中，所述第三功能层的厚度为10～100μm；所述微孔的直径为5～20μm；相邻所述微孔的间距为30μm；优选的，所述第三功能层的厚度为30μm；所述微孔的直径为10μm；相邻所述微孔的间距为30μm。

另一实施例中，所述第一阻挡柱交错排列，所述第一阻挡柱的直径为100μm，相邻所述第一阻挡柱的间距为150～600μm；优选的，所述第一阻挡柱交错排列，所述第一阻挡柱的直径为100μm，相邻所述第一阻挡柱的间距为300μm。

具体的，所述第二阻挡柱和所述第三阻挡柱的直径为10～50μm，相邻所述第二阻挡柱的间距为5～20μm，相邻所述第三阻挡柱的间距为5～20μm。

本申请第二方面公开了所述器官芯片在模拟病毒通过空气进入人体器官中的应用。

另一实施例中，所述应用包括：

所述第五半圆环通道和所述第六半圆环通道接种有微血管内皮细胞；

所述第一半圆环通道和所述第二半圆环通道接种有肺泡上皮细胞；

第二功能层上接种有气管上皮细胞；

所述第一通道和所述第二通道分别接种不同器官的上皮细胞；

所述第二功能层的表面接种气管上皮细胞；

对所述第一半圆环通道、所述第二半圆环通道、所述第一通道、所述第二通道、所述第五半圆环通道和所述第六半圆环通道分别持续性通入相同流速的培养基。

具体的，病毒悬液通过所述中央阻挡柱通道的第二开口2-1通入第一功能层中，第一通孔8、第二通孔9、第一半圆环通道的第一开口3-1、第二半圆环通道的第一开口4-1、第一通道的第一开口6-1和第二通道的第一开口7-1通入细胞所需的培养基和气体；第一半圆环通道的第二开口3-2，第二半圆环通道的第二开口4-2、中央通道5的第二开口、第一通道的第二开口6-2、第二通道的第二开口7-2、第三通孔10和第四通孔11与导管连接，导出多余的培养基和流通的气体。

本申请提出了一种基于器官芯片，可用于模拟病毒通过空气进入人体内后在人体内传播和作用模型的建立方法，通过结合模拟体内循环应变(即蠕动样运动)等模拟正常或患病器官水平的结构和功能，可以更好地模拟病毒进入人体后在人体内的传播及作用。在中央阻挡柱通道中引入第一阻挡柱，在第二功能层中设有仿气管绒毛结构，第一阻挡柱可模拟人鼻腔内的鼻毛结构，仿气管绒毛结构可模拟人气管内的绒毛，这样可以更好的模拟出病毒进入人体内时的状况；巧妙的设置第一功能层、第三功能层和第四功能层的结构和层叠方式，可将第一功能层和第四功能层上的细胞分隔开来，使得细胞不会相互混合，又能使得第一功能层和第四功能层对应的通道进行物质交换，可以模拟人的肺泡结构以及人体内的血管，可以充分模拟病毒经过鼻腔和气管到达肺部后经过肺泡到达微血管再到达全身其他器官的过程。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例提供的器官芯片的第一功能层的结构示意图；

图2为本申请实施例提供的器官芯片的第二功能层的结构示意图；

图3为本申请实施例提供的器官芯片的第三功能层的结构示意图；

图4为本申请实施例提供的器官芯片的第四功能层的结构示意图；

图5为本申请实施例提供的器官芯片的爆炸图；

图6为本申请实施例提供的器官芯片的立体图；

图7为本申请实施例提供的器官芯片的透视俯视图；

图8为本申请实施例提供的器官芯片通入流体后流体速度的仿真结果；

图9为本申请实施例提供的器官芯片应用后病毒扩散轨迹的仿真结果。

本申请的器官芯片的制备方法，包括如下步骤：

设计芯片的3维图形；

按照图1～图7的结构，通过光刻技术得到第一功能层、第三功能层和第四功能层芯片模具，通过3D打印技术获得第二功能层芯片模具；

将模具分别硅烷化、照紫外处理；

配制聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚体混合物，浇注在第一功能层、第三功能层和第四功能层芯片模具上；

将PDMS从模具上剥离，得到芯片功能层；

将未凝固的水凝胶浇筑在第二功能层芯片模具上，凝固后剥离；

利用打孔器在各层芯片依次对应层叠后，通道入口和出口处打孔；

将各层芯片上涂上一层PDMS后在显微镜下对准并贴合，放置在热板上加热；

将得到的整块PDMS沿设计的边界线切割为芯片。

本申请的器官芯片进行模拟病毒通过空气进入人体内后在人体内传播和作用模型的建立，过程如下：

将人正常肺泡上皮细胞、微血管内皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和肝上皮细胞常规培养；

将培养的人正常肺泡上皮细胞、微血管内皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和肝上皮细胞配制成适宜浓度的细胞悬液；

芯片的预处理；

将一定浓度的微血管内皮细胞悬液通入芯片的第四功能层的第五半圆环通道和第六半圆环通道中，将芯片倒置，待细胞贴壁；

将一定浓度的人正常肺泡上皮细胞悬液通入芯片第一功能层的第一半圆环通道和第二半圆环通道中，孵育培养；

将一定浓度的气管上皮细胞通入芯片的第二功能层的表面，孵育培养；

将一定浓度的肾上皮细胞和肝上皮细胞分别通入芯片的第一功能层的第一通道和所述第二通道中，孵育培养；

给芯片第一功能层的第一通道和第二通道，及其下方第四功能层的第五通道和第六通道持续性通入相同流速的培养基。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请实施例一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请实施例中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请实施例保护的范围。

在本申请实施例的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请实施例的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请实施例的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请实施例中的具体含义。

应理解，本申请应用于体外模拟病毒进入人体后在人体内的传播的情况，请参阅图1～图5，图1为本申请实施例提供的器官芯片的第一功能层的结构示意图，图2为本申请实施例提供的器官芯片的第二功能层的结构示意图，图3为本申请实施例提供的器官芯片的第三功能层的结构示意图，图4为本申请实施例提供的器官芯片的第四功能层的结构示意图，图5为本申请实施例提供的器官芯片的爆炸图，图6为本申请实施例提供的器官芯片的立体图，图7为本申请实施例提供的器官芯片的透视俯视图。

如图1～图7所示，图1中包括一种器官芯片，其特征在于，包括：第一功能层、第二功能层、第三功能层和第四功能层；所述第一功能层、所述第二功能层、所述第三功能层和所述第四功能层由上到下依次组合；

第一功能层包括第一基底1、类圆形凹槽、以及设置在第一基底的第一通道组和第一通孔组；第一通道组包括中央阻挡柱通道2、第一半圆环通道3、第二半圆环通道4、中央通道5、第一通道6和第二通道7；第一通孔组包括第一通孔8、第二通孔9、第三通孔10和第四通孔11；

中央阻挡柱通道2的位置靠近第一基底1的第一侧A，中央阻挡柱通道2上排列有多个第一阻挡柱2-3；第一半圆环通道的内弧边排列有多个第二阻挡柱3-3，相邻第二阻挡柱3-3的间隙小于细胞的直径；第二半圆环通道的内弧边排列有多个第三阻挡柱，相邻第三阻挡柱的间隙小于细胞的直径；中央阻挡柱通道的第二开口2-2与类圆形凹槽连通，第二阻挡柱3-3与第三阻挡柱分别排列在类圆形凹槽的外周；中央阻挡柱通道的第二开口2-2分别与第一半圆环通道3和第二半圆环通道4连通，中央通道5的第一开口分别与第一半圆环通道3和第二半圆环通道4连通；中央阻挡柱通道2与中央通道5在同一水平面上对齐设置；第一通道6和第二通道7分别平行设置在靠近第一基底的第二侧B；第一半圆环通道的第一开口3-1外周设有第一通孔8，第二半圆环通道的第一开口4-1外周设有第二通孔9，第一通道的第二开口6-2外周设有第三通孔10，第二通道的第二开口7-2外周设有第四通孔11；

第二功能层12的形状与类圆形凹槽的形状相匹配，使得第二功能层12内置在类圆形凹槽的内部；第一功能层的底面朝下，第二功能层的仿气管绒毛结构朝上，使得第二功能层固定在类圆形凹槽中；

第三功能层包括薄膜13，以及设置在薄膜的第二通道组和第二通孔组，第二通道组包括第三半圆环微孔通道14、第四半圆环微孔通道15、第三微孔通道16和第四微孔通道17，第三半圆环微孔通道14、第四半圆环微孔通道15、第三微孔通道16和第四微孔通道17分别由大量细胞无法通过的微孔排列组成；第三半圆环微孔通道14与第一半圆环通道3对齐，第四半圆环微孔通道15与第二半圆4环通道对齐；第三微孔通道16与第一通道6对齐，第四微孔通道17与第二通道7对齐；第二通孔组包括第五通孔18、第六通孔19、第七通孔20和第八通孔21，第五通孔18、第六通孔19、第七通孔20和第八通孔21依次与第一通孔8、第二通孔9、第三通孔10和第四通孔11对齐相通；

第四功能层包括第二基底22以及设置在第二基底的第三通道组；第三通道组包括第五半圆环通道23、第六半圆环通道24、第五通道25和第六通道26；第五半圆环通道23与第一半圆环通道3对齐，第六半圆环通道24与第二半圆环通道4对齐，第五半圆环通道23与第五通道25连通，第六半圆环通道24与第六通道26连通，第五通道25依次与第三微孔通道16和第一通道6对齐，第六通道26依次与第四微孔通道17和第二通道7对齐；第五半圆环通道的开口23-1依次与第五通孔18和第一通孔8对齐相通，第六半圆环通道的开口24-1依次与第六通孔19和第二通孔9对齐相通，第五通道的开口25-1依次与第七通孔20和第三通孔10对齐相通，第六通道的开口26-1依次与第八通孔21和第四通孔11对齐相通。

具体的，第一阻挡柱2-3用于模拟鼻毛，病毒碰到会粘附在上面；第一半圆环通道的第二阻挡柱3-3，第二半圆环通道的第三阻挡柱用于将接种在第一半圆环通道3和第二半圆环通道4的肺泡上皮细胞和接种在第二功能层的气管上皮细胞阻挡，避免肺泡上皮细胞和气管上皮细胞混合。

具体的，上述对齐为垂直层叠后位置重叠，即第一功能层的底面朝下、第二功能层的仿气管绒毛结构朝上、第三功能层、第四功能层的顶面朝上依次以垂直方向对齐层叠后，第一通孔8依次与第五通孔18、第五半圆环通道的开口23-1相通，第二通孔9依次与第六通孔19、第六半圆环通道的开口24-1相通；第三通孔10依次与第七通孔20、第五通道的开口25-1相通；第四通孔11依次与第八通孔21、第六通道的开口26-1相通。

具体的，因为第三半圆环微孔通道14、第四半圆环微孔通道15、第三微孔通道16和第四微孔通道17分别由多个细胞无法通过的微孔排列组成，使得第一功能层的开口槽结构与第四功能层的开口槽结构对应的通道相通连接，第一半圆环通道3依次与第三半圆环通道14和第五半圆环通道23对齐相通；第二半圆环通道4依次与第四半圆环通道15和第六半圆环通道24对齐相通；第一通道6依次与第三通道16和第五通道25对齐相通，第二通道7依次与第四通道17和第六通道26对齐相通。第三半圆环微孔通道14、第四半圆环微孔通道15、第三微孔通道16和第四微孔通道17的微孔可让有机物、无机物和液体通过，但是无法让细胞通过；可以让第一功能层和第四功能层对应位置进行物质交换，同时也为第五半圆环通道和第六半圆环通道中的微血管内皮细胞提供附着点，使得第一功能层和第四功能层对应位置的细胞不会相互混合。

具体的，第一功能层的中央阻挡柱通道2、中央通道5、第一半圆环通道3、第二半圆环通道4、第一通道6和第二通道7均为上下不贯通结构。第一功能层的底面朝下设置和第四功能层的顶面朝上设置组合后，第一半圆环通道3通过第三半圆环通道14的微孔与第五半圆环通道23相通，第二半圆环通道4通过第四半圆环通道15的微孔与第六半圆环通道24，使得第一半圆环通道3和第二半圆环通道14的肺泡上皮细胞与第五半圆环通道23和第六半圆环通道24的微血管内皮细胞不发生混合但可进行物质交换；第一通道6通过第三通道16的微孔与第五通道25相通，第二通道7通过第四通道17的微孔与第六通道26相通，使得第一通道6和第二通道7的不同的器官上皮细胞(如肾上皮细胞和肝上皮细胞等)与第五通道25和第六通道26可进行物质交换。

本申请的器官芯片实际应用包括：

步骤11)将人正常肺泡上皮细胞、微血管内皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和肝上皮细胞放置在37.0℃、5％CO²的培养箱中常规培养；

步骤12)将培养瓶中的贴壁细胞用0.25％胰蛋白酶消化，加入新鲜的细胞培养液，充分吹打混匀后，加入新鲜培养液稀释成适宜浓度的细胞悬液；

步骤13)将器官芯片通入75％酒精灭菌15分钟后放入烘箱中60℃烘干，再将器官芯片放置在紫外下照射30分钟；

步骤14)器官芯片预处理完成后，在器官芯片(中央阻挡柱通道的第一开口2-1、第一半圆环通道的第一开口3-1、第二半圆环通道的第一开口4-1、第一通道的第一开口6-1、第二通道的第一开口7-1、第一通孔8和第二通孔9)中缓慢注入0.04％(w/v)的鼠尾I型胶原溶液，无菌条件下37℃孵育2小时；

步骤15)将400W/mL的微血管内皮细胞悬液通入器官芯片的第一通孔8和第二通孔9以通入第四功能层的第五半圆环通道23和第六半圆环通道24中，将该芯片倒置，放入培养箱中37℃，5％CO₂的环境下培养6小时，待细胞贴壁；

步骤16)将400W/mL的人正常肺泡上皮细胞悬液通入器官芯片的第一半圆环通道的第一开口3-1和第二半圆环通道的第一开口4-1以通入第一功能层的第一半圆环通道3和第二半圆环通道4中，铺满通道，将400W/mL的气管上皮细胞悬液通过注射器注入该芯片的中央通道5的第二开口以通入第二功能层中，将400W/mL的肾上皮细胞和肝上皮细胞分别用注射器注入该芯片的第一通道的第一开口6-1和第二通道的第一开口7-1以通入第一功能层的第一通道6和第二通道7中；

步骤17)将芯片放入培养箱中在37℃，5％CO₂的环境下培养6小时，等待细胞贴壁；

步骤18)细胞贴壁后，将该器官芯片转移至活细胞工作站载物台上，使细胞在37.0℃、5％CO₂中孵育，以0.6μL/min的速率在第一功能层和第四功能层的第一半圆环通道的第一开口3-1、第二半圆环通道的第一开口4-1、第一通孔8和第二通孔9以在第一通道6和第二通道7、第五通道25和第六通道26中持续通入新鲜细胞培养液。

将病毒悬液从中央阻挡柱通道的第一开口2-1通入上述器官芯片，观察病毒情况，结果如图8和图9所示。当病毒进入后中央阻挡柱通道2、第二功能层与第一半圆环通道3和第二半圆环通道4后，病毒颗粒的流速与轨迹如图8和图9所示。图中的病毒粒子轨迹有部分被中央阻挡柱通道2的第一阻挡柱2-3阻拦，但部分病毒也会扩散到第一半圆环通道3和第二半圆环通道4中，说明本申请的器官芯片可以模拟病毒进入人体内后的结果。

本申请设计了一种器官芯片，用于模拟病毒通过空气进入人体内后在人体内传播和作用模型的建立方法，设置在第一阻挡柱、第二阻挡柱与第三阻挡柱，以及第二功能层的仿气管绒毛结构共同模拟人鼻腔内的鼻毛结构，仿气管绒毛结构是用来模拟人气管内的绒毛，这样可以更好的模拟出病毒进入人体内时的状况；第一半圆环通道和第二半圆环通道上的肺泡上皮细胞，与第五半圆环通道和第六半圆环通道上的微血管内皮细胞可以模拟人的肺泡结构；第五半圆环通道与第五通道连通，第六半圆环通道与第六通道连通后，可以模拟人体内的血管，可以充分模拟病毒经过鼻腔和气管到达肺部后经过肺泡到达微血管再到达全身其他器官的过程。

具体的，在第一功能层的中央阻挡柱通道2上设有第一阻挡柱2-3，第一阻挡柱2-3为直径为100μm，间距为300μm的交错排列的柱子，用来模拟人鼻腔内的绒毛；第一通道6和第二通道7中可在里面种植不同的细胞来模拟人体内的器官。

第二功能层12的仿气管绒毛结构可由水凝胶制成，可在上面种植人气管上皮细胞，用来模拟人气管内的绒毛。

第三功能层为厚度为30μm的薄层。细胞无法通过的微孔排列形成第三半圆环通道14和第三通道16，细胞无法通过的微孔排列形成第四半圆环通道15与第四通道17，该微孔为直径为10μm，间距为30μm的贯穿小孔，可以让第一功能层和第四功能层对应位置进行物质交换，同时也为第五半圆环通道23和第六半圆环通道24中的微血管内皮细胞提供附着点。

第四功能层的第五通道25和第六通道26，可模拟血管的存在，病毒悬液从中央阻挡柱通道的第一开口2-1通入第一功能层，病毒通过中央阻挡柱通道2，从圆环的第一开口进入第二功能层，同时也进入第一半圆环通道3和第二半圆环通道4，病毒通过第三功能层的第三半圆环微孔通道14和第四半圆环微孔通道15进入第四功能层的第五半圆环通道23和第六半圆环通道24，然后该病毒进入第五通道25和第六通道26，再通过第三微孔通道16和第四微孔通道17回到第一功能层的第一通道6和第二通道7。即本申请器官芯片将第一半圆环通道3和第二半圆环通道4中由第一功能层交换下来的物质运输到第四功能层的第五通道25和第六通道26，第五通道25和第六通道26和第一通道6和第二通道7进行物质交换，模拟病毒进入经过呼吸道进入人体内后由鼻腔经过气管到肺部再经过血管到达其他器官的过程。

具体的，本申请的器官芯片可用现有常规的手段制得，具体制备方法包括：

步骤1)用solidworks 2018分别设计本申请的器官芯片的第一功能层、第二功能层、第三功能层和第四功能层的三维立体图形；

步骤2)通过光刻技术得到第一功能层、第三功能层和第四功能层的模具，通过3D打印技术得到第二功能层的模具；

步骤3)先将各层模具紫外照射30分钟后将各层模具分别放入塑料真空干燥器中，把塑料真空干燥器放入通风橱中，然后将装有10μl的甲基三氯硅烷的移液枪枪头打入干燥器中，迅速盖上盖子抽至塑料真空干燥器上仪表显示为0.8kg/cm²时停止，静置12小时。

步骤4)以预聚物：固化剂为10：1的比例配制聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚体混合物，浇注在第一功能层、第三功能层和第四功能层的模具上；

步骤5)将浇注了PDMS的模具放置在塑料真空干燥器中，连接真空泵抽真空20分钟，除去气泡；

步骤6)将第一功能层、第三功能层和第四功能层的结构对应的预聚体及模具水平放置后在烘箱中60℃固化2小时，然后将PDMS从模具上剥离，得到芯片的第一功能层、第三功能层和第四功能层；

步骤7)将配置好的10％(W/V)的鼠尾胶原溶液浇筑在第二功能层的模具上，待溶液凝固后取下，得到芯片的第二功能层；

步骤8)利用1.6mm和0.8mm口径打孔器在芯片对应的开口处打孔；

步骤9)将器官芯片表面用除尘纸清理干净，然后在载玻片上滴上少量PDMS，用滚轮碾压均匀，然后再用滚轮均匀涂在芯片表面，在显微镜下将各层功能层以及载玻片贴合，用手指轻轻按压后放置在热板上80℃加热固化；

步骤10)加热完成后，将得到的整块PDMS沿设计的边界线切割为4cm×2.0cm大小的器官芯片。

本申请的说明书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

应当理解，在本申请中，“至少一个(项)”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：只存在A，只存在B以及同时存在A和B三种情况，其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，a，b或c中的至少一项(个)，可以表示：a，b，c，“a和b”，“a和c”，“b和c”，或“a和b和c”，其中a，b，c可以是单个，也可以是多个。

以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种器官芯片，其特征在于，包括：第一功能层、第二功能层、第三功能层和第四功能层；所述第一功能层、所述第二功能层、所述第三功能层和所述第四功能层由上到下依次组合；

所述第一功能层包括第一基底、类圆形凹槽、以及设置在所述第一基底的第一通道组和第一通孔组；所述第一通道组包括中央阻挡柱通道、第一半圆环通道、第二半圆环通道、中央通道、第一通道和第二通道；所述第一通孔组包括第一通孔、第二通孔、第三通孔和第四通孔；

所述中央阻挡柱通道的位置靠近所述第一基底的第一侧，所述中央阻挡柱通道上排列有多个第一阻挡柱；所述第一半圆环通道的内弧边排列有多个第二阻挡柱；所述第二半圆环通道的内弧边排列有多个第三阻挡柱，相邻所述第二阻挡柱的间隙小于细胞的直径，相邻所述第三阻挡柱的间隙小于细胞的直径；所述中央阻挡柱通道的第二开口与所述类圆形凹槽连通，所述第二阻挡柱与所述第三阻挡柱分别排列在所述类圆形凹槽的外周；所述中央阻挡柱通道的第二开口分别与所述第一半圆环通道和所述第二半圆环通道的一端连通，所述中央通道的第一开口分别与所述第一半圆环通道和所述第二半圆环通道的另一端连通；所述中央阻挡柱通道与所述中央通道在同一水平面上对齐设置；所述第一通道和所述第二通道分别平行设置在靠近所述第一基底的第二侧；所述第一半圆环通道的第一开口外周设有所述第一通孔，所述第二半圆环通道的第一开口外周设有所述第二通孔，所述第一通道的第二开口外周设有所述第三通孔，所述第二通道的第二开口外周设有所述第四通孔；

所述第二功能层的形状与所述类圆形凹槽的形状相匹配，使得所述第二功能层内置在所述类圆形凹槽的内部；

所述第三功能层包括薄膜，以及设置在所述薄膜的第二通道组和第二通孔组，所述第二通道组包括第三半圆环微孔通道、第四半圆环微孔通道、第三微孔通道和第四微孔通道；所述第三半圆环微孔通道、所述第四半圆环微孔通道、所述第三微孔通道和所述第四微孔通道分别由多个细胞无法通过的微孔排列组成；所述第三半圆环微孔通道与所述第一半圆环通道对齐，所述第四半圆环微孔通道与所述第二半圆环通道对齐；所述第三微孔通道与所述第一通道对齐，所述第四微孔通道与所述第二通道对齐；所述第二通孔组包括第五通孔、第六通孔、第七通孔和第八通孔，所述第五通孔、所述第六通孔、所述第七通孔和所述第八通孔依次与所述第一通孔、所述第二通孔、所述第三通孔和所述第四通孔对齐相通；

所述第四功能层包括第二基底以及设置在所述第二基底的第三通道组；所述第三通道组包括第五半圆环通道、第六半圆环通道、第五通道和第六通道；所述第五半圆环通道与所述第一半圆环通道对齐，所述第六半圆环通道与所述第二半圆环通道对齐，所述第五半圆环通道与所述第五通道连通，所述第六半圆环通道与所述第六通道连通，所述第五通道依次与所述第三微孔通道和所述第一通道对齐，所述第六通道依次与所述第四微孔通道和所述第二通道对齐；所述第五半圆环通道的开口依次与所述第五通孔和所述第一通孔对齐，所述第六半圆环通道的开口依次与所述第六通孔和所述第二通孔对齐，所述第五通道的开口依次与所述第七通孔和所述第三通孔对齐相通，第六通道的开口依次与所述第八通孔和所述第四通孔对齐相通。

2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第一通道的第一开口和所述第二通道的第一开口分别设置在所述中央通道的第二开口的两侧。

3.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第一半圆环通道包括半圆环通道和与所述半圆环通道两端连通的短通道；所述第二半圆环通道包括半圆环通道和与所述半圆环通道两端连通的短通道。

4.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第一通道包括长通道和与所述长通道两端连通的短通道；所述第二通道包括长通道和与所述长通道两端连通的短通道。

5.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第二功能层包括圆形基底和仿气管绒毛结构，所述仿气管绒毛结构固定设置在所述圆形基底的表面。

6.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第一基底和所述第二基底的材质选自聚二甲基硅氧烷；所述第二功能层的材质选自水凝胶。

7.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第三功能层的厚度为10～100μm；所述微孔的直径为5～20μm；相邻所述微孔的间距为30μm。

8.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于，所述第一阻挡柱交错排列，所述第一阻挡柱的直径为100μm，相邻所述第一阻挡柱的间距为150～600μm。

9.权利要求1～8任意一项所述的器官芯片在模拟病毒通过空气进入人体器官中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

所述第五半圆环通道和所述第六半圆环通道接种有微血管内皮细胞；

所述第一半圆环通道和所述第二半圆环通道接种有肺泡上皮细胞；

所述第二功能层接种有气管上皮细胞；

所述第一通道和所述第二通道分别接种不同器官的上皮细胞；

所述第二功能层的表面接种气管上皮细胞；

对所述第一半圆环通道、所述第二半圆环通道、所述第一通道、所述第二通道、所述第五半圆环通道和所述第六半圆环通道分别持续性通入相同流速的培养基。

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